張波，任龍飛，胡進(jìn)靜，白仲添，周文策,

0 引言

胰腺癌（pancreatic cancer,PC）是一種常見(jiàn)的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，發(fā)病率逐年上升，5年生存率僅9%[1-2]，其高死亡率與早期癥狀不典型且易轉(zhuǎn)移有關(guān)，大多數(shù)患者確診時(shí)即在晚期，缺乏有效的治療手段。因此，尋找PC早診的生物標(biāo)志物及治療靶點(diǎn)是近年研究的熱點(diǎn)。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）長(zhǎng)度超過(guò)200個(gè)核苷酸，最初被認(rèn)為是“垃圾序列”，沒(méi)有特定的生物學(xué)功能，但越來(lái)越多的研究證實(shí)lncRNA與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[3]。LINC00857是新近研究中發(fā)現(xiàn)的與多種腫瘤的增殖、轉(zhuǎn)移、凋亡和預(yù)后相關(guān)的lncRNA[4-10]，但在PC中鮮有研究。我們通過(guò)GEPIA數(shù)據(jù)庫(kù)發(fā)現(xiàn)，LINC00857在PC組織中高表達(dá)，其表達(dá)水平越高，PC患者預(yù)后越差[11]。然而LINC00857影響PC進(jìn)展的機(jī)制尚不清楚。本研究擬檢測(cè)LINC00857在胰腺細(xì)胞系中的表達(dá)水平，并通過(guò)慢病毒轉(zhuǎn)染下調(diào)LINC00857的表達(dá)，探討LINC00857對(duì)胰腺癌PANC-1細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的影響及其可能的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

胰腺癌細(xì)胞株AsPC-1、PANC-1和胰腺正常上皮細(xì)胞HPNE購(gòu)自上海中科院，胰腺癌細(xì)胞株CFPAC-1由甘肅省生物治療與再生醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。胰蛋白酶和DMEM培養(yǎng)基（Gibco，美國(guó)）；胎牛血清和RPMI 1640培養(yǎng)基（BioInd，以色列）；TRIzol（Invitrogen，美國(guó)）；引物GAPDH和LINC00857（寶日生物，中國(guó)）；反轉(zhuǎn)錄和PCR擴(kuò)增試劑盒（TaKaRa，日本）；PVDF膜、ECL發(fā)光液（Millipore，美國(guó)）；LV-LINC00857-RNAi慢病毒（上海吉?jiǎng)P生物，中國(guó)）；E-cadherin和N-cadherin抗體（Abcam，美國(guó)）；Vimentin（賽維爾，中國(guó)）；鼠抗人GAPDH（Proteintech，美國(guó)）；羊抗兔、鼠二抗（SAB，美國(guó)）；細(xì)胞周期試劑盒（索萊寶，中國(guó)）；細(xì)胞凋亡試劑盒（江蘇碧云天，中國(guó)）；CCK-8試劑（日本同仁，日本）；Transwell小室（Corning，美國(guó)）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) AsPC-1細(xì)胞使用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，PANC-1、CFPAC-1和HPNE細(xì)胞使用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，置于恒溫培養(yǎng)箱（37℃、5%CO2）中培養(yǎng)。

1.2.2 慢病毒的設(shè)計(jì)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染 本實(shí)驗(yàn)中使用的LINC00857 shRNA慢病毒由上海吉?jiǎng)P基因公司構(gòu)建，載體為GV112，元件順序?yàn)閔U6-MCSCMV-puromycin，其中LINC00857-sh1序列為5'-CCGGCTCCTAGAATACCACGTTTATCTCGA GATAAACGTGGTATTCTAGGAGTTTTTG-3'，LINC00857-sh2序列為5'-CCGGAAGGTGGAGAA GAGTACCCAACTCGAGTTGGGTACTCTTCTCC ACCTTTTTTTG-3'，空載體序列為5'-TTCTCCGA ACGTGTCACGT-3'。根據(jù)慢病毒轉(zhuǎn)染指南，六孔板中細(xì)胞匯合度在30%～40%時(shí)進(jìn)行感染，MOI值為10。共計(jì)分為4組：Normal control組為未處理的正常對(duì)照組，Negative control組為轉(zhuǎn)染空白載體的陰性對(duì)照組，LINC00857-sh1和LINC00857-sh2為實(shí)驗(yàn)組。轉(zhuǎn)染16 h后換液，3天后用嘌呤霉素（2 μg/ml）篩選，隔天換液，篩選9天獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。

1.2.3 RNA提取和qPCR法實(shí)驗(yàn) 待細(xì)胞融合度達(dá)80%～90%時(shí)，TRIzol提取細(xì)胞的RNA，檢測(cè)濃度和純度，隨即將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，將cDNA原液5倍稀釋后按10 μl反應(yīng)體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列如下，LINC00857：F:5'-CCCCTGCTTCATTGTTTCCC-3'，R:5'-AGCTTGTCCTTCTTGGGTACT-3'；GAPDH：F:5'-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3'，R:5'-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3'。擴(kuò)增參數(shù)：95℃ 30 s，1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s，1個(gè)循環(huán)。運(yùn)用2-ΔΔCt計(jì)算檢測(cè)結(jié)果。

1.2.4 CCK-8法檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞增殖 消化處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，取每孔100 μl細(xì)胞懸液（含2 000個(gè)細(xì)胞）接種于96孔板，每組重復(fù)5次，細(xì)胞貼壁后棄掉原液，CCK-8溶液和無(wú)血清的DMEM按1:10配置，每孔加100 μl配置液，恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 h，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度（OD）值，每天檢測(cè)1次，隔天換液，連續(xù)測(cè)5天。采用GraphPad軟件繪制增殖曲線。

1.2.5 Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞的遷移能力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞饑餓處理24 h，隨即胰酶消化，取200 μl細(xì)胞無(wú)血清懸液（含6×l04個(gè)細(xì)胞）接種于Transwell上室，600 μl（含30%胎牛血清）完全培養(yǎng)基加入下室，孵箱中培養(yǎng)48 h，隨即用4%多聚甲醛固定、結(jié)晶紫避光染色，放置在浸沒(méi)PBS的24孔板中，倒置顯微鏡（200倍）下多視野拍照。

六孔板中細(xì)胞融合度在90%左右時(shí)，在超凈臺(tái)中用10 μl槍頭垂直劃痕。輕柔洗去漂浮細(xì)胞，加入2 ml DMEM（不含血清），0 h和24 h于倒置顯微鏡（100倍）下拍照。利用Image J軟件測(cè)細(xì)胞遷移前后的面積。劃痕愈合率=（0 h劃痕面積-24 h劃痕面積）/0 h劃痕面積×100%。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞的細(xì)胞周期和凋亡 待細(xì)胞匯合度達(dá)70%～80%時(shí)，收集消化的各組細(xì)胞，取1 ml含1×106個(gè)細(xì)胞的細(xì)胞懸液，離心后預(yù)冷PBS洗兩遍，逐滴加入70%預(yù)冷的無(wú)水乙醇重懸細(xì)胞，隨后置于4℃冰箱過(guò)夜，清洗后重懸于100 μl RNase A溶液，加400 μl碘化丙啶（PI）固定，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞DNA含量。取胰酶（不含EDTA）消化的5～10萬(wàn)個(gè)細(xì)胞重懸于195 μl Annexin V-FITC結(jié)合液中，加入5 μl Annexin V-FITC、10 μl PI，4℃避光靜置20 min，加入300 μl結(jié)合液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。使用ModFit軟件分析細(xì)胞周期，F(xiàn)lowJo軟件分析細(xì)胞凋亡情況。

1.2.7 Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染后PANC-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá) 提取細(xì)胞總蛋白，BCA法測(cè)蛋白濃度，加入適量5×SDS蛋白上樣緩沖液和強(qiáng)RIPA將待測(cè)蛋白樣品定量至合適濃度，的100℃沸水中煮10 min使蛋白質(zhì)變性。每孔加50 μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳（80 V 30 min，120 V 1.5 h，恒壓）、濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜（200 mA，2～3 h,恒流），5%BSA封閉1 h，TBST洗PVDF膜3次，每次10 min，按分子量拆剪條帶，放置于一抗（稀釋比Vimentin 1:500，GAPDH、E-cadherin和N-cadherin均為1:1 000）中，4℃冰箱保存過(guò)夜；TBST清洗后在二抗（稀釋比1:2000）中孵育1 h，ECL化學(xué)發(fā)光A、B液按1:1配置，曝光儀下顯影并拍照。采用Image J軟件核算蛋白條帶灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS22.0和GraphPad Prism 7.00統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，定量資料用（x±s）表示，數(shù)據(jù)均進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)，每個(gè)實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LINC00857在胰腺細(xì)胞系中的表達(dá)及其在PANC-1細(xì)胞中的敲低情況

LINC00857 在三種胰腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)顯著高于胰腺正常上皮細(xì)胞HPNE，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），其中以PANC-1細(xì)胞本底表達(dá)最高，故選擇PANC-1細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，見(jiàn)圖1A。對(duì)照組間LINC00857表達(dá)水平未見(jiàn)明顯差異（P=0.5946），與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組中LINC00857的表達(dá)水平均顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.0001），見(jiàn)圖1B。

圖1 LINC00857在胰腺細(xì)胞系中的表達(dá)情況（A）及其敲低效率的驗(yàn)證（B）Figure 1 Expression levels of LINC00857 in pancreatic cell lines(A) and verification of its knockdown efficiency(B)

2.2 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖結(jié)果

與Normal control組相比，Negative control組細(xì)胞OD值減?。?4 hP=0.115，余P<0.05）；與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞OD值均明顯減?。ň鵓<0.0001）；實(shí)驗(yàn)組間OD值僅在48 h差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；表明下調(diào)LINC00857可抑制PANC-1細(xì)胞的增殖能力，見(jiàn)圖2。

圖2 LINC00857敲低對(duì)PANC-1細(xì)胞增殖能力的影響Figure 2 Effect of LINC00857 knockdown on proliferation of PANC-1 cells

2.3 Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移結(jié)果

與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組穿過(guò)的細(xì)胞數(shù)目均明顯減少（P<0.0001），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間各自組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.7835和P=0.7279），見(jiàn)圖3A、3C。劃痕實(shí)驗(yàn)也同樣證實(shí)了敲低LINC00857可以顯著抑制PANC-1細(xì)胞的遷移能力，見(jiàn)圖3B、3D。與Normal control組（78.54±40.25)%和Negative control組（78.06±1.263）%的劃痕愈合率相比，LINC00857-sh1組（44.92±2.14）%和LINC00857-sh2組（42.75±1.425）%的劃痕愈合率均顯著下降（P<0.0001），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組間各自組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.9990和P=0.9226）。

2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期和凋亡的結(jié)果

細(xì)胞周期結(jié)果顯示，與Negative control組G0/G1期細(xì)胞的百分比（55.4±1.045）%相比，LINC00857-sh1組（64.91±1.185）%和LINC00857-sh2組（69.77±0.775）%顯著上升（P=0.0058和P=0.0012），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各自組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.9743和P=0.0599）。與Negative control組S期細(xì)胞的百分比（22.15±1.51）%相比，LINC00857-sh1組（14.24±0.02）%和LINC00857-sh2組（9.9±0.38）%明顯減少（P=0.0493和P=0.0109），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各自組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.6489和P=0.254），見(jiàn)圖4A、4C。說(shuō)明敲低LINC00857后PANC-1細(xì)胞被阻滯在G1期。

細(xì)胞凋亡結(jié)果所示，與Negative control組凋亡（早期凋亡+晚期凋亡）比例（26.84±0.97）%相比，LINC00857-sh1組（41.45±0.55）%和LINC00857-sh2組（50.3±2.6）%明顯增加（P=0.0178和P=0.0031），實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組各自組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.8005和P=0.0914），見(jiàn)圖4B、4D。說(shuō)明敲低LINC00857后PANC-1細(xì)胞凋亡增加。

2.5 Western blot檢測(cè)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達(dá)的結(jié)果

圖3 Transwell（A、C）和劃痕實(shí)驗(yàn)（B、D）檢測(cè)LINC00857敲低對(duì)PANC-1細(xì)胞遷移能力的影響Figure 3 Effect of LINC00857 knockdown on migration of PANC-1 cells detected by Transwell(A,B) and wound-healing assay(B,D)

圖4 LINC00857敲低對(duì)PANC-1細(xì)胞周期（A、C）和凋亡（B、D）的影響Figure 4 Effect of LINC00857 knockdown on cell cycle(A,C) and apoptosis of PANC-1 cells(B,D)

對(duì)照組間EMT相關(guān)蛋白表達(dá)未見(jiàn)明顯異常（均P>0.05）；與Negative control組相比，實(shí)驗(yàn)組EMT相關(guān)的蛋白E-cadherin表達(dá)顯著升高（P=0.0152和P=0.0196），N-cadherin表達(dá)顯著下調(diào)（P=0.0001和P=0.0016），Vimentin表達(dá)顯著降低（P=0.0208和P=0.0170），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖5。

圖5 LINC00857敲低對(duì)PANC-1細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白表達(dá)的影響Figure 5 Effect of LINC00857 knockdown on expression of EMT-related proteins in PANC-1 cells

3 討論

近些年研究發(fā)現(xiàn)LncRNA與PC的惡性行為及治療密切相關(guān)。如LncRNA DGCR5可誘導(dǎo)胰腺癌細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖[12]；Wang等[13]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA H19不僅參與維持胰腺癌細(xì)胞干性，還與胰腺癌細(xì)胞的侵襲、遷移、EMT和化療耐藥性密切相關(guān)。納米顆粒介導(dǎo)的致癌LncRNA DANCR已被證明有助于三陰性乳腺癌的治療[14]。LINC00857是一種新發(fā)現(xiàn)的LncRNA，位于人類染色體10q22.3的正鏈上，不能編碼蛋白質(zhì)[4]。LINC00857在肺癌[4-5]、胃癌[6-7]、膀胱癌[8]、肝癌[9]、食管癌[10]等癌組織或細(xì)胞中高表達(dá)，通過(guò)不同機(jī)制促進(jìn)腫瘤的惡性進(jìn)展。已有研究[15]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)LINC00857在PC組織中高表達(dá)，與PC預(yù)后呈負(fù)相關(guān)，提示LINC00857可能作為促癌基因參與PC的惡性進(jìn)展。然而，LINC00857在胰腺癌細(xì)胞中的表達(dá)和作用機(jī)制尚無(wú)報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)，LINC00857在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)。下調(diào)LINC00857后，細(xì)胞增殖能力明顯減弱，說(shuō)明LINC00857在PC中是一種促癌因素。細(xì)胞周期和凋亡實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組較對(duì)照組細(xì)胞凋亡率明顯增加，G0/G1期比例增加，S期比例下降，細(xì)胞被阻滯在G1期。Wang等[4]和Pang等[7]研究發(fā)現(xiàn)，LINC00857下調(diào)后，細(xì)胞周期信號(hào)通路失活，細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（CDK2）、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白E1（cyclin E1）表達(dá)減少，細(xì)胞被阻滯在G1期，細(xì)胞增殖受到抑制；LINC00857表達(dá)缺失后肺癌和食管癌細(xì)胞凋亡比例增加，細(xì)胞增殖被抑制[5,10]。由此可見(jiàn)，G1期阻滯或誘導(dǎo)凋亡可能是LINC00857下調(diào)抑制腫瘤生長(zhǎng)的機(jī)制。本研究Transwell和劃痕實(shí)驗(yàn)同時(shí)證實(shí)，下調(diào)LINC00857可抑制PANC-1細(xì)胞的遷移能力；為了探究其原由，我們檢測(cè)了EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)，與對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的E-cadherin表達(dá)明顯上升，N-cadherin和Vimentin表達(dá)顯著下降，EMT過(guò)程被抑制。這與Xia等[9]在肝癌中的研究一致。腫瘤早期轉(zhuǎn)移與細(xì)胞的EMT過(guò)程緊密相關(guān)，EMT可加速腫瘤的侵襲和遷移[16]，這種癌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換是胰腺癌細(xì)胞惡性生長(zhǎng)所必需的[17]。LncRNA SNHG12可通過(guò)EMT增加胰腺癌細(xì)胞的惡性行為[18]。因此，EMT可能是實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組遷移能力差異的原因。

綜上所述，LINC00857在胰腺癌細(xì)胞系中高表達(dá)，下調(diào)LINC00857可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖和遷移能力，促進(jìn)細(xì)胞的凋亡，其機(jī)制可能與G1期阻滯和EMT信號(hào)通路有關(guān)。LINC00857對(duì)PC的發(fā)生發(fā)展起促進(jìn)作用，可能成為PC治療的新靶點(diǎn)，但 LINC00857在PC中的具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步探究。