王永剛，阮建平，周 靜，田劍剛，黃瑞哲，高江紅

(1. 陜西省牙頜面疾病臨床研究中心，西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院口腔預(yù)防保健科，陜西西安 710004；2. 山東省東營(yíng)市人民醫(yī)院口腔科，山東東營(yíng) 257091)

鈣是人體必需元素之一，牙釉質(zhì)中的鈣含量高達(dá)95%～96%。鈣離子(Ca2+)參與釉質(zhì)礦化，是釉質(zhì)發(fā)育礦化過(guò)程中的重要元素[1]。

釉質(zhì)發(fā)育不全是釉質(zhì)發(fā)育中受到某些全身性或局部性因素的影響而出現(xiàn)的釉質(zhì)結(jié)構(gòu)及礦化不全，機(jī)體鈣攝入不足是釉質(zhì)發(fā)育不全的原因之一。有研究顯示，低鈣飲食可導(dǎo)致大鼠牙釉質(zhì)礦化程度顯著降低[2]，還可以促進(jìn)氟斑牙的發(fā)生[3]。EKAMBARAM等[4]發(fā)現(xiàn)，血漿鈣與血漿氟濃度二者間存在負(fù)相關(guān)，高鈣減輕氟中毒癥狀，低鈣則加劇氟中毒。低鈣還可通過(guò)加重氟中毒時(shí)細(xì)胞內(nèi)的鈣超載，從而加重氟骨癥[5]。

不同濃度Ca2+作用于細(xì)胞可引起細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)特性的改變。低濃度Ca2+可引起成骨細(xì)胞增殖活力增加，高濃度Ca2+可導(dǎo)致成骨細(xì)胞凋亡[6]。增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度，人牙髓細(xì)胞的增殖活性降低[7]。牙釉質(zhì)是在成釉細(xì)胞調(diào)控下形成、礦化，釉質(zhì)的礦化伴隨著成釉細(xì)胞的分化及生物學(xué)特性的變化[8]。DENBESTEN等[9]研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)鈣KGM-2培養(yǎng)基中加入20～100 mL/L血清時(shí)，體外培養(yǎng)的細(xì)胞主要是星形的成纖維樣細(xì)胞和卵圓形細(xì)胞，而當(dāng)培養(yǎng)基中加入0.05 mmoL/L Ca2+，卵圓形的細(xì)胞選擇性生長(zhǎng)。然而，低鈣對(duì)原代成釉細(xì)胞增殖、凋亡及分化的影響文獻(xiàn)報(bào)道較少，尚需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

本研究擬對(duì)體外培養(yǎng)的原代大鼠成釉細(xì)胞加入不同濃度的低水平的鈣，觀察成釉細(xì)胞形態(tài)、增殖、凋亡及分化的變化，探討低鈣在釉質(zhì)發(fā)育中的分子生物學(xué)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與主要試劑出生4 d的SD大鼠購(gòu)自西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，雌雄不限，經(jīng)西安交通大學(xué)口腔醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，HycLone)；胎牛血清(浙江天杭生物科技公司)；胰酶、膠原酶、明膠(美國(guó)，Sigma)；無(wú)鈣DMEM培養(yǎng)基(美國(guó)，US Biology)；蘇木精，伊紅(成都格雷西亞化學(xué)技術(shù)有限公司)；CaCl2分析純，多聚甲醛(北京化工廠)；FAST200 RNA 提取試劑盒(上海先鋒生物)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(立陶宛，F(xiàn)ermentas)；釉原蛋白一抗(美國(guó)，Abcam)，DAB顯色試劑盒(武漢，博士德)；MTT(上海研生生化試劑有限公司)；SYBR Premix ExTaqTMⅡ PCR試劑盒(天津，TaKaRa公司)；酶標(biāo)分析儀(上海益聯(lián)AT-858)；流式細(xì)胞儀(美國(guó)，B-D公司)；IQ5實(shí)時(shí)定量PCR儀(美國(guó)，Bio-RAD)。

1.2 含不同濃度Ca2+DMEM培養(yǎng)基的配制取無(wú)鈣DMEM干粉培養(yǎng)基，溶于雙蒸水，0.22 μm濾器過(guò)濾，加入CaCl2，用電解質(zhì)分析儀對(duì)培養(yǎng)基中的Ca2+濃度進(jìn)行測(cè)定，使Ca2+濃度分別為0、0.6、1.2 mmoL/L。

1.3 原代SD大鼠成釉細(xì)胞培養(yǎng)出生4 d SD大鼠4只，斷頸處死，取頭部，750 mL/L乙醇浸泡10 min。分離上、下頜磨牙牙胚，含10 mL/L雙抗的PBS清洗3遍，加入2.5 g/L的Ⅰ型膠原酶，剪碎后轉(zhuǎn)入離心管中，37 ℃下50 r/min搖床上消化1 h，轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿，37 ℃恒溫孵育箱繼續(xù)消化1 h后，小心吸取上層消化液并棄之。加入2.5 g/L胰酶分次消化，于37 ℃恒溫孵育箱內(nèi)消化5 min，吸取上清置于預(yù)先加入含150 mL/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液的離心管中，消化5次，200目濾網(wǎng)過(guò)濾，收集上清液，離心，棄上清，加入含100 mL/L胎牛血清的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)液，混懸，接種于明膠包被的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板，37 ℃、50 mL/L CO2恒溫孵育箱培養(yǎng)。

2 d后，差別消化：2.5 g/L胰酶消化2 min，胎牛血清終止消化，PBS洗2遍，去除成纖維樣細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)上皮樣細(xì)胞；培養(yǎng)第4天后，再次差別消化、換液；第5天，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 原代SD大鼠成釉細(xì)胞HE染色及細(xì)胞鑒定

1.4.1HE染色 細(xì)胞接種于24孔板玻片上培養(yǎng)5 d后，40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min。PBS洗3次，蘇木素染色1 min，自來(lái)水沖洗，伊紅染色30 s， 800、900、950 mL/L、無(wú)水乙醇梯度脫水。二甲苯透明。中性樹(shù)膠封片、拍照。

1.4.2RT-PCR檢測(cè)釉原蛋白和KLK4 mRNA表達(dá) 細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶培養(yǎng)5 d后，加入裂解液，按FAST200 RNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA，檢測(cè)RNA樣品濃度和純度，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄：94 ℃，3 min 95 ℃，30 s 60 ℃，30 s 72 ℃，1 min，30個(gè)循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR擴(kuò)增引物序列如下：Amelogenin-P1 5′-CTCTGCCTCCACTGTTCT-3′；Amelogenin-P2 5′-TCCACTTCGGTTCTCTCA-3′；KLK4-P1 5′-GACTCCTACACCGTGGGA-3′；KLK4-P2 5′-CGCCTGATGGTGTTAGAC-3′；β-actin-P1 5′-AGAGCAAGAGAGGCATCCT-3′；β-actin-P2 5′-GGTCATCTTTTCACGGTTG-3′。各取PCR產(chǎn)物5 μL，上樣于20 g/L的瓊脂糖凝膠中，電泳。紫外投射儀下拍照。

1.4.3釉原蛋白免疫組化染色 接種于24孔板玻片上培養(yǎng)5 d后，PBS洗3次，40 g/L多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次，1 mL/L Triton-X孵育20 min，PBS洗3次，室溫下50 mL/L BSA封閉15 min。釉原蛋白一抗4 ℃孵育，過(guò)夜，PBS洗3次，加二抗，37 ℃孵育20 min，棄二抗，PBS漂洗，DAB顯色，自來(lái)水沖洗，蘇木素復(fù)染，自來(lái)水沖洗。800、900、950 mL/L、無(wú)水乙醇梯度脫水。二甲苯透明。中性樹(shù)膠封片、拍照。

1.5 倒置顯微鏡觀察低鈣環(huán)境下成釉細(xì)胞形態(tài)變化標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細(xì)胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后倒置顯微鏡觀察低鈣微環(huán)境下成釉細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.6 MTT檢測(cè)低鈣環(huán)境下成釉細(xì)胞增殖情況標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細(xì)胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，每組6孔，并設(shè)置空白組。培養(yǎng)44 h后，加入MTT液，與原培養(yǎng)液共培養(yǎng)4 h后，吸出混合液，加入150 μL DMSO，酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀上讀取吸光度值，記錄并分析結(jié)果。

1.7 流式細(xì)胞儀Annexin V-PI法檢測(cè)低鈣環(huán)境下成釉細(xì)胞凋亡情況標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細(xì)胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、0.6、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后對(duì)凋亡細(xì)胞進(jìn)行測(cè)定。2.5 g/L胰酶消化細(xì)胞并離心收集細(xì)胞，Binding Buffer懸浮細(xì)胞，加5 μL Annexin V-FITC，混勻，室溫避光10 min，加入 Propidium Iodide，冰浴5 min，混勻。上流式細(xì)胞儀檢測(cè)并分析結(jié)果。

1.8 Real time-PCR檢測(cè)低鈣環(huán)境下成釉細(xì)胞釉原蛋白和KLK4 mRNA表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)成釉細(xì)胞5 d后，分別加入含Ca2+濃度為0、1.2 mmoL/L的DMEM培養(yǎng)基及100 mL/L胎牛血清，48 h后提取細(xì)胞總RNA并進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，具體步驟同實(shí)驗(yàn)一。按表1體系在冰上配制反應(yīng)液。上機(jī)，94 ℃×30 s預(yù)變性；PCR反應(yīng)，循環(huán)40次，95 ℃×5 s→60 ℃×30 s。IQ5軟件分析溶解曲線，記錄數(shù)據(jù)。

表1 Q-PCR反應(yīng)體系Tab.1 Q-PCR reaction system

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)經(jīng)檢驗(yàn)符合正態(tài)分布，Levene’s 法檢驗(yàn)數(shù)據(jù)方差齊性，MTT和Annexin V-PI實(shí)驗(yàn)采用單因素方差分析對(duì)組間的均數(shù)進(jìn)行比較，采用Tukey’s 檢驗(yàn)進(jìn)行組間兩兩比較，Real time-PCR 采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 成釉細(xì)胞形態(tài)及鑒定體外標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后，HE染色顯示細(xì)胞聚集成簇、呈鋪路樣排列，細(xì)胞呈圓形、卵圓形及不規(guī)則多邊形，細(xì)胞胞核藍(lán)染(圖1A)；RT-PCR結(jié)果顯示釉原蛋白、KLK4均有特異性條帶(圖1B)；釉原蛋白免疫組化可見(jiàn)較多的細(xì)胞胞質(zhì)染色呈棕黃色(圖1C)。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d后成釉細(xì)胞的形態(tài)及其鑒定Fig.1 Morphology and identification of ameloblasts cultured in standard DMEM medium for five daysA：HE染色(×40)；B：RT-PCR；C：釉原蛋白免疫組化染色(×40)。

2.2 低鈣對(duì)成釉細(xì)胞形態(tài)的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，倒置顯微鏡下顯示各組細(xì)胞主要呈圓形、卵圓形及不規(guī)則多邊形(圖2)；1.2 mmoL/L Ca2+組較0 mmoL/L和0.6 mmoL/L Ca2+組有較多細(xì)胞胞核密度較高、透光性差(圖2A中黑色箭頭)及高柱狀細(xì)胞(圖2A中紅色箭頭)。

圖2 倒置顯微鏡下觀察低鈣對(duì)成釉細(xì)胞形態(tài)影響Fig.2 The effect of low-level calcium on the morphology of ameloblasts observed under inverted microscope (×40)A：1.2 mmoL/L Ca2+組；B：0.6 mmoL/L Ca2+組；C：0 mmoL/L Ca2+組。

2.3 低鈣對(duì)成釉細(xì)胞增殖活力的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48h后，MTT顯示，與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細(xì)胞增殖活性增加，組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖3)。兩兩比較，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細(xì)胞增殖活性均高于1.2 mmoL/L Ca2+組(P<0.01，圖3)。

圖3 MTT 檢測(cè)低鈣對(duì)成釉細(xì)胞增殖活力的影響Fig.3 The effect of low-level calcium on the proliferation of ameloblasts detected by MTT assay與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.01。

2.4 低鈣對(duì)成釉細(xì)胞凋亡的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，Annexin V-PI凋亡檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，0、0.6 mmoL/L Ca2+組細(xì)胞凋亡百分率下降，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。兩兩比較，1.2 mmoL/L Ca2+組與0 mmoL/L Ca2+組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，圖4)。

圖4 Annexin V-PI檢測(cè)低鈣對(duì)成釉細(xì)胞凋亡的影響Fig.4 Effect of low-level calcium on ameloblast apoptosis detected by Annexin V-PI與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.05。

2.5 低鈣對(duì)成釉細(xì)胞釉原蛋白及KLK4 mRNA表達(dá)的影響低Ca2+DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h后，Real time-PCR結(jié)果顯示，與1.2 mmoL/L Ca2+組比較，0 mmoL/L Ca2+組細(xì)胞釉原蛋白及KLK4的mRNA表達(dá)均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，圖5)。

圖5 Real-time PCR 檢測(cè)低鈣對(duì)成釉細(xì)胞釉原蛋白及KLK4 mRNA表達(dá)的影響Fig.5 Real-time PCR was used to detect the effect of low-level calcium on the expressions of amelogenin and KLK4 mRNA in ameloblasts與1.2 mmoL/L Ca2+組相比，*P<0.01，**P<0.001。

3 討 論

鈣缺乏可能參與釉質(zhì)礦化不全及加重氟中毒，然而，低鈣環(huán)境下成釉細(xì)胞生物學(xué)特性的變化目前尚不完全清楚。本課題組研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的鈣可能促進(jìn)成釉細(xì)胞樣細(xì)胞LS8細(xì)胞的分化[10]；本研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，低濃度的鈣促進(jìn)原代大鼠成釉細(xì)胞增殖并降低釉原蛋白和KLK4 在mRNA水平的表達(dá)，提示鈣缺乏可能抑制原代成釉細(xì)胞的分化。

牙釉質(zhì)的形成礦化是在成釉細(xì)胞調(diào)控下完成的。成釉細(xì)胞在分化中主要經(jīng)歷分泌期、轉(zhuǎn)化期、成熟期3個(gè)階段。分泌期成釉細(xì)胞呈高柱狀，分泌釉原蛋白等釉基質(zhì)蛋白和基質(zhì)金屬蛋白酶20(MMP20)。釉基質(zhì)蛋白作為有機(jī)模板誘導(dǎo)鈣等無(wú)機(jī)物礦化成核，使釉質(zhì)晶體在長(zhǎng)度方向生長(zhǎng)完成[11]。此后，成釉細(xì)胞分化進(jìn)入轉(zhuǎn)化期，細(xì)胞變矮，開(kāi)始分泌絲氨酸蛋白酶(KLK4)，KLK4水解釉原蛋白。短暫的轉(zhuǎn)化期后，成釉細(xì)胞進(jìn)入成熟期，細(xì)胞高度進(jìn)一步變矮，并分泌KLK4，水解、吸收釉基質(zhì)蛋白，轉(zhuǎn)運(yùn)鈣、磷等礦物鹽在晶核周?chē)?，促進(jìn)釉質(zhì)晶體在寬度和厚度方向增長(zhǎng)，調(diào)控釉質(zhì)礦化成熟[12]?？梢?jiàn)，釉原蛋白由分泌期成釉細(xì)胞表達(dá)，KLK4由轉(zhuǎn)化期和成熟期成釉細(xì)胞合成分泌[12]。本研究通過(guò)RT-PCR在mRNA水平對(duì)體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，標(biāo)準(zhǔn)DMEM體外培養(yǎng)5 d的牙源性上皮細(xì)胞中釉原蛋白及KLK4 mRNA均顯示有特異性條帶。釉原蛋白免疫組化結(jié)果顯示，部分細(xì)胞釉原蛋白染色陽(yáng)性。免疫組化及RT-PCR結(jié)果說(shuō)明，本研究所培養(yǎng)的細(xì)胞包含分泌期、轉(zhuǎn)化期及成熟期成釉細(xì)胞。

標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基的總鈣量為1.8 mmoL/L，采用電解質(zhì)分析儀對(duì)標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基中的Ca2+濃度測(cè)定發(fā)現(xiàn)其Ca2+濃度為1.2 mmoL/L，因此，本研究定制了無(wú)鈣DMEM培養(yǎng)基，并在此無(wú)鈣培養(yǎng)基中添加CaCl2，配置了含Ca2+濃度為0、0.6 mmoL/L的低鈣培養(yǎng)基及含Ca2+濃度為1.2 mmoL/L 的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基。細(xì)胞在標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)5 d后，低鈣干預(yù)后，隨著鈣濃度的降低，細(xì)胞體積較1.2 mmoL/L 的標(biāo)準(zhǔn)DMEM培養(yǎng)基小，且細(xì)胞中柱狀細(xì)胞較對(duì)照組少見(jiàn)，提示低Ca2+對(duì)體外培養(yǎng)成釉細(xì)胞形態(tài)可能有一定的影響。細(xì)胞活性檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，與1.2 mmoL/L組相比，0 mmoL/L Ca2+組及0.6 mmoL/L Ca2+組細(xì)胞增殖活性增加，凋亡減少，提示降低培養(yǎng)基中Ca2+對(duì)成釉細(xì)胞增殖活性有明顯促進(jìn)作用。這與國(guó)外的研究報(bào)道結(jié)果相似：隨著培養(yǎng)基中Ca2+濃度降低成釉細(xì)胞增殖增加[13]。因此，低鈣可促進(jìn)原代成釉細(xì)胞的增殖活性。

本研究中，低鈣DMEM培養(yǎng)基干預(yù)后，與1.2 mmoL/L Ca2+組比較，0 mmoL/L鈣組成釉細(xì)胞釉原蛋白及KLK4的mRNA表達(dá)水平下調(diào)，提示低鈣可能影響成釉細(xì)胞中釉原蛋白和KLK4 基因的表達(dá)。本研究中釉原蛋白mRNA表達(dá)水平下調(diào)與CHEN等[13]研究結(jié)果相似，增加培養(yǎng)基中Ca2+濃度釉原蛋白mRNA及蛋白水平均上調(diào)。然而，低鈣導(dǎo)致釉原蛋白、KLK4 mRNA表達(dá)水平下調(diào)的具體調(diào)節(jié)機(jī)制仍待研究。有研究推測(cè)，Ca2+對(duì)釉原蛋白表達(dá)的影響可能通過(guò)Ca2+直接作用于釉原蛋白啟動(dòng)子，或者Ca2+通過(guò)某一信號(hào)通路直接參與釉原蛋白的表達(dá)導(dǎo)致[13]。成釉蛋白由分泌期成釉細(xì)胞表達(dá)，KLK4主要由成熟期成釉細(xì)胞表達(dá)，成釉細(xì)胞在分泌前期及分泌期增殖活力較強(qiáng)，有約1/4成釉細(xì)胞在轉(zhuǎn)化期凋亡，又有1/4細(xì)胞在成熟期凋亡，即隨著成釉細(xì)胞的分化，細(xì)胞增殖活力減弱[14]。結(jié)合本研究中低鈣促進(jìn)細(xì)胞增殖，低鈣下調(diào)成釉細(xì)胞釉原蛋白和KLK4 mRNA表達(dá)，推測(cè)鈣缺乏環(huán)境可能抑制成釉細(xì)胞的分化：相對(duì)于正常鈣水平組，部分成釉細(xì)胞未能從分泌前期分化進(jìn)入分泌期，且部分分泌期成釉細(xì)胞未能分化進(jìn)入轉(zhuǎn)化期和成熟期。

綜上,本研究通過(guò)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)了低鈣影響原代大鼠成釉細(xì)胞細(xì)胞形態(tài)、增殖活力、凋亡及特異性基因表達(dá)，提示低鈣可能造成的成釉細(xì)胞分化延遲，進(jìn)而影響釉質(zhì)礦化成熟。本研究結(jié)果為補(bǔ)鈣拮抗氟牙癥、釉質(zhì)礦化不全增加了理論基礎(chǔ)。然而，尚需動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證上述研究結(jié)果。