田紅娟，張任樂，喬艷紅，張登霞，劉蓓,3

0 引言

白血病是造血干細胞在不同分化階段由于分化障礙、凋亡受阻及克隆增生引起的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，目前白血病的治療方法有化療、放射治療、免疫治療、靶向治療、干細胞移植等。白血病治療期望實現(xiàn)個體化，質譜流式細胞術（cytometng by time-of-flight,CyTOF）將流式細胞分析方法與質譜檢測方法相結合，可同時測量單細胞中幾十種甚至上百種特征標志物，既有熒光流式細胞術高速分析的特點，又有質譜檢測的高精確度與高識別能力[1-2]，可實現(xiàn)在單細胞水平分析異質白血病細胞的免疫表型及復雜的信號通路變化[3]，研究高度異質性白血病細胞群的生物學[4-5]，分析血液腫瘤與免疫系統(tǒng)的相互作用[6-7]，有助于深入了解白血病發(fā)生、發(fā)展及耐藥機制，發(fā)現(xiàn)更多白血病潛在治療靶點[8-9]，為白血病治療提供新的啟示，并監(jiān)測白血病患者靶向治療和細胞毒性治療反應[10]。CyTOF作為一種新技術，有助于指導白血病個體化治療，體現(xiàn)了精準醫(yī)學的新發(fā)展。

1 CyTOF工作原理

CyTOF是一種新的高維多參數(shù)單細胞分析技術，其測量參數(shù)多、單細胞識別準確率高，克服了傳統(tǒng)熒光流式細胞術光譜重疊的局限性[11-13]。Cy-TOF基本原理是用金屬標簽抗體標記的細胞進入質譜流式細胞儀后，用流式細胞技術分離成單個細胞，并逐個通過電感耦合等離子體質譜（inductively coupled plasma mass spectrometry,ICP-MS）檢測裝置，然后對每個細胞中各種金屬標簽進行檢測，形成原子質量譜，再將測量的數(shù)據(jù)轉換為細胞表面或內(nèi)部的信號分子數(shù)據(jù)，通過專業(yè)的數(shù)據(jù)分析軟件對獲得的數(shù)據(jù)進行降維分析，從而達到對細胞表型和信號網(wǎng)絡的精細觀測的目的[2,14-15]，見圖1（自繪）。

2 CyTOF的技術特點及優(yōu)勢

與流式細胞術（flow cytometry,FCM）相比，CyTOF主要有兩點不同：第一，抗體標記系統(tǒng)不同。前者主要使用各種熒光素作為抗體標志物，后者則使用各種金屬元素作為標志物；第二，檢測系統(tǒng)不同。前者檢測系統(tǒng)為激光器和光電倍增管，而后者檢測系統(tǒng)為ICP-MS技術。因此CyTOF具有如下優(yōu)勢：（1）全新概念的金屬標志物，理想的標志物需要滿足4個條件：無放射性、生物樣品中含量低、易于標記和檢測、種類多。金屬標志物與細胞的非特異性結合極弱，在細胞中的含量極低，背景極低，不會影響細胞正常的生理功能，目前已發(fā)現(xiàn)的金屬元素種類有一百多種，用于抗體標記的金屬元素有30多種，所以金屬元素是細胞標志物的極佳選擇。（2）測量參數(shù)多，上百個獨立的檢測通道。質譜流式細胞儀中的ICP-MS裝置具有非常寬的原子量檢測范圍（88～210 Da），可以同時檢測上百個不同的參數(shù)，使通道數(shù)量增加到上百個。（3）質譜檢測的分辨率高，通道間無干擾，無需補償計算。（4）高靈敏度和高穩(wěn)定性。熒光流式細胞儀通道間靈敏度相差很大，CyTOF流式細胞儀各通道間靈敏度相差較小，且穩(wěn)定性高，不同時間對同一樣品檢測結果變異系數(shù)（coefficient of variation,CV）值<3%，結果具有很好的重復性。（5）多元化的數(shù)據(jù)分析方法，實現(xiàn)對樣品的深入分析，除了傳統(tǒng)的流式分析方法外，研究者可以根據(jù)各自實驗目的選擇不同的數(shù)據(jù)分析方法，常用的分析方法有：SPADE（spanning-tree progression analysis of density normalized events）、主成分分析（principal component analysis,PCA）、viSNE（visualization for high-dimensional single-cell data based on the t-Distributed Stochastic Neighbor Embedding (t-SNE)algorithm）及Gemstone等[2,16]。

3 CyTOF在白血病治療中的應用

隨著免疫學研究的發(fā)展，白血病個體化靶向治療已成為新的發(fā)展方向。CyTOF是一種新型單細胞分析技術，可以全面分析細胞表型和信號網(wǎng)絡。近年來，CyTOF在白血病治療研究中的應用日益廣泛，為白血病精細化個體治療提供指導，CyTOF在白血病治療中的研究應用及特點，見表1。

3.1 藥物作用機制的研究

圖1 CyTOF工作原理Figure 1 Working principle diagram of cytometry by time-offlight

表1 CyTOF在白血病中治療中的應用及特點Table 1 Application and characteristics of CyTOF in treatment of leukemia

質譜流式細胞儀的ICP-MS技術具有檢測背景低、干擾少、靈敏度高、動態(tài)范圍寬等優(yōu)點，可精確測定單細胞內(nèi)元素含量，用于藥物作用機制的研究。Zhou等[17]用CyTOF研究砷劑治療白血病的機制，砷劑可用于治療多種類型的白血病，對急性早幼粒細胞白血?。╝cute promyelocytic leukemia,APL）療效顯著，可達到完全緩解，目前三氧化二砷（As2O3）治療APL的機制主要有誘導細胞分化、促進細胞凋亡、抑制細胞增殖、誘導細胞自噬、抑制血管生成[18-20]，鑒于砷劑治療白血病取得了很好的效果，為進一步探索砷劑治療白血病的機制及影響藥物作用的因素，研究者用CyTOF測定含砷藥物在單個白血病細胞不同細胞周期中的攝取量及細胞毒性作用，通過對比兩種含砷藥物（ATO和ZIO-101）在白血病細胞中跨細胞周期的攝取及細胞毒性作用，在單細胞水平上證實了含砷藥物的細胞周期依賴性攝取和細胞毒性作用，為進一步研究細胞周期時相變化對抗癌藥物的影響提供了理論依據(jù)。

CyTOF可監(jiān)測藥物治療期間信號通路的變化，可從藥物影響信號通路變化方面研究抗白血病藥物的作用機制。阿帕替尼是一種新型血管內(nèi)皮生長因子-2受體（vascular endothelial growth factor receptor 2,VEGFR-2）酪氨酸激酶抑制劑，通過抑制VEGFR-2磷酸化，下調其下游胞外信號通路調節(jié)激酶的磷酸化水平，繼而抑制腫瘤血管生成達到抗腫瘤的目的[21]，為了解阿帕替尼抗白血病細胞毒作用的潛在機制，Deng等[22]用CyTOF在單細胞水平測量細胞內(nèi)信號通路，結果顯示，VEGFR-2下游多條信號通路受到阿帕替尼的抑制，包括PI3K（AKT，S6，4E-BP1）、MAPK（p38,MAPKAPK2,ERK1/2）和STAT3通路，表明阿帕替尼通過抑制VEGFR-2磷酸化及其下游信號通路誘導白血病細胞死亡，支持阿帕替尼在白血病治療中的潛在作用。Bandyopadhyay等[23]聯(lián)合使用伊馬替尼（imatinib,IM）和阿伐麥布（?；o酶A-膽固醇酰基轉移酶1（ACAT-1）抑制劑）治療IM耐藥的慢性髓系白血?。╟hronic myelogenous leukemia,CML）患者，發(fā)現(xiàn)二者對IM耐藥的CML細胞在抑制細胞增殖方面有協(xié)同效應，在正常細胞或IM敏感CML細胞中無協(xié)同效應。用CyTOF分析其機制，發(fā)現(xiàn)這種協(xié)同作用部分是由于阿伐麥布下調了MAPK通路，后者在IM耐藥的CML 中被激活，從而使CML細胞對IM治療敏感。通過對藥物作用機制及其作用靶點分析，可了解到在白血病治療中，可能需要靶向白血病增殖的多種驅動因子的治療才能獲得更深的治療應答。

3.2 識別白血病治療的潛在靶點

CyTOF作為一種新型的單細胞分析工具，可以分析免疫系統(tǒng)的復雜性，描述異質微環(huán)境中復雜的細胞表型群體，表征信號通路，可用于潛在治療靶點的研究。Jiang等[24]利用CyTOF等技術研究了Wnt/β-catenin和FLT3聯(lián)合抑制在FLT3突變型AML中的抗白血病活性，發(fā)現(xiàn)阻斷Wnt/β-catenin信號轉導對AML干細胞有很強的抑制作用，并與FLT3抑制有協(xié)同作用，這為臨床治療FLT3突變的AML提供了理論依據(jù) 。Edwards等[25]研究發(fā)現(xiàn)集落刺激因子1受體（CSF1R）不是在大多數(shù)白血病細胞上表達，而是在支持細胞亞群中表達，用CyTOF分析發(fā)現(xiàn)表達CSF1R的細胞通過分泌肝細胞生長因子（hepatocyte growth factor,HGF）等細胞因子促進白血病細胞生長，從而將CSF1R確定為AML的一種新的治療靶點，并提供了一種旁分泌細胞因子/生長因子信號通路的機制，CSF1R抑制劑通過阻斷支持細胞的旁分泌信號，在AML中表現(xiàn)出抗腫瘤活性。Carter等[26]利用CyTOF等技術的研究表明，黏著斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）調節(jié)白血病-基質相互作用，并支持白血病細胞存活，抑制FAK可降低間質細胞介導的 AML細胞遷移和活性，并延長生存期，因此FAK是AML的一個潛在治療靶點。

Wierz等[11]用CyTOF分析慢性淋巴細胞白血病（chronic lymphocytic leukemia,CLL）腫瘤微環(huán)境表型復雜性，表明在CLL微環(huán)境中，大多數(shù)免疫細胞群上調PD1（programmed cell death protein 1）和LAG3（lymphocyte-activation gene 3），雙重PD1/LAG3阻斷有效地限制了CLL的發(fā)展，并恢復了免疫微環(huán)境活性，證明雙抗PD1/LAG3治療是一種可能對CLL患者有益的潛在組合，為白血病的治療提供了潛在靶點。Sarno等[27]用CyTOF分析高表達CRLF2（cytokine Receptor Like Factor 2）的B前體細胞急性淋巴細胞白血病（B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia,BCP-ALL）細胞，對TSLP/CRLF2信號通路進行詳細的表征，觀察信號通路中的異質細胞群，發(fā)現(xiàn)SRC/ABL抑制劑使TSLP下游的信號通路中斷，發(fā)現(xiàn)了新的靶向治療的關鍵點，為攜帶CRLF2突變的BCP-ALL患者提供了新的治療前景。隨著白血病潛在治療靶點的不斷發(fā)現(xiàn)，白血病的治療效果有望得到改善。

3.3 監(jiān)測治療效果

CyTOF可監(jiān)測治療期間的骨髓細胞類型及信號通路，Behbehani等[10]用CyTOF檢測FLT3-ITD+AML中的異常信號以及測量羥基脲治療的細胞周期效應，從而監(jiān)測白血病患者對靶向治療和細胞毒性治療的反應。由于CyTOF可以同時評估多種骨髓細胞類型，可用于監(jiān)測免疫治療方法(如嵌合抗原受體T細胞)的療效。CyTOF還可用于評估新型藥物的治療效果，Saenz等[28]用CyTOF監(jiān)測AML干/祖細胞對新型BET（bromodomain and extra terminal domain）抑制劑的治療反應。利用CyTOF高維多參數(shù)單細胞分析技術的優(yōu)勢，Gullaksen等[29]用其監(jiān)測CML患者酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitors,TKI）治療期間單個細胞的信號轉導變化，通過提供接近實時的癌細胞信號轉導圖譜，揭示TKI調節(jié)信號轉導與臨床應答之間的關系。

3.4 白血病復發(fā)和耐藥機制的研究

CyTOF將單細胞流式細胞術與質譜分析相結合，能在單細胞水平上了解白血病生物學的特點。該技術與先進的數(shù)據(jù)分析方法結合，能夠發(fā)現(xiàn)額外的表面和胞內(nèi)分子所致的AML的表型復雜性和多樣性，表征信號通路和代謝狀態(tài)，識別在白血病復發(fā)中起關鍵作用的白血病干細胞（leukemia stem cell,LSC），改善LSC的特性對于防止AML復發(fā)和提高AML治愈率至關重要。此外，CyTOF亦可識別治療后AML表型和細胞內(nèi)暫時或永久的改變，描述治療后存活的單個LSC的特征，確定導致AML耐藥機制發(fā)展的因素，從而發(fā)現(xiàn)AML耐藥的新治療方法[30]。白血病復發(fā)和耐藥是影響患者預后的主要因素，闡明白血病復發(fā)和耐藥機制是有效治療白血病的關鍵。

4 結語

CyTOF作為一種新型高維多參數(shù)的單細胞分析技術，可精確全面的分析細胞群免疫分型及細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡。利用CyTOF高通量、多參數(shù)、高靈敏度及高穩(wěn)定性等檢測分析特點，該技術可用于白血病腫瘤微環(huán)境的研究，可在異質微環(huán)境中描述免疫背景和復雜細胞表型，分析細胞內(nèi)信號網(wǎng)絡傳導，深入探究白血病發(fā)病機制，研究藥物作用機理，發(fā)現(xiàn)更多白血病治療的潛在新靶點，評估治療效果，闡述白血病復發(fā)和耐藥機制，有望為白血病的治療帶來新的進展。未來白血病治療期望實現(xiàn)個體化、靶向治療，CyTOF作為一種新型單細胞分析技術出現(xiàn)，允許快速實施和應用，可作為指導白血病個體化治療的一個重要工具。