游麗萍，謝發(fā)江，馮 健，蘭 卓，何夕松，李亞菲，李家富

(西南醫(yī)科大學附屬醫(yī)院心內科，四川瀘州 646000)

糖尿病心肌病(diabetic cardiomyopathy, DCM)是在沒有血壓異常和冠狀動脈疾病伴隨情況下由糖尿病引起的心臟結構和功能異常。在糖尿病心臟組織中，巨噬細胞受局部微環(huán)境的影響分化為不同表型并向環(huán)境中分泌不同細胞因子，發(fā)揮不同功能，這一過程稱之為巨噬細胞極化[1]。在DCM中，主要分化為促炎型巨噬細胞(M1型)和抗炎型巨噬細胞(M2型)兩種類型，小分子G蛋白RhoA和其下游效應分子Rho激酶(ROCK)參與調節(jié)多種細胞功能，包括細胞生長、基因表達和細胞骨架重組[2]。研究發(fā)現(xiàn)RhoA/ROCK信號通路過度激活是DCM心肌纖維化的關鍵機制之一[3]。在1型糖尿病小鼠模型中，ROCK抑制劑法舒地爾(F)可能通過抑制M1型極化、誘導M2型極化進而減輕DCM心肌纖維化[4]。進一步體外研究發(fā)現(xiàn)，高糖通過激活RhoA/ROCK信號通路刺激巨噬細胞向M1型活化并產生炎性細胞因子。

柚皮素(naringenin, NAR)是柑橘類植物中主要的黃烷酮類化合物。研究發(fā)現(xiàn)，NAR能夠下調RhoA/ROCK信號通路，改善1型糖尿病小鼠心肌纖維化，保護心臟功能[5]，但其是否可通過RhoA/ROCK信號通路調控巨噬細胞極化尚不明確。本研究通過高糖條件下培養(yǎng)RAW264.7細胞模擬糖尿病高糖環(huán)境，并予以NAR干預后觀察巨噬細胞極化表型，探討NAR影響巨噬細胞極化的潛在機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料、藥品與試劑

1.1.1實驗細胞株 RAW264.7細胞來源于美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)。

1.1.2主要實驗試劑 C3 transferases protein購自Cytoskeleton公司，Murine IFN-γ購自Peprotech公司，LG-DMEM、胎牛血清購自美國 Gibco公司；DMSO購自美國Sigma公司，柚皮素標準品、鹽酸法舒地爾、甘露醇、D-無水葡萄糖購自上海思域化工科技有限公司；一氧化氮合酶(NOS)分型測試盒購自南京建成有限公司，LG-DMEM培養(yǎng)基、細胞計數(shù)試劑盒(Cell Counting Kit-8, CCK-8)購自日本DOJINDO公司；BCA蛋白濃度測試試劑盒購自武漢阿斯本公司；抗腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、白細胞介素(IL)-6和IL-10抗體均購自美國Bioworld Technology公司；抗CD80和CD206抗體均購自美國Biolegend公司，抗RhoA抗體、ROCK1、抗ROCK2抗體均購自英國Abcam公司，抗p-MYPT1 Thr853 、iNOS和Arginase-1(Arg-1)抗體均購自美國CST公司；抗MYPT1購自Proteintech公司，抗β-actin抗體、山羊抗兔Ⅱ抗和山羊抗鼠Ⅱ抗購自英國Abcam公司。

1.1.3實驗儀器 Cytomat 10C細胞培養(yǎng)箱、TSE400D超低溫冰箱、DR-200Bs全波長酶標儀、Multifuge X3臺式超速離心機、Micro CL冷凍離心機、9700 PCR儀均為Diatek公司產品；GNP9160恒溫培養(yǎng)箱為上海精宏實驗設備有限公司；HH-4型恒溫水浴鍋、sw-cj-2f型超凈工作臺均為蘇州凈化公司產品；倒置生物顯微鏡為OLYMPUS公司產品；DYY-6C型電泳儀為北京六一儀器廠公司產品；FACS Calibur流式儀為美國Becton-Dickinson公司產品。

1.2 實驗方法

1.2.1RAW264.7細胞的培養(yǎng)及iNOS活性測定 以100 mL/L FBS、10 g/L青霉素/鏈霉素、1 g/L葡萄糖的LG-DMEM培養(yǎng)液為完全培養(yǎng)基，細胞在37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。以第4代、第5代傳代細胞為實驗對象，為模擬巨噬細胞在DCM體內的表型，RAW264.7細胞在含不同濃度葡萄糖(1、2、4、5、6 g/L)DMEM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)不同時間(0、12、24、48 h)；以1 g/L葡萄糖為普通培養(yǎng)條件，100 U/mL IFN-γ[6]處理RAW264.7細胞誘導其分化為M1型巨噬細胞；37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)細胞，分別在以上時間點檢測細胞內誘導型一氧化氮合酶(iNOS)活性：取出RAW264.7，PBS洗滌細胞2～3次，離心收集細胞懸液，用2 mL玻璃勻漿器破碎細胞，取破碎好的勻漿液收集于EP管中，取上清液50 μL按照測試盒說明書測定iNOS活性，同時測定樣本蛋白濃度。

1.2.2NAR的配制及毒性檢測 取適量NAR粉末溶于二甲基亞砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶劑中，配置成濃度為20 mmol/L保存液，在-20 ℃條件下保存。使用時用培養(yǎng)基稀釋配制成所需濃度，并且保證DMSO最終在培養(yǎng)基中濃度不超過0.1%。

RAW264.7細胞按每孔10 000個細胞接種于96孔板，于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中孵育過夜。按照CCK-8試劑盒說明書，加入含不同終濃度的NAR(0、20、40、60、80、100 μmol/L)DMEM培養(yǎng)液處理24 h，每孔加入10 μL CCK-8溶液培養(yǎng)4 h，用酶標儀測定450 nm波長下吸光度(A)。根據(jù)以下公式計算細胞存活率百分比：細胞存活率(%)=(A處理組/A對照組)×100%。每個濃度的樣本設立5個重復孔，篩選出實驗所需NAR合適的濃度以排除其毒性作用而導致實驗結果的誤差。

1.2.3實驗分組及給藥方法 LG-DMEM、HG-DMEM分別為含1、5 g/L葡萄糖的培養(yǎng)基，取傳代3～4代的RAW264.7細胞接種于6孔板(每孔約2×105個細胞)，對照組分為正常對照(NG)和滲透壓對照(NG+M)，NG組加入2 mL LG-DMEM，以LG-DMEM為稀釋液配制濃度為4 g/L甘露醇(mannitol，M)混合液，NG+M組加入2 mL甘露醇混合液；藥物處理前用HG-DMEM作稀釋液分別配制濃度為60 μmol/L NAR、30 μmol/L法舒地爾[7]、2 μg/mL C3轉移酶[8]的混合液，HG組加入2 mL HG-DMEM，HG+NAR組加入2 mL NAR混合液，HG+F組加入2 mL法舒地爾混合液，HG+C3組加入2 mL C3轉移酶混合液；將6孔板置于37 ℃、50 mL/L CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)24 h，實驗重復3次。

1.2.4Western blotting檢測RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1、iNOS、Arg-1蛋白表達 用PBS緩沖液潤洗細胞2～3次，加入適當體積的RIPA裂解液(使用前數(shù)分鐘內加入蛋白酶抑制劑)提取總蛋白，使用BCA蛋白質濃度測定試劑盒測定樣品蛋白濃度。SDS-PAGE 凝膠電泳分離蛋白，根據(jù)樣品濃度確定上樣量，保證每個樣品總蛋白上樣量均為40 μg。按濃縮膠80 V、分離膠120 V進行恒壓電泳，切膠，300 mA恒流轉至PVDF膜，置于 50 g/L脫脂牛奶室溫封閉1 h，除去封閉液后抗RhoA、抗ROCK1、抗ROCK2、抗MYPT1、抗p-MYPT1、抗iNOS、抗Arg-1加入一抗稀釋液4 ℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min×3次；加入Ⅱ抗(1∶10 000)室溫孵育30 min，TBST洗膜5 min×4次，化學發(fā)光法定影顯色，將膠片進行掃描存檔，AlphaEaseFC件處理系統(tǒng)分析目標帶的吸光度值；實驗重復3次。

1.2.5ELISA法測定IL-6、TNF-α、IL-10濃度 收集細胞懸液，4 ℃、2 000 g×10 min離心，去不溶物，取上清-20 ℃保存?zhèn)溆?，按照ELISA試劑盒說明書測定IL-6、TNF-α、IL-10濃度。實驗重復3次。

1.2.6流式細胞術分選M1、M2巨噬細胞 為了鑒定細胞表型，細胞在冰冷的PBS中洗滌3次，然后用FITC-抗鼠CD80、FITC-抗鼠CD206、PE-抗鼠iNOS、PE-抗鼠Arg-1抗體標記；在4 ℃下孵育20 min，用流式細胞儀分析標記細胞(Becton-Dickinson，圣何塞，CA，美國)。實驗重復3次。

2 結 果

2.1 iNOS活性的檢測結果給予含不同葡萄糖質量濃度的DMEM完全培養(yǎng)液刺激后，隨質量濃度增加RAW264.7細胞內iNOS活性提高，在5 g/L葡萄糖及24 h時活性達最大值，大于5 g/L質量濃度時活性降低；與IFN-γ刺激巨噬細胞所繪得的折線圖相比較，5 g/L葡萄糖組的iNOS活性曲線與IFN-γ活性曲線最接近(圖1)，IFN-γ刺激巨噬細胞向M1型分化，提高細胞內iNOS活性，可以認為該葡萄糖質量濃度能最大程度刺激巨噬細胞分化。因此，選擇5 g/L葡萄糖作為本實驗的高糖刺激質量濃度，藥物干預時間為24 h。

圖1 葡萄糖不同劑量和各培養(yǎng)時間下RAW264.7的iNOS活性Fig.1 Activity of iNOS after RAW264.7 cultured with glucose at various dose and timeA：RAW264.7細胞內iNOS活性隨葡萄糖質量濃度變化的曲線；B：RAW264.7細胞內iNOS活性隨時間變化的曲線。n=3，與1 g/L對照組比較，*P<0.05。

2.2 NAR毒性的檢測結果與0 μmol/L組相比，NAR的濃度在20、40、60、80 μmol/L時對細胞活性影響差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，而當NAR濃度達100 μmol/L時，RAW264.7巨噬細胞活性下降(P<0.05，圖2)。因此，選擇以NAR濃度60 μmol/L作為下一步NAR干預實驗的濃度。

圖2 柚皮素對細胞活性的影響Fig.2 Effect of naringenin on cell viability

2.3 NAR下調RhoA/ROCK信號通路蛋白和iNOS蛋白表達并上調Arg-1蛋白表達RhoA/ROCK信號通路包括RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白，其中MYPT1為ROCK下游底物分子之一，p-MYPT1為MYPT1(Thr853)磷酸化，與NG相比，NG+M組無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖3)，排除滲透壓對實驗結果的影響，后述實驗結果不再贅述，n=3，與0 μmol/L組比較，*P<0.05。

HG組RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1表達增加，M1型標記分子iNOS表達增加，M2型標記分子Arg-1表達降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，圖3)；與HG組相比，HG+NAR組、HG+F組、HG+C3 transferase組RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1表達降低，M1型標記分子iNOS表達下降，M2型標記分子Arg-1表達增高(P<0.05，圖3)，HG+NAR組與陽性對照組之間差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05，圖3)。

圖3 Western blotting檢測各組RAW264.7細胞內RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT、p-MYPT、iNOS、Arg-1蛋白的表達及比較Fig.3 The protein levels of RhoA, ROCK1, ROCK2, MYPT, p-MYPT, iNOS and Arg-1 in different groups determined by Western blottingn=3，與NG組比較，*P<0.05；與HG組比較，#P<0.05。

2.4 NAR減少炎癥因子IL-6、TNF-α分泌并增加抗炎因子IL-10分泌與NG相比，HG組炎癥因子TNF-α、IL-6分泌增加，抗炎因子IL-10分泌減少(P<0.05)；與HG組相比，HG+NAR組、HG+F組、HG+C3 transferase組炎癥因子TNF-α、IL-6分泌降低，抗炎因子IL-10分泌增加(P<0.05)，HG+NAR組與陽性對照組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖4)。

圖4 ELISA檢測各組RAW264.7細胞分泌細胞因子TNF-α、IL-6和IL-10的變化及比較Fig.4 The cytokines levels of TNF-α, IL-6 and IL-10 in different groups determined by ELISAn=3，與NG組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與HG組比較，#P<0.05，##P<0.01。

2.5 NAR減少M1型巨噬細胞數(shù)量而增加M2型巨噬細胞數(shù)量且M1/M2比值降低與NG相比， HG組M1細胞數(shù)量增多，M2細胞數(shù)量減少，M1/M2比值增大，有統(tǒng)計學差異(P<0.05)；與HG組相比， HG+NAR、HG+F組、HG+C3 transferase組M1細胞數(shù)量減少，M2細胞數(shù)量增多，M1/M2比值減小(P<0.05)，HG+NAR組與陽性對照組之間無統(tǒng)計學差異(P>0.05，圖5)。

圖5 流式細胞儀檢測各組RAW264.7細胞極化表型Fig.5 The proportion of M1 and M2 in RAW264.7 detected by flow cytometryn=3, 與NG組比較，*P<0.05，**P<0.01; 與HG組比較，#P<0.05。

3 討 論

3.1 DCM巨噬細胞極化的研究現(xiàn)狀目前認為糖尿病及其并發(fā)癥是全身慢性低度炎癥性病變，DCM與心肌細胞肥大、壞死、凋亡、CFs增殖和間質區(qū)纖維膠原沉積增加有關，病理性纖維化嚴重影響心室順應性[9]，早期表現(xiàn)為舒張功能障礙，晚期出現(xiàn)收縮功能障礙[10]。在DCM中，血糖、血脂異常及巨噬細胞和淋巴細胞浸潤導致炎性因子分泌，促進細胞外基質(ECM)重塑和心肌纖維化，導致心臟炎癥-纖維化病理發(fā)展[11-13]。FANG等[14]在1型糖尿病小鼠模型中發(fā)現(xiàn)抑制小鼠體內促炎細胞因子、細胞黏附分子的產生有助于減輕糖尿病小鼠腎臟和心臟纖維化，保護糖尿病小鼠心腎功能；巨噬細胞是心臟組織的主要免疫細胞，參與心肌損傷后重構；新生心肌組織中駐留巨噬細胞主要來源于卵黃囊和胎兒單核祖細胞，通過原位增殖穿插分布在心肌細胞、肌成纖維細胞、內皮細胞中，駐留細胞發(fā)揮著維持穩(wěn)態(tài)、組織修復、血管生成、免疫監(jiān)督等作用，當心肌發(fā)生炎變或處于應激狀態(tài)時，血單核細胞募集到心臟組織中并受微環(huán)境影響誘導其增殖分化成為主要的巨噬細胞群[15]；與Th1/Th2命名法相似，巨噬細胞經(jīng)歷兩種不同的極化狀態(tài)：經(jīng)典激活的M1表型和選擇性激活M2表型，M1型可通過IFN-γ、脂多糖(LPS)、集落細胞刺激因子(GM-CS)等誘導分化，IL-4、IL-13、IL-33主要為M2型誘導因子；這些巨噬細胞早期主要分化為M1型，以無氧糖酵解為產生能量的方式以適應組織缺氧的微環(huán)境，產生活性氧(ROS)、氮中間體、IL-1β和IL-6等效應分子發(fā)揮促炎作用加速組織損傷，心肌損傷后期，血單核細胞來源的巨噬細胞從血單核細胞池中獨立出來成為駐留巨噬細胞M2型，高表達清道夫受體、甘露醇受體、半乳糖受體、Arg-1、IL-10、IL-1受體拮抗劑(IL-1Ra)等發(fā)揮抗炎效應及促進組織修復[16-17]；在DCM中，巨噬細胞主要分化為炎癥型(M1型)和抗炎型(M2型)兩種類型，其中M1型占主導地位，分泌IL-6、TNF-α等炎性因子[18]；增加M2型數(shù)量能夠增加IL-10等抗炎因子表達，減輕糖尿病誘導的心肌纖維化[19]。JIN等[20]發(fā)現(xiàn)，在DCM大鼠心肌組織內以M1型為主，灌輸間充質干細胞可促進M2型極化，促進心臟組織修復。JADHAV等[21]在Zucker糖尿病大鼠模型中通過測定大鼠體內單克隆抗體ED1和ED2表達水平分別量化M1、M2巨噬細胞，研究發(fā)現(xiàn)糖尿病組ED1表達顯著升高，ED2顯著減少，血紅素可逆轉Zucker大鼠向M1型極化，降低炎癥/氧化介質TNF-α、IL-6、IL-1β、核因子NF-κB、c-JNK和AP-1表達，增加胰島素信號轉導分子胰島素受體底物1(IRS-1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)和蛋白激酶B(PKB)的活性進而改善胰島素抵抗及糖尿病大鼠心臟血液動力學。以上對糖尿病動物模型的研究顯示，過度的炎性反應及巨噬細胞極化在DCM發(fā)病機制中的重要地位。

3.2 NAR通過下調RhoA/ROCK通路抑制M1極化并誘導M2極化NAR是柚皮苷的苷元，通過保護線粒體功能、抑制炎癥反應和血管組織損傷等機制改善肥胖、高血壓、高脂血癥、糖尿病和動脈粥樣硬化等代謝綜合征[22]。RhoA/ROCK信號通路包括RhoA、ROCK1、ROCK2、MYPT1、p-MYPT1蛋白，其中MYPT1為ROCK下游底物分子之一，p-MYPT1為MYPT1(Thr853)磷酸化水平，p-MYPT1反映ROCK活性。本實驗C3轉移酶、法舒地爾分別抑制RhoA、ROCK活性作為對照，Western blotting顯示NAR顯著降低RhoA/ROCK信號通路蛋白的表達，下調RhoA/ROCK通路活性。目前研究發(fā)現(xiàn)，在肝臟缺血再灌注損傷模型中，ROCK抑制劑法舒地爾促使肝臟和外周血中的Kupffer細胞/單核細胞從M1轉化為M2減輕肝臟炎癥[23]；法舒地爾降低1型糖尿病小鼠M1型標記分子及炎癥介質表達，增加M2標記分子和抗炎介質表達[24]，本實驗結果顯示，HG組RhoA/ROCK信號通路蛋白表達增加、炎性因子iNOS、TNF-α、IL-6增多，M1型增加，證實RhoA/ROCK信號通路調控巨噬細胞極化的潛在機制，NAR與法舒地爾、C3轉移酶組均顯著降低高糖刺激的巨噬細胞RhoA/ROCK信號通路蛋白的表達，增加抗炎分子分泌，誘導M2型極化。據(jù)此認為NAR通過下調RhoA/ROCK通路改善巨噬細胞極化，其具體的下游靶點暫未進一步研究。

3.3 NAR通過RhoA/ROCK通路改善DCM目前認為NAR改善DCM可能與下列機制有關：①上調環(huán)氧二十碳三烯酸-細胞色素P450氧化酶通路(EETs-CYP2J3)，激活過氧化物酶體增長因子活化受體(PPARs)表達改善糖尿病小鼠心肌肥厚[25]；②抑制瘦素介導的促分裂素原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路激活，減少高糖心肌細胞凋亡、ROS生成和基質金屬蛋白酶(MMP)耗散[26]；③降低葡萄糖調節(jié)蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶12(caspase 12)的基因和蛋白表達，增強超氧化物歧化酶(SOD)活性進而減輕DCM大鼠心肌細胞線粒體-內質網(wǎng)氧化應激損傷[27]；④上調EETs/PPARs相關信號通路預防心肌細胞因高糖刺激引起的肥大[28]，下調蛋白激酶(PKC-β)蛋白表達、抑制NADPH氧化酶活性改善糖尿病小鼠心肌纖維化[29]。YANG等[30]通過高糖培養(yǎng)大鼠原代心肌成纖維細胞(CFs)激活RhoA/ROCK信號通路促進I型前膠原蛋白表達及CFs增殖，發(fā)現(xiàn)ROCK抑制劑Y27632處理后膠原蛋白表達和CFs增殖減少；LAI等[31]用ROCK抑制劑法舒地爾喂養(yǎng)的糖尿病大鼠心肌纖維化得到改善，其機制可能是通過下調RhoA/ROCK信號通路，從而促進舒張期Ca2+清除和肌動蛋白重構；本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)NAR下調1型糖尿病小鼠心肌組織內RhoA/ROCK蛋白表達，改善心肌纖維化[5]，另有研究表明下調RhoA/ROCK通路可抑制糖尿病小鼠心肌組織內M1巨噬細胞極化，誘導M2極化[4]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)NAR下調RhoA/ROCK通路抑制M1、誘導M2，推測NAR通過調控RhoA/ROCK信號通路促進巨噬細胞M2極化，這可能作為治療DCM機制之一。