李傳坤，梁 鵬，王 偉，姜海濤

(1. 西安交通大學第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；2.西安交通大學第一附屬醫(yī)院醫(yī)療質(zhì)量控制辦公室，陜西西安 710061)

神經(jīng)膠質(zhì)瘤是一種常見的成人原發(fā)性腦腫瘤，目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的總體存活率仍然很低，并且仍未完全明確相關(guān)的發(fā)病機制[1]。先前的研究表明，重要基因的功能異常將影響患者預后。膜聯(lián)蛋白是鈣依賴性磷脂結(jié)合蛋白超家族的成員，膜聯(lián)蛋白A5是人類中普遍存在且廣泛表達的胞內(nèi)蛋白，分子質(zhì)量約為35.7 ku，其與許多膜相關(guān)事件有關(guān)[2]。膜聯(lián)蛋白A5具有滋養(yǎng)細胞膜修復、抗凝、調(diào)節(jié)細胞信號轉(zhuǎn)導等多種功能。最近研究表明，膜聯(lián)蛋白A5與肺癌、結(jié)腸癌和前列腺癌的進展有關(guān)[3-4]。據(jù)報道，膜聯(lián)蛋白A2和A5可以增加系統(tǒng)性紅斑狼瘡的細胞凋亡[5]。此外，膜聯(lián)蛋白A5在子宮宮頸鱗狀細胞癌(UCSCCs)中過表達，并且與分化程度顯著相關(guān)[6]。目前，關(guān)于膜聯(lián)蛋白A5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的生物學作用尚不明確。有研究發(fā)現(xiàn)，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤腦組織中膜聯(lián)蛋白A5的表達明顯增加，提示膜聯(lián)蛋白A5可能是一種惡性膠質(zhì)瘤診斷的生物標志物。但是，膜聯(lián)蛋白A5對膠質(zhì)瘤患者預后及細胞生物學行為的影響與機制仍然有待進一步研究。本研究分析了膜聯(lián)蛋白A5與神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者臨床病理特征的相關(guān)性，并觀察膜聯(lián)蛋白A5在體外和體內(nèi)對腫瘤生長和轉(zhuǎn)移的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 藥品及試劑Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，TRIzol試劑購自美國Invitrogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，DAB顯色試劑盒、MTT測定試劑盒購自英國Abcam公司，RIPA緩沖液購自碧云天生物技術(shù)研究所，膜聯(lián)蛋白A5、Raf、p-Raf、MEK1/2、p-MEK1/2、ERK1/2、p-ERK1/2、c-Myc、E-Cadherin和GAPDH抗體均購自美國Cell Signaling Technology公司；辣根過氧化物酶標記的的二抗、ECL檢測試劑購自美國Santa Cruz公司，Lipofectamine 2000購自美國Invitrogen公司，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)-FITC/碘化丙啶(PI)測定試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司，Hoechst 33258染色液購自北京索萊寶科技有限公司，Transwells購自美國Minipore公司，Matrigel購自美國BD Biosciences公司。

1.2 患者組織的收集選取西安交通大學第一附屬醫(yī)院2013-2018年確診并經(jīng)手術(shù)治療的100例神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的膠質(zhì)瘤標本，其中男性56例，女性44例，年齡26～77歲，平均(45.52±22.16)歲。根據(jù)2016年世界衛(wèi)生組織(WHO)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的分類標準[1]，將患者進行分級，其中Ⅰ級13例，Ⅱ級35例，Ⅲ級34例，Ⅳ級18例?；颊呤中g(shù)前均未進行放化療治療。正常腦組織標本為我院保存的腦外傷患者傷后早期行顱內(nèi)減壓術(shù)中切取的、術(shù)后經(jīng)病理診斷證明為正常腦組織的標本，共20份。本研究已獲得患者的書面知情同意書并經(jīng)醫(yī)院機構(gòu)審查委員會批準。

1.3 細胞培養(yǎng)正常人腦膠質(zhì)細胞系(HEB)和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U251)購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)。將HEB和U251細胞在含有100 mL/L胎牛血清和5%青霉素/鏈霉素的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，于50 mL/L CO2、37 ℃的潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。

1.4 免疫組化檢測采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶(SP)免疫組化法檢測膠質(zhì)瘤組織中膜聯(lián)蛋白A5的表達。滴加一抗(膜聯(lián)蛋白A5，1∶500稀釋)4 ℃孵育過夜，與對應(yīng)的二抗(1∶100稀釋)37 ℃孵育20 min，然后與鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化酶(1∶100稀釋)37 ℃孵育20 min。DAB顯色，蘇木素復染。

陽性判定：陽性染色細胞呈棕黃色，在400×放大倍數(shù)下隨機選擇5個視野并計數(shù)陽性細胞數(shù)量。陽性細胞數(shù)量評分標準如下。≤4%為0分，4%～24%為1分，25%～49%為2分，50%～74%為3分，75%～100%為4分。染色強度評分標準如下。無色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分。陽性染色評分=陽性細胞數(shù)量評分×染色強度評分。陽性染色評分判定：0分為陰性(-)、1～2 分為弱陽性(+)、3～4分為中等陽性()、4分以上為強陽性()。

1.5 RNA提取和RT-PCR分析按照說明用Trizol試劑分別提取HEB和U251細胞及膠質(zhì)瘤組織總RNA，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，美國Applied Biosystems ABI 7500熒光定量PCR儀進行RT-PCR。引物序列如下：膜聯(lián)蛋白A5，正向 5′-TCGCAGAGATGTCCAGTCAG-3′，反向 5′-CCTGAAGAGTTCCTCCACCA-3′；β-actin，正向 5′-GATCATTGCTCCTCCTGAGC-3′，反向 5′-TGTGGACTTGGGAGAGGACT-3′。β-actin作為內(nèi)參對照，計算2-ΔΔCt觀察mRNA相對表達。實驗重復至少3次。

1.6 蛋白印跡分析用含有蛋白酶/磷酸酶抑制劑的RIPA緩沖液從HEB和U251細胞及膠質(zhì)瘤組織中分別提取總蛋白。將蛋白質(zhì)上樣至100 g/L SDS-PAGE進行電泳并轉(zhuǎn)移到PVDF膜上后，將膜在50 g/L脫脂奶粉中封閉1 h，與一抗在4 ℃過夜孵育(稀釋比分別為：膜聯(lián)蛋白A5、c-Myc、E-Cadherin，1∶500；Raf、p-Raf、MEK1/2、p-MEK1/2及內(nèi)參GAPDH均為1∶1 000；ERK1/2、p-ERK1/2為1∶2 000)。然后將膜與辣根過氧化物酶標記的的二抗在室溫下孵育1 h。通過ECL檢測溶液進行顯影。

1.7 siRNA轉(zhuǎn)染靶向膜聯(lián)蛋白A5的小干擾RNA(siRNA)(si-Annexin A5)和陰性對照siRNA(si-NC)由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。按說明用Lipofectamine 2000將siRNA分別轉(zhuǎn)染U251細胞，孵育72 h后收集細胞，并用RT-PCR和蛋白印跡法測定膜聯(lián)蛋白A5的表達。

1.8 MTT和集落形成實驗MTT法檢測細胞增殖。將U251細胞以1×104/孔接種于96孔板中。孵育24 h，加入50 μL的MTT再培養(yǎng)4 h后，棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL二甲基亞砜并搖動10 min，并且在492 nm波長下讀取每孔吸光度(A)值。

將500個U251細胞接種到6孔板(2 mL完全培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)箱)，4 d更換1次培養(yǎng)基。14 d將細胞用40 g/L多聚甲醛固定，并用1 g/L結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計數(shù)集落。

1.9 流式細胞儀分析用Annexin V-FITC/PI測定試劑盒檢測細胞凋亡。將1×105個U251細胞用PBS洗滌3次，暗盒中重懸于含有10 μL Annexin V-FITC和5 μL PI的500 μL結(jié)合緩沖液中，孵育20 min后洗滌細胞，并通過德國BD公司流式細胞儀分析細胞凋亡。

1.10 Hoechst 33258染色將U251細胞在40 g/L多聚甲醛中固定20 min。吸出固定溶液，并在室溫下加入預冷的無水乙醇并孵育20 min后，吸出乙醇，并用PBS沖洗3次。加入100 μL Hoechst稀釋液并孵育10 min。使用熒光顯微鏡觀察染色情況。

1.11 使用Matrigel Transwell實驗評估細胞的侵襲能力將孔徑為8 μm的24孔Transwells上室預先用Matrigel涂覆。然后將1×105個U251細胞加入含有10 mL/L FBS的200 μL DMEM中并添加至上室，將600 μL含有100 mL/L FBS的DMEM添加至下室。孵育24 h后，用棉簽去除上室中的非侵襲細胞，用PBS洗滌2次后，用40 g/L多聚甲醛固定、結(jié)晶紫染色，在顯微鏡下以200倍放大倍數(shù)計數(shù)侵襲細胞的數(shù)目。

1.12 傷口愈合實驗將U251細胞用無血清培養(yǎng)基重懸并調(diào)整密度為2.5×105/mL，然后取2 mL接種到6孔板中并于37 ℃、50 mL/L CO2環(huán)境中培養(yǎng)24 h。待細胞完全貼壁后用槍頭劃直線形成劃痕。PBS清洗后加入無血清培養(yǎng)基。分別于0 h和24 h進行拍照。

2 結(jié) 果

2.1 不同級別膠質(zhì)瘤組織中膜聯(lián)蛋白A5的表達免疫組化分析顯示，正常腦組織中膜聯(lián)蛋白A5不表達或低表達，膠質(zhì)瘤組織中的膜聯(lián)蛋白A5主要在細胞膜和細胞質(zhì)中表達，并且陽性染色強度與腫瘤級別有關(guān)(圖1)。Pearson相關(guān)分析顯示，隨著腫瘤級別的升高，膜聯(lián)蛋白A5陽性率逐漸升高，并且腫瘤級別與陽性率呈正相關(guān)(r=1.000，P<0.001，表1)。

圖1 不同級別膠質(zhì)瘤組織中膜聯(lián)蛋白A5的免疫組化染色結(jié)果Fig.1 Immunohistochemical staining of Annexin A5 in different grades of glioma tissues

表1 不同級別膠質(zhì)瘤組織中膜聯(lián)蛋白A5的染色強度Tab.1 The staining intensity of Annexin A5 in different grades of glioma tissues

2.2 膜聯(lián)蛋白A5在膠質(zhì)瘤組織和細胞系中的表達通過RT-PCR和蛋白印跡分析顯示，與正常腦組織相比，膠質(zhì)瘤組織中的膜聯(lián)蛋白A5的mRNA表達升高了2.45倍(t=25.860，P<0.001)，蛋白表達升高了2.87倍(t=29.440，P<0.001)。此外，與HEB相比，U251中的膜聯(lián)蛋白A5的mRNA表達升高了4.12倍(t=33.849，P<0.001)，蛋白表達升高了2.75倍(t=27.001，P<0.001，圖2)。

圖2 膠質(zhì)瘤組織和細胞系中膜聯(lián)蛋白A5的mRNA和蛋白表達情況及比較Fig.2 Comparison of mRNA and protein expression of Annexin A5 in glioma tissues and cell linesA～C：腦組織中膜聯(lián)蛋白A5的表達；D～F：細胞系中膜聯(lián)蛋白A5的表達。與膠質(zhì)瘤組織或HEB細胞相比，*P<0.001。

2.3 膜聯(lián)蛋白A5對膠質(zhì)瘤細胞增殖的影響轉(zhuǎn)染靶向膜聯(lián)蛋白A5的miRNA下調(diào)了U251細胞中的膜聯(lián)蛋白A5的mRNA(下降了68.03%，F(xiàn)=239.537，P<0.001)和蛋白表達(下降了70.35%，F(xiàn)=247.947，P<0.001)。MTT實驗顯示，與對照組相比，si-Annexin A5組的U251細胞在培養(yǎng) 48 h(降低了29.46%，F(xiàn)=131.262，P<0.001)和72 h(降低了40.43%，F(xiàn)=175.900，P<0.001)后的細胞活力明顯降低。集落形成實驗顯示，與對照組相比，si-Annexin A5組的集落形成率降低了68.58%(F=241.095，P<0.001，圖3)。

圖3 下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5的表達對U251細胞增殖的影響Fig.3 The effect of downregulating annexin A5 expression on U251 cell proliferationA～C：轉(zhuǎn)染miRNA下調(diào)了膜聯(lián)蛋白A5的mRNA和蛋白表達；D：MTT實驗；E和F：集落形成實驗。與對照組(Control)相比，*P<0.001。

2.4 膜聯(lián)蛋白A5對膠質(zhì)瘤細胞凋亡的影響流式細胞儀分析顯示，與對照組的細胞凋亡率(0.46±0.03)%相比，si-Annexin A5組的(11.23±0.66)%明顯升高了23.41倍(F=231.016，P<0.001)；Hoechst 33258染色也顯示，si-Annexin A5組的Hoechst陽性細胞數(shù)明顯增加(圖4)。

圖4 下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5對U251細胞凋亡的影響Fig.4 The effect of downregulation of Annexin A5 on apoptosis of U251 cellsA：流式細胞儀分析；B：Hoechst 33258染色。

2.5 膜聯(lián)蛋白A5對膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的影響侵襲測定顯示，與對照組相比，si-Annexin A5組的遷移細胞率明顯降低了65.35%(F=226.848，P<0.001)；傷口愈合實驗顯示，與對照組相比， si-Annexin A5組的侵襲細胞率明顯降低了68.80%(F=237.306，P<0.001，圖5)。

圖5 下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5對U251細胞遷移和侵襲的影響Fig.5 The effect of downregulation of Annexin A5 on migration and invasion of U251 cellsA、B：傷口愈合實驗；C、D：侵襲實驗。與對照組(Control)相比，*P<0.001。

2.6 膜聯(lián)蛋白A5對Raf/MEK/ERK信號通路及下游分子的影響蛋白印跡分析顯示，各組間的p-Raf(F=198.240，P<0.001)、p-MEK1/2(F=237.956，P<0.001)、p-ERK1/2(F=194.218，P<0.001)和c-Myc(F=225.886，P<0.001)的蛋白表達有統(tǒng)計學差異；與對照組相比，si-Annexin A5組的p-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2和c-Myc的蛋白表達均明顯降低(依次降低了54.67%、70.37%、60.26%、54.95%)，而E-Cadherin的蛋白表達水平升高了3.58倍(F=205.842，P<0.001，圖6)。

圖6 下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5對U251細胞中p-Raf、Raf、p-MEK1/2、MEK1/2、p-ERK1/2、ERK1/2、c-Myc和E-Cadherin蛋白表達的影響Fig.6 The effect of downregulation of Annexin A5 on the protein expressions of p-Raf, Raf, p-MEK1/2, MEK1/2, p-ERK1/2, ERK1/2, c-Myc and E-Cadherin in U251 cells與對照組(Control)相比，*P<0.001。

3 討 論

癌細胞的生長、轉(zhuǎn)移、侵襲和耐藥性等生物學活性受到多種功能蛋白的調(diào)控。膜聯(lián)蛋白是一組具有以Ca2+依賴性方式與負電荷磷脂結(jié)合的胞質(zhì)可溶性蛋白[7-8]。已證明膜聯(lián)蛋白成員參與多種功能，包括細胞凋亡、膜修復過程、Ca2+通道形成、膜與細胞骨架的連接等。作為一種主要的細胞內(nèi)Ca2+結(jié)合蛋白，膜聯(lián)蛋白A5在許多類型的腫瘤中參與調(diào)控細胞周期、細胞增殖和侵襲[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A5在大多數(shù)腫瘤中均表現(xiàn)出上調(diào)，包括肝癌、乳腺癌、子宮頸癌、大腸腺癌、胃癌、胰腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、前列腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、甲狀腺癌等，并且有助于腫瘤的進展、侵襲、轉(zhuǎn)移和耐藥性[11]。據(jù)報道，惡性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的預后較差，平均生存時間為12～14個月。但是，尚未完全闡明膜聯(lián)蛋白A5對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移和侵襲的影響及潛在機制。因此，本研究初步探討了神經(jīng)膠質(zhì)瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的分子機制。

本研究發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞系中的膜聯(lián)蛋白A5的表達水平明顯上調(diào)。此外，本研究還考察了不同等級的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中膜聯(lián)蛋白A5的表達，發(fā)現(xiàn)隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤級別的升高，膜聯(lián)蛋白A5的表達水平也明顯上調(diào)，并且兩者具有正相關(guān)性。說明膜聯(lián)蛋白A5參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展，并且與患者的預后有關(guān)。

有研究報道，膜聯(lián)蛋白A5可增強多種惡性腫瘤的耐藥性，并且也可以直接參與對腫瘤細胞凋亡的調(diào)控[12]。本研究通過對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞系(U251)轉(zhuǎn)染靶向膜聯(lián)蛋白A5的miRNA以下調(diào)細胞中膜聯(lián)蛋白A5，研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5明顯抑制了U251細胞的增殖并誘導了細胞凋亡。另外，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的轉(zhuǎn)移性與血管生成和細胞侵襲能力密切相關(guān)。膜聯(lián)蛋白A5在非血管生成腫瘤中平均增加2.1倍，在血管生成腫瘤中平均增加3.4倍[13]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5明顯抑制了U251細胞的遷移和侵襲能力。提示膠質(zhì)瘤的生長和轉(zhuǎn)移與膜聯(lián)蛋白A5的高表達具有直接關(guān)聯(lián)。

膜聯(lián)蛋白A5可能通過細胞間信號轉(zhuǎn)導在血管生成性腫瘤中發(fā)揮功能，并可能增強腫瘤細胞之間或腫瘤與宿主細胞之間的串擾。膜聯(lián)蛋白A5通過誘導新血管和促進腫瘤生長，增強腫瘤與宿主之間的相互作用，可能會導致血管生成表型腫瘤更好地適應(yīng)其微環(huán)境。Raf/MEK/ERK信號通路在腫瘤細胞的生長和運動中具有重要作用[14-16]。本研究檢測了Raf/MEK/ERK信號通路及下游關(guān)鍵分子的表達，發(fā)現(xiàn)下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5明顯抑制了膠質(zhì)瘤細胞中Raf、MEK1/2和ERK1/2的磷酸化，說明膜聯(lián)蛋白A5表達下調(diào)抑制了Raf/MEK/ERK信號通路的活性。

本研究還檢測了神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中c-Myc 和E-Cadherin的表達。已知c-Myc轉(zhuǎn)錄因子是由c-Myc原癌基因編碼的蛋白質(zhì)[17]，c-Myc通過與啟動子和增強子結(jié)合而調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄，進而調(diào)節(jié)細胞增殖[18]。沉默c-Myc可明顯抑制癌細胞株增殖[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5抑制了膠質(zhì)瘤細胞中c-Myc的表達。由于 c-Myc是Raf/MEK/ERK信號通路的下游效應(yīng)分子，因此，膜聯(lián)蛋白A5可能通過Raf/MEK/ERK/c-Myc通路調(diào)控膠質(zhì)瘤細胞的增殖。E-Cadherin是介導細胞與細胞間黏附的Ca2+依賴的黏附分子，而細胞間連接結(jié)構(gòu)的破壞是腫瘤細胞轉(zhuǎn)移的重要事件，E-Cadherin的下調(diào)可導致腫瘤細胞間連接作用減弱，從而導致腫瘤細胞更容易從腫瘤組織中脫離[20-21]。因此，E-Cadherin的喪失可促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[22]。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5明顯升高了膠質(zhì)瘤細胞中E-Cadherin的表達。有研究報道， E-Cadherin是ERK信號通路的下游靶標，并且參與調(diào)控乳腺癌細胞的遷移[23]。因此，本研究推測，膜聯(lián)蛋白A5可能通過Raf/MEK/ERK/E-Cadherin通路調(diào)控神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的遷移和侵襲能力。

綜上所述，本研究表明，膜聯(lián)蛋白A5在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和細胞中異常高表達，并且與腫瘤級別有關(guān)，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5可明顯抑制膠質(zhì)瘤細胞的生長和運動能力，并誘導細胞凋亡。此外，下調(diào)膜聯(lián)蛋白A5明顯抑制Raf/MEK/ERK信號通路及下游分子c-Myc和E-Cadherin的表達。本研究推測，膜聯(lián)蛋白A5可能部分通過調(diào)控Raf/MEK/ERK信號通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞中發(fā)揮病理生理作用?？傊?，靶向膜聯(lián)蛋白A5進行神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療，將具有較高的潛在應(yīng)用價值。