賈俊濤，王 昆，潘 登，李 強(qiáng)，杜晨光,*

(1．內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古 包頭014109；2.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 050000;3.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué) 獸醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018)

對(duì)有關(guān)發(fā)育、學(xué)習(xí)、行為和能量調(diào)控等相關(guān)神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的探索是生命科學(xué)的研究熱點(diǎn)之一，其相關(guān)問(wèn)題可以通過(guò)對(duì)某個(gè)特定神經(jīng)元或核團(tuán)的人為干擾或研究某一分子在神經(jīng)回路中的影響來(lái)得到一定的解答。高度特異性和高效的方法是支撐這些研究成功的基礎(chǔ)。腺病毒家族由不具有包膜的30～38 kb線性DNA組成[1]。根據(jù)其凝集特點(diǎn)可以將57個(gè)血清型分為A～G類[2]。由不同的血清型衍生而來(lái)的各種腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector,AAV) 是一種可用于靶向和操縱神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)特定神經(jīng)元亞型的強(qiáng)力工具[3]。在使用這種工具之前，有些問(wèn)題應(yīng)當(dāng)重視，其包括但不僅限于：(1)如何運(yùn)送AAV至指定區(qū)域；(2)使用何種基因調(diào)控元件；(3)選擇何種血清型[4]。研究表明，腦立體定位注射是運(yùn)送AAV至指定神經(jīng)元或核團(tuán)的常用方式[5]；突觸啟動(dòng)子(synapsin promoter)等強(qiáng)力啟動(dòng)子則是增強(qiáng)AAV在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)性的必備元件之一[6]；2型腺相關(guān)病毒載體(adeno-associated viral vector serotype 2,AAV2)因其神經(jīng)元特異性，長(zhǎng)期以來(lái)被用于神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)研究當(dāng)中[7]。因此，在神經(jīng)學(xué)研究中，選擇具有較強(qiáng)啟動(dòng)子的AAV2運(yùn)載外源基因、通過(guò)腦立體定位注射到指定核團(tuán)則有利于試驗(yàn)的順利進(jìn)行。本試驗(yàn)選擇AAV2-CMV-EGFP對(duì)照載體進(jìn)行研究正是基于以上原因。

通過(guò)對(duì)外源的轉(zhuǎn)錄、翻譯，AAV可將特異神經(jīng)元跨突觸信號(hào)傳遞情況直觀反映出來(lái)[8]。這樣的試驗(yàn)結(jié)果大大方便了人們對(duì)不同神經(jīng)核團(tuán)之間信號(hào)傳導(dǎo)的研究(包括不同腦半球之間的信號(hào)溝通)，但也體現(xiàn)出另外一個(gè)問(wèn)題：即如何保證外源基因隨載體進(jìn)入目標(biāo)神經(jīng)元后的表達(dá)周期內(nèi)，病毒不會(huì)因擴(kuò)散至相鄰的神經(jīng)核團(tuán)帶來(lái)試驗(yàn)數(shù)據(jù)的干擾？為了驗(yàn)證這種情況是否存在，我們?cè)诳紤]參考文獻(xiàn)[4]提出的3個(gè)基本問(wèn)題的基礎(chǔ)上，利用對(duì)照試驗(yàn)中常用的AAV2-CMV- EGFP(1.3×1011mg/L)對(duì)3周內(nèi)病毒的擴(kuò)散區(qū)域進(jìn)行了檢測(cè)；同時(shí)，驗(yàn)證了不同滴度和注射方式下，AAV能否在注射區(qū)域附近局限性表達(dá)，期望可以為AAV相關(guān)技術(shù)在獸醫(yī)研究應(yīng)用中的普及提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物飼養(yǎng)試驗(yàn)使用的小鼠為C57BL/6雄性小鼠(6周,20～23 g)，購(gòu)自北京維通利華公司。小鼠飼養(yǎng)在12/12 h周期的環(huán)境下(光照時(shí)間為07：00至19：00)。按照《內(nèi)蒙古大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用和護(hù)理指南》的道德標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行試驗(yàn)(批準(zhǔn)號(hào)SYCK2014-002)。腦立體定位前2 h，移除小鼠的水和食物。

1.2 腺相關(guān)病毒載體腦立體定位注射選擇Dil Stain (D3911,ThermoFisher)用于確定注射位點(diǎn)。使用1%～3%異氟烷進(jìn)行誘導(dǎo)麻醉，0.3%異氟烷用于呼吸麻醉的維持。呼吸后固定于全自動(dòng)腦立體定位儀(Neurostar,StereoDrive-DM)，根據(jù)圖譜所示位置進(jìn)行定位(stereotaxic coordinates of the mouse hypothalamus[9])。相應(yīng)位置打孔后，利用微量注射器將AAV2-CMV-EGFP(HAV1001,漢恒生物)注射于RPa (from Lambda:anterior-posterior (AP):-2.2 mm,mediolateral(ML):+0.0 mm,dorsoventral(DV):-5.5 mm,圖1)、延髓中部(from Lambda:AP:-2.2 mm,ML:+0.0 mm,DV:-3.0 mm,圖2)。普通注射:0.25 μL/min注射4 min，停針2 min；壓力注射:以0.1 μL/min，注射10 min，停針10 min。無(wú)菌條件縫合傷口皮膚，術(shù)后注射40萬(wàn)單位青霉素抗菌，單獨(dú)飼養(yǎng)3～4 d自愈。

1.3 測(cè)定EGFP熒光表達(dá)部位定位注射3周后，使用蠕動(dòng)泵進(jìn)行心肺灌注。預(yù)先使用預(yù)冷的生理鹽水灌注2 min,后轉(zhuǎn)為4%多聚甲醛(pH=7.4,Sigma-Aldrich)灌注20 min取材。4℃環(huán)境下使用4%多聚甲醛固定6 h，再用30%蔗糖進(jìn)行脫水，直至沉降到試管底部。

使用冰凍切片機(jī)(Slee Medical,Germany)以20 μm 厚度進(jìn)行連續(xù)切片，腦片按不同區(qū)域置于含0.01 mol/L PBS (pH 7.4)的12孔板。4℃環(huán)境下，使用飄片法(Free-floating)加入 0.4%TritonX-100(Sigma-Aldrich)于300 r/min恒溫孵育器(Eppendorf,ThermoMixerTMC)上清洗10 min。用1 mg/L DAPI(Sigma-Aldrich )進(jìn)行核酸染色5 min。拍照使用Nikon C2 PLUS Confocal(Nikon，Japan) 成像系統(tǒng)在其對(duì)應(yīng)的405 nm (DAPI)、488 nm (EGFP)、561 nm (Dil Stain)以及647 nm (檢測(cè)假陽(yáng)性)波段下進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 高病毒滴度下的擴(kuò)散情況為研究AAV在核團(tuán)注射3周后的侵染效果，試驗(yàn)首先選用1.3×1011mg/L 這一較高滴度進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，經(jīng)普通注射方式，該滴度雖然有效地在第3周時(shí)表達(dá)了病毒載體所攜帶的EGFP熒光蛋白基因，但并不局限于延髓RPa區(qū)域及臨近區(qū)域。在下丘腦室旁核(paraventricular nucleus,PVN) 區(qū)域及其周?chē)?，較多的特異性熒光信號(hào)被發(fā)現(xiàn)(圖1)。同樣，這種廣泛的表達(dá)情況也存在于四腦室周?chē)墓率?nucleus of the solitary tract,NTS)區(qū)域(圖1)。延髓中縫蒼白核 (raphe pallidus nucleus,RPa)區(qū)域及其周?chē)噍^于前腦PVN區(qū)域，可見(jiàn)更為清晰的熒光信號(hào)(圖1)。

這一結(jié)果顯示了AAV在1.3×1011mg/L 滴度下可有效在3周內(nèi)由延髓RPa區(qū)域侵染至前腦PVN區(qū)域，這達(dá)到了利用腺病毒進(jìn)行遠(yuǎn)距離跨神經(jīng)元示蹤的要求。但是，同樣也提出了另外一個(gè)問(wèn)題，如果要使用腺病毒進(jìn)行中樞神經(jīng)系統(tǒng)的局部基因敲除或特定區(qū)域的激活、上調(diào)，這種大范圍、多核團(tuán)的外源基因表達(dá)結(jié)果顯然不符合試驗(yàn)設(shè)計(jì)的要求。

AⅠ.下丘腦PVN及其周邊區(qū)域熒光表達(dá)狀況；AⅡ.下丘腦PVN陰性結(jié)果；BⅠ.NTS區(qū)域熒光表達(dá)狀況；BⅡ.NTS區(qū)域陰性結(jié)果；CⅠ.RPa區(qū)域熒光表達(dá)狀況；CⅡ.RPa陰性結(jié)果

2.2 低滴度下2種不同腦立體定位注射方式的對(duì)比除降低注射滴度外，注射方式可能也會(huì)影響到AAV表達(dá)情況。為了盡可能將病毒載體局限于某個(gè)神經(jīng)核團(tuán)周?chē)^低劑量的AAV(1.3×108mg/L)被注射在延髓區(qū)域(圖2A)。當(dāng)以0.25 μL/min速度注射4 min、停針2 min的普通注射方式進(jìn)行定位注射后，AAV在第3周的表達(dá)較弱、熒光值相對(duì)較低，難以與熒光背景進(jìn)行區(qū)分(圖2B)。當(dāng)以0.1 μL/min速度注射10 min、停針10 min的壓力注射方式進(jìn)行定位注射后，AAV在第3周的表達(dá)狀況得到了一定的好轉(zhuǎn)，熒光信號(hào)更加清晰(圖2C)。結(jié)果表明，采用0.1 μL/min速度注射10 min，停針10 min 的方式進(jìn)行注射，相比較之前的試驗(yàn)結(jié)果(圖1)，腺病毒在腦內(nèi)的表達(dá)范圍被明顯限制(圖2D～F)。

2.3 病毒載體EGFP表達(dá)結(jié)果及其非特異性熒光情況在使用較低滴度(1.3×108mg/L) 和壓力注射等方式后，可將病毒在3周內(nèi)的侵染范圍限制在局部區(qū)域(圖3)并獲得較好的熒光蛋白表達(dá)結(jié)果。此外，在使用EGFP(488 nm波長(zhǎng)激發(fā))具有較清晰結(jié)果的掃描參數(shù)進(jìn)行成像的過(guò)程中，637 nm 激光通道未見(jiàn)明顯的非特異性熒光信號(hào)。由于AAV的熒光信號(hào)常與其他通道信號(hào)共同使用以表明病毒的工作狀態(tài)(如敲除，或特異性神經(jīng)元調(diào)控)。因此，這一結(jié)果預(yù)示在AAV和其他波段熒光信號(hào)共表達(dá)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，使用低滴度、壓力注射的方式對(duì)獲得清晰可靠的試驗(yàn)結(jié)果具有一定的積極作用。

3 討論

目前，AAV配合Cre-Loxp重組系統(tǒng)在神經(jīng)元的在體功能研究中被廣泛應(yīng)用。利用以Cre-Loxp為首的重組系統(tǒng)發(fā)展而來(lái)的DREADDs技術(shù)可通過(guò)Gq、Gi和Gs(如hM3Dq、hM4Di和GsD)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，在體內(nèi)環(huán)境下，對(duì)多種細(xì)胞進(jìn)行中遠(yuǎn)程和非侵入性控制，達(dá)到激活、抑制和調(diào)節(jié)GPCR信號(hào)傳導(dǎo)途徑以及神經(jīng)傳遞的目的[10-11]。而AAV依靠其安全性高、侵染性強(qiáng)、表達(dá)穩(wěn)定等特點(diǎn)為這一技術(shù)的推廣做出了巨大貢獻(xiàn)。如若由此進(jìn)一步思考，那么保證AVV有效侵染和表達(dá)的區(qū)域集中于目標(biāo)核團(tuán)就成為了利用DREADDs對(duì)特定神經(jīng)元調(diào)控成功與否的關(guān)鍵。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒在高濃度情況下，其3周的擴(kuò)散范圍幾乎可以從延髓區(qū)域擴(kuò)散至前腦下丘腦區(qū)域。這樣的擴(kuò)散速率和覆蓋范圍顯然有利于使用AAV對(duì)特定神經(jīng)元進(jìn)行全腦的定位，為研究特定的神經(jīng)通路和神經(jīng)連接提供幫助[12]。但是，如果試驗(yàn)?zāi)康亩ㄎ辉谔囟ㄉ窠?jīng)核團(tuán)，如標(biāo)定和激活弓狀核(arcuate nucleus,ARC)區(qū)域的刺鼠相關(guān)蛋白(agouti-related peptide,AgRP)神經(jīng)元[13]，那么限制病毒在注射核團(tuán)周?chē)统蔀榱藬?shù)據(jù)是否穩(wěn)定的關(guān)鍵。

A.注射部位(DAPI藍(lán)色，Dil 綠色)；B.0.25 μL/min速度注射4 min，停針2 min方式注射3周后結(jié)果；C.0.1 μL/min速度注射10 min，停針15 min方式注射3周后結(jié)果；D.壓力注射3周后PVN區(qū)域EGFP熒光表達(dá)；E.壓力注射3周后注射區(qū)域附近EGFP熒光表達(dá)；F.壓力注射3周后RPa區(qū)域EGFP熒光表達(dá)

A．病毒載體注射3周后，EGPF表達(dá)狀況；B.488 nm激光激發(fā)下EGFP的局部表達(dá)；C.637 nm激光激發(fā)下病毒載體非特異性熒光狀況

本試驗(yàn)中，采用降低病毒滴度和采用壓力注射的方式來(lái)限制病毒的擴(kuò)散范圍和確保病毒載體的高效表達(dá)。當(dāng)病毒滴度降為1.3×108mg/L時(shí)，病毒的擴(kuò)散范圍和表達(dá)效果受到了一定的減弱(圖2B)，但是這種表達(dá)因其外源基因表達(dá)量較低，難以充分發(fā)揮出腺病毒高表達(dá)效率的特點(diǎn)。因此，在進(jìn)一步的試驗(yàn)中，采用了壓力注射的方式，期望以較低的注射速度和較長(zhǎng)的停留時(shí)間使得注射部位可以有較多的病毒載體存在。相比普通核團(tuán)注射方式，這種注射方式可以使得病毒載體的表達(dá)效果得到一定的提升，并且病毒載體在3周后的擴(kuò)散范圍也基本停留在注射核團(tuán)附近。因此初步認(rèn)定，降低病毒滴度至1.3×108mg/L并配合壓力注射的方式，可以使得AAV所攜帶的外源基因在延髓具有高表達(dá)和區(qū)域性的特點(diǎn)。此外，鑒于AAV中的EGFP基因在應(yīng)用過(guò)程中存在一定的假陽(yáng)性問(wèn)題，且高滴度下尤為明顯[14]，我們?cè)?88 nm和647 nm激發(fā)波長(zhǎng)下使用相同的成像參數(shù)進(jìn)行了掃描，結(jié)果顯示在得到較好的外源基因表達(dá)結(jié)果的參數(shù)下，647 nm激發(fā)波長(zhǎng)下的熒光結(jié)果(相比488 nm激發(fā)波長(zhǎng))沒(méi)有出現(xiàn)明顯的假陽(yáng)性現(xiàn)象。

綜上所述，在AAV有效性得到保障、外源基因片段對(duì)載體干擾性較小的情況下，選擇較低滴度的腺病毒(1.3×108mg/L)并結(jié)合壓力注射的方式可以在一定程度上保證外源基因的高效和區(qū)域性表達(dá)，且沒(méi)有明顯的假陽(yáng)性現(xiàn)象。