李傳坤，王 偉，姜海濤，何雅玲

(1. 西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，陜西西安 710061；2.西安交通大學(xué)能源與動(dòng)力工程學(xué)院，陜西西安 710049)

膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma, GBM)是成人中常見(jiàn)的腦腫瘤，侵襲性高，約占所有神經(jīng)膠質(zhì)瘤的69%[1]。GBM的常規(guī)治療包括神經(jīng)外科手術(shù)、放射療法和化學(xué)療法，但這些治療方法仍不能有效控制疾病，患者預(yù)后較差，中位生存期為12～18個(gè)月[2]。因此，更好地了解GBM細(xì)胞侵襲和增殖的分子機(jī)制對(duì)于開(kāi)發(fā)更有效的GBM治療靶標(biāo)至關(guān)重要。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase, DNMT)是一種負(fù)責(zé)DNA甲基化的主要酶，其在各種人類(lèi)癌癥如結(jié)腸癌、子宮內(nèi)膜癌和前列腺癌中被上調(diào)[3-4]，DNMT異常表達(dá)已被證明可促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[5]。此外，有研究報(bào)道，DNMT在良性腦膜瘤細(xì)胞和軟腦膜細(xì)胞中調(diào)節(jié)2型神經(jīng)纖維瘤病(NF2)基因的甲基化，從而調(diào)控細(xì)胞存活、運(yùn)動(dòng)性和侵襲性[6]。

MicroRNA(miRNA)是具有20～23個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼RNA，通過(guò)直接靶向信使RNA(mRNA)的3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)來(lái)調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。越來(lái)越多的研究表明，miRNA通過(guò)調(diào)節(jié)DNMT參與了異常的DNA甲基化。例如，miR-185通過(guò)靶向DNMT1參與卵巢癌的進(jìn)展[7]。最近研究顯示，miR-139-5p在復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移的甲狀腺癌患者中表達(dá)下調(diào)，并且是患者預(yù)后的潛在標(biāo)志物[8]；下調(diào)miR-139-5p通過(guò)調(diào)節(jié)SOX5促進(jìn)前列腺癌的進(jìn)展[9]；miR-139通過(guò)調(diào)節(jié)VEGFR及其下游信號(hào)通路抑制食管癌的進(jìn)展[10]；此外，miR-139-5p通過(guò)靶向神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的ZEB1和ZEB2抑制癌細(xì)胞的遷移[11]。其他研究報(bào)道，在神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者組織和神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中miR-139被下調(diào)，而上調(diào)miR-139的表達(dá)可抑制Mcl-1并增強(qiáng)TMZ誘導(dǎo)的神經(jīng)膠質(zhì)瘤凋亡[12]。但是，在GBM中miR-139-5p和DNMT1之間的相關(guān)性及其在GBM發(fā)生中的作用尚不清楚。本研究調(diào)查了miR-139-5p對(duì)GBM細(xì)胞侵襲性的調(diào)節(jié)作用，并探討了miR-139-5p對(duì)DNMT1的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 藥品和試劑Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，Lipofectamine 2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，靶向DNMT1的siRNA、miR-139-5p模擬物及相應(yīng)的陰性對(duì)照均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成，Trizol試劑購(gòu)自日本TaKaRa公司，BestarTMqPCR RT試劑盒購(gòu)自美國(guó)Applied Biosystems公司，BCA蛋白測(cè)定試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，PVDF膜購(gòu)自美國(guó)Millipore公司，DNMT1、NF2和GAPDH一抗購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光溶液購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，F(xiàn)ITC標(biāo)記的Annexin V/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)購(gòu)自廣州市銳博生物科技有限公司，DAB顯色液購(gòu)自武漢博士德生物工程有限公司，Matrigel Transwell購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 GBM組織收集從西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院接受根治性切除術(shù)的患者中收集GBM組織和癌旁組織，將組織儲(chǔ)存在-80 ℃的冰箱中備用。本研究已獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，并取得了所有患者的知情同意。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系HEB和人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心。將細(xì)胞在含有100 mL/L FBS的Dulbecco改良的Eagle培養(yǎng)基中，并在50 mL/L CO2的37 ℃潮濕環(huán)境中培養(yǎng)。將U251細(xì)胞以5×105/孔的密度接種在6孔板中。使用Lipofectamine 2000將靶向DNMT1的siRNA(DNMT1-siRNA)(5′-UGUGCUGUAAAUCUAACAACAAGGUCGAGCUUAAACAGA-3′)或陰性對(duì)照siRNA(NC-siRNA)轉(zhuǎn)染U251細(xì)胞。通過(guò)轉(zhuǎn)染miR-139-5p模擬物(miR-139-5p mimic)來(lái)上調(diào)U251細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)，轉(zhuǎn)染NC-mimic作為模擬物對(duì)照。轉(zhuǎn)染約48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)基因表達(dá)使用Trizol試劑從U251細(xì)胞或組織樣品中提取總RNA，用BestarTMqPCR RT試劑盒反轉(zhuǎn)錄總RNA(1 μg)，使用Bestar?SybrGreen qPCR(德國(guó)DBI Bioscience公司)在Mx3000P/3005P實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀(美國(guó)安捷倫公司)上對(duì)mRNA和miRNA的水平進(jìn)行定量。引物序列如下：miR-139-5p，正向ATCCACACCTGGAGTTGACAGCTGGTGCAAG，反向CTTGGCAACGTGGGTGTGCTCAATCGACCAAT；DNMT1，正向GAGACGCAACCGTGCACCACCAAG，反向CAGCTCACATGGACTCTTTCAGACCTCCA；NF2，正向CCCCTGTCTTACGGCAACTCCAAACTC，反向AGCCAGGTTTAGCCTGCCCACACTG。U6和β-actin用作內(nèi)部對(duì)照。使用2-ΔΔCt方法計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)量。

1.5 Western blotting檢測(cè)蛋白表達(dá)用PBS洗滌后，將組織和細(xì)胞裂解并在4 ℃下以10 000 g離心10 min。使用BCA蛋白測(cè)定試劑盒確定蛋白質(zhì)濃度。在100 mL/L SDS-PAGE上分離等量的蛋白質(zhì)，再轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。在室溫下用50 mL/L脫脂牛奶在TBST中封閉2 h后，將膜與DNMT1(1∶1 000稀釋)、NF2(1∶1 000稀釋)和GAPDH(1∶1 500稀釋)在4 ℃下過(guò)夜孵育，然后用辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合的抗兔或抗鼠二抗室溫孵育1 h。使用增強(qiáng)的化學(xué)發(fā)光溶液將蛋白質(zhì)可視化。

1.6 細(xì)胞凋亡測(cè)定根據(jù)制造商的說(shuō)明，使用FITC標(biāo)記的Annexin V/碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒對(duì)U251細(xì)胞凋亡進(jìn)行測(cè)定。染色后立即使用美國(guó)Beckman流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。

1.7 細(xì)胞增殖測(cè)定將U251細(xì)胞以2 000/孔的密度接種在96孔板中并培養(yǎng)24 h。根據(jù)制造商的說(shuō)明，細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8(CCK-8)測(cè)定細(xì)胞增殖。使用分光光度計(jì)在450 nm處測(cè)定吸光度值。

1.8 免疫組織化學(xué)分析將GBM組織和癌旁組織用福爾馬林固定并包埋在石蠟中，將組織切片(厚度為4 μm)脫蠟并再水化后，在檸檬酸鹽緩沖液中進(jìn)行微波抗原回收。冷卻后，在室溫下用30 g/L過(guò)氧化氫阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性5 min。將切片在室溫下用50 mL/L山羊血清封閉30 min，并在4 ℃下與NF2(1∶1 000稀釋)或DNMT1(1∶1 000稀釋)一抗孵育過(guò)夜。用含0.5 mL/L Tween 20的PBS洗滌后，將切片與熒光素結(jié)合的山羊抗兔或山羊抗鼠二抗在室溫孵育30 min。PBS洗滌后，使用DAB顯色。

1.9 免疫熒光染色用PBS沖洗處理的細(xì)胞，再用40 g/L多聚甲醛固定1 h。PBS沖洗后，將細(xì)胞在冰上用1 mL/L Triton X-100透化5 min，然后用PBS洗滌3次。用10 mL/L牛血清白蛋白封閉30 min，將細(xì)胞在4 ℃下與DNMT1(1∶1 000稀釋)和NF2(1∶1 000稀釋)一抗孵育過(guò)夜。隨后與FITC標(biāo)記的驢抗兔IgG(1∶1 000稀釋)室溫孵育1 h。在室溫下用DAPI染色液復(fù)染2 min，然后進(jìn)行顯微鏡觀察。

1.10 細(xì)胞侵襲測(cè)定使用Matrigel Transwell評(píng)估U251細(xì)胞的侵襲性。將U251細(xì)胞以5×105細(xì)胞/孔接種在6孔板中12 h。隨后，將細(xì)胞在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h，然后以2×104/孔的密度接種到含有100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基且預(yù)先涂有Matrigel基質(zhì)膠的上室中。在下室中添加700 μL含100 mL/L FBS的完全培養(yǎng)基。48 h后，將細(xì)胞用40 g/L多聚甲醛固定并用結(jié)晶紫染色。通過(guò)計(jì)數(shù)6個(gè)視野(×200)的侵襲細(xì)胞數(shù)量來(lái)量化侵襲能力。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析SPSS 18.0軟件用于數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miR-139-5p、DNMT1、NF2在GBM腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)qRT-PCR結(jié)果顯示(圖1A)，與癌旁組織相比，GBM腫瘤組織中miR-139-5p的表達(dá)水平明顯被抑制(P<0.05)。此外，人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251中miR-139-5p的表達(dá)水平也低于人正常神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系HEB(圖1G，P<0.05)。此外，qRT-PCR(圖1B、圖1C、圖1H和圖1I)、免疫組化(圖1D)和Western blotting(圖1E和圖1F)結(jié)果也顯示，腫瘤組織和U251細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)水平被上調(diào)，而NF2被下調(diào)(P<0.05)。

圖1 miR-139-5p、DNMT1、NF2在GBM腫瘤組織和細(xì)胞系中的表達(dá)Fig.1 Expressions of miR-139-5p, DNMT1 and NF2 in glioblastoma tumor tissues and cell lines

2.2 上調(diào)miR-139-5p抑制U251細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)并促進(jìn)NF2的表達(dá)轉(zhuǎn)染miR-139-5p模擬物后，U251細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)被上調(diào)(圖2A，P<0.05)。免疫熒光分析顯示，DNMT1主要定位于細(xì)胞核(圖2D)。此外，qRT-PCR(圖2B和圖2C)、Western blotting(圖2E)和免疫熒光分析(圖2D)均顯示，轉(zhuǎn)染miR-139-5p模擬物明顯抑制了U251細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)但上調(diào)了NF2的表達(dá)(P<0.05)。

圖2 上調(diào)miR-139-5p抑制U251細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)并促進(jìn)NF2的表達(dá)Fig.2 Upregulation of miR-139-5p inhibited the expression of DNMT1 and promoted the expression of NF2 in U251 cellsA～C：qRT-PCR分析U251細(xì)胞中miR-139-5p、DNMT1和NF2的表達(dá)；D：免疫熒光分析結(jié)果；E：Western blotting分析結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.3 下調(diào)DNMT1促進(jìn)U251細(xì)胞中NF2的表達(dá)轉(zhuǎn)染靶向DNMT1的siRNA后，U251細(xì)胞中DNMT1的表達(dá)被抑制(圖3B，P<0.05)。下調(diào)DNMT1并不會(huì)影響miR-139-5p的表達(dá)(圖3A，P>0.05)。免疫熒光分析顯示，NF2主要定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核(圖3D)。qRT-PCR(圖3C)、Western blotting(圖3E)和免疫熒光分析(圖3D)均顯示，轉(zhuǎn)染靶向DNMT1的siRNA明顯上調(diào)了U251細(xì)胞中NF2的表達(dá)(P<0.05)。

圖3 下調(diào)DNMT1不影響U251細(xì)胞中miR-139-5p的表達(dá)但促進(jìn)NF2的表達(dá)Fig.3 Downregulation of DNMT1 did not affect the expression of miR-139-5p in U251 cells but promoted the expression of NF2A～C：qRT-PCR分析U251細(xì)胞中miR-139-5p、DNMT1和NF2的表達(dá)；D：免疫熒光分析結(jié)果；E：Western blotting分析結(jié)果。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

2.4 上調(diào)miR-139-5p誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞侵襲在培養(yǎng)48和72 h后，轉(zhuǎn)染miR-139-5p模擬物組的U251細(xì)胞的活力明顯低于對(duì)照組(圖4C，P<0.05)。轉(zhuǎn)染miR-139-5p模擬物明顯促進(jìn)了U251細(xì)胞的凋亡并抑制了細(xì)胞的侵襲能力(圖4A，圖4B，P<0.05)。

圖4 上調(diào)miR-139-5p對(duì)U251細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響Fig.4 The effects of up-regulated miR-139-5p on proliferation, apoptosis and invasion of U251 cellsA：流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡；B：Matrigel Transwell評(píng)估細(xì)胞侵襲(×200)；C：CCK-8法測(cè)定細(xì)胞活力。與對(duì)照組比較，*P<0.05。

A～C：qRT-PCR分析腫瘤組織和癌旁組織中miR-139-5p、DNMT1和NF2的表達(dá)；D：免疫組化分析結(jié)果(×200)；E、F：Western blotting結(jié)果；G～I(xiàn)：RT-PCR分析HEB和U251細(xì)胞中miR-139-5p、DNMT1和NF2的表達(dá)。與癌旁組織或HEB細(xì)胞比較，*P<0.05。

2.5 下調(diào)DNMT1誘導(dǎo)U251細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞侵襲在培養(yǎng)48和72 h后，DNMT1-siRNA組的U251細(xì)胞的活力明顯低于對(duì)照組(圖5C，P<0.05)。與對(duì)照組相比，DNMT1-siRNA組的細(xì)胞凋亡率明顯升高，而細(xì)胞侵襲率明顯降低(圖5A，圖5B，P<0.05)。

3 討 論

GBM的高復(fù)發(fā)率和化療耐藥性導(dǎo)致患者的預(yù)后非常不理想，目前急需要探索新的有效治療靶點(diǎn)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，GBM可以通過(guò)不同的機(jī)制誘導(dǎo)。眾所周知，DNA甲基化可導(dǎo)致腫瘤抑制因子和致癌基因的沉默，GBM中已觀察到異常甲基化。DNA甲基化是在DNMT作用下在基因組CpG二核苷酸的胞嘧啶5′碳位共價(jià)鍵結(jié)合一個(gè)甲基基團(tuán)[5]。由于這種表觀遺傳變化可能是可逆的，因此DNA甲基化是抗癌治療的潛在靶標(biāo)。實(shí)際上，DNA去甲基化藥物已獲得美國(guó)食品藥品管理局(FDA)的批準(zhǔn)，可用于治療骨髓增生異常綜合征和骨髓性白血病。

2型神經(jīng)纖維瘤病(NF2)基因是一種腫瘤抑制基因，NF2蛋白充當(dāng)跨膜蛋白和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間的連接子，并調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架重塑[13]。NF2屬于FERM蛋白家族，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)黏附、細(xì)胞增殖、存活和侵襲性的信號(hào)傳導(dǎo)途徑[14]，NF2的下調(diào)是GBM高轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)的關(guān)鍵因素。據(jù)報(bào)道，NF2的活性受多種機(jī)制調(diào)節(jié)[15]。本研究證實(shí)，GBM中的NF2明顯下調(diào)，而DNMT1明顯上調(diào)。U251是人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞，通常用于GBM的體外研究。與GBM腫瘤組織中的發(fā)現(xiàn)一致，U251細(xì)胞中NF2和DNMT1的水平分別降低和升高。

有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，DNMT1在良性腦膜瘤細(xì)胞和軟腦膜細(xì)胞中靶向調(diào)節(jié)NF2[6]，然而，尚不清楚DNMT1是否通過(guò)調(diào)節(jié)NF2的表達(dá)從而參與腫瘤細(xì)胞行為學(xué)的調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，下調(diào)DNMT1可上調(diào)NF2的表達(dá)，誘導(dǎo)GBM細(xì)胞的凋亡并抑制細(xì)胞侵襲，推測(cè)DNMT1通過(guò)負(fù)調(diào)控NF2的表達(dá)影響GBM的細(xì)胞行為。

miRNA的異常參與各種致病過(guò)程[16]。此外，越來(lái)越多的證據(jù)表明，GBM中存在具有抗癌特性的多種miRNA[17]。miR-139-5p已被證明可在多種腫瘤中發(fā)揮抗癌作用，在核型正常的急性髓細(xì)胞白血病中miR-139-5p特異性下調(diào)了FLT3的突變，并發(fā)揮抑癌作用[9]。miR-139通過(guò)靶向IGF-1R、AMY-1和PGC-1β來(lái)抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤進(jìn)展[18]。而且，miR-139-5p可以通過(guò)靶向NOTCH-1使大腸癌細(xì)胞對(duì)5-氟尿嘧啶敏感[19]。目前尚不清楚miR-139-5p對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中NF2和DNMT1是否具有調(diào)控作用。本研究發(fā)現(xiàn)，GBM腫瘤組織和細(xì)胞系中miR-139-5p被明顯下調(diào)，上調(diào)miR-139-5p可抑制DNMT1的表達(dá)并促進(jìn)NF2的表達(dá)，促進(jìn)了GBM細(xì)胞系的凋亡并抑制其侵襲能力，說(shuō)明miR-139-5p通過(guò)靶向DNMT1來(lái)調(diào)控腫瘤細(xì)胞行為。

綜上所述，本研究表明，miR-139-5p在GBM中發(fā)揮抗癌作用，miR-139-5p通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控DNMT1來(lái)抑制腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。此外，在GBM中，DNMT1通過(guò)負(fù)調(diào)控腫瘤抑制基因NF2來(lái)影響腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲。因此，miR-139-5p、DNMT1和NF2均是GBM的潛在分子治療靶點(diǎn)。