魏 楠，谷 峰

(中國農業(yè)科學院 上海獸醫(yī)研究所，上海200241)

成簇規(guī)律間隔短回文重復與Cas9蛋白(clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR/Cas9)是第三代基因組編輯技術。基因組編輯技術基于基因靶向修飾，從而實現(xiàn)對目標基因定點敲除和外源基因定點整合，已經被用于多種模式動物的品種改良和疾病防治，基因組編輯技術先后經歷了大范圍核酸酶、鋅指核酸酶(ZNF)、類轉錄激活因子效應物核酸酶(TALEN)等技術的發(fā)展。CRISPR/Cas9技術作為目前應用最廣泛的基因編輯工具，為預防和控制病毒感染提供了新的思路，例如可用于全基因組篩選病毒毒力基因、通過靶向病毒基因缺失或突變生產減毒疫苗、研發(fā)動物抗病育種等。

1 CRISPR/Cas9技術在豬病毒性疾病防控中的應用

豬臨床上的病毒性疾病主要包括非洲豬瘟、豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、偽狂犬病、豬流行性腹瀉和豬流感等，這些疾病都具有較高的發(fā)病率和病死率等特點，對養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成極大的威脅。豬作為一種重要的農業(yè)經濟動物和大型模式動物，對其進行基因組編輯不僅能提高生產性能、加速新品種的培育，還為相關病毒性疾病的防治提供了新的思路。

1.1 非洲豬瘟非洲豬瘟(African swine fever,ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)引起的一種急性、烈性、高度接觸性傳染病,給全球養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經濟損失。豬巨噬細胞是ASFV的主要天然宿主細胞[1]，盡管被敲除的巨噬細胞表面蛋白CD163也被認為是一種潛在的ASFV受體，然而CD163基因編輯豬卻不能抵抗ASFV的感染[2]。傳統(tǒng)的ASFV疫苗研究存在不同程度的局限性，通過建立ASFV CRISPR/Cas9基因編輯技術平臺，將為ASFV基因功能研究提供便捷的工具，加快疫苗研究進程。目前，CRISPR/Cas9已經被成功用于ASFV的基因編輯研究中。BORCA等[3]首次使用CRISPR/Cas9技術描述了基于高毒性ASFV-G基因缺失重組病毒的研究，以豬巨噬細胞培育強毒力毒株Georgia07，用CRISPR/Cas9從毒株基因組中敲除非必需基因8-DR，以紅色熒光蛋白(RFP)基因代替，獲得了重組效率高且易于純化的重組病毒。HüBNER等[4]首次證明，在表達相關基因的CRISPR/Cas9系統(tǒng)的細胞中，ASFV的復制可以被抑制，用CRISPR/Cas9靶向ASFV磷酸化蛋白p30基因(CP204L)71～78密碼子的gRNA，穩(wěn)定轉染修飾野豬肺細胞系(WSL)，結果顯示ASFV在WSL細胞中產量降低，表明CRISPR/Cas9介導的ASFV p30基因靶向是一種有效的抗ASFV感染的策略。

1.2 豬繁殖與呼吸綜合征豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)，又稱為藍耳病，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的，是高度傳染的病毒性疾病，可導致豬的晚期流產、死胎和呼吸系統(tǒng)疾病，對全世界的養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。相關研究表明,CD163是調控PRRSV感染初始階段的關鍵因子[5]。2014年，美國密蘇里大學WHITWORTH等[6]使用CRISPR/Cas9技術靶向2個內源基因(CD163和CD1D)來獲得轉基因豬。該團隊后續(xù)研究表明,CD163基因編輯豬對 PRRSV NVSL 97-7895 病毒株有抵抗力，未表現(xiàn)出任何與 PRRS 相關的臨床癥狀，且生長健康[7]。BURKARD等[8]獲得了CD163外顯子7敲除的豬，該豬表達缺失SRCR5的CD163蛋白，研究發(fā)現(xiàn)缺失SRCR5不影響豬巨噬細胞的生物學功能，而且該豬可抵抗Ⅰ型 PRRSV的1、2、3 亞型和Ⅱ型 PRRSV 的感染。WELLS等[9]將人類CD163 受體的SRCR8 結構域同源物替代了豬SRCR5 結構域，獲得了對Ⅰ型 PRRSV 具有抵抗性，但對Ⅱ型PRRSV仍然敏感的豬?？缒ぬ堑鞍?4-1BB)是腫瘤壞死因子受體超家族的成員之一，是T細胞協(xié)同刺激分子。HUANG等[10]通過CRISPR/Cas9介導的同源重組技術，獲得了高表達4-1BB的豬，該豬對PRRSV疫苗的免疫反應結果表明，高水平4-1BB的表達能夠促進Th1分化和增強對PRRSV的細胞毒性T淋巴細胞(CTL)反應，該研究提供了一種新的策略來提高疫苗的免疫效力。

在高致病性PRRS的研究中，YANG等[11]采用CRISPR/Cas9技術獲得CD163基因敲除豬，該豬能完全抵抗HP-PRRSV TP毒株感染，另外，有研究者用CRISPR/Cas9技術獲得CD163外顯子7敲除豬[12]，或者將豬CD163的外顯子7替換為人類的相應外顯子(hCD163L1)[13]，所獲得的基因編輯豬可抵抗HP-PRRSV相關毒株的感染，如JXA1、JXwn06等，且對CD163的生物學功能無不良影響。

1.3 豬偽狂犬病豬偽狂犬病是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的豬急性傳染病，主要引起仔豬出現(xiàn)神經癥狀、腹瀉嘔吐，病死率高達100%，妊娠母豬流產、死胎等，嚴重危害全球豬養(yǎng)殖業(yè)。PRV是α皰疹病毒亞科的成員，基因組為線狀雙鏈DNA分子，約150 kb，由于PRV基因組很大，傳統(tǒng)基因操作方法費時費力，而CRISPR/Cas9技術不失為一種快捷可行的方法。

1.3.1PRV疫苗生產 2011年，PRV毒株發(fā)生變異，傳統(tǒng)的Bartha-K61疫苗未能提供對變異株的完全保護，對有效的疫苗開發(fā)提出了迫切的需求。XU等[14]首次使用CRISPR/Cas9技術用于PRV 基因組編輯，將純化的PRV 基因組與Cas9 sgRNA 共轉染到PK-15細胞中，獲得高達100%病毒基因破壞率。LIANG等[15]提出了一種基于CRISPR/Cas9和Cre/Lox系統(tǒng)的快速疫苗開發(fā)策略，使用CRISPR/Cas9技術，PRV毒力基因GE和TK分別被標記基因GFP和mCherry取代，隨后用Cre/Lox系統(tǒng)切除標記基因，成功獲得了第1個基于CRISPR/Cas9技術的PRV候選疫苗。TANG等[16]獲得了一種表達螢火蟲熒光素酶和綠色熒光蛋白的重組PRV 毒株，作為PRV 特異性的sgRNA 篩選和抗病毒化合物快速評估的報告病毒。最后，利用該報告病毒，成功開發(fā)了US2、US3和US9滅活的PRV 毒株，并證明氯喹抑制PRV HeN1毒株復制。TANG 等[17]設計了一種使用CRISPR/Cas9技術編輯PRV 基因組的方法，以快速減毒PRV,開發(fā)了三重gE/gI/TK基因滅活的HeN1 PRV 毒株，該方法也適用于其他的難以操作的大型DNA 病毒。新出現(xiàn)的PRV 變異株JS-2012的糖蛋白B(gB)基因與疫苗株Bartha -K61相比有多個變異，YU等[18]用CRISPR/Cas9技術成功獲得了以Bartha-K61基因組為骨架，Bartha-K61 gB基因被替換為JS-2012 gB基因的重組病毒BJB，用滅活的 BJB 對小鼠進行免疫接種，攻毒結果顯示BJB 的保護率是80%， 該研究表明了gB基因在保護性免疫中的重要性。SUI等[19]通過CRISPR/Cas9技術成功獲得了豬核糖核酸酶L(sRNase L)基因敲除的PK-15細胞系，研究結果顯示與親代PK-15細胞系相比，病毒在該細胞系中產量更高，該細胞系可作為研究sRNase L 功能和優(yōu)化PRV 疫苗生產的工具。

1.3.2PRV 毒力基因研究 TANG等[20]使用CRISPR/Cas9技術敲除了10個潛在的PRV 毒力基因，并在小鼠模型中評估了各突變體的致病性，結果顯示胸苷激酶(TK)和糖蛋白M(gM)基因敲除突變體的毒力顯著降低，顯示TK和gM是PRV的關鍵毒力基因。而YE等[21]采用CRISPR/Cas9技術分別獲得UL24和TK 基因缺失PRV 病毒，其研究顯示與TK基因相比，UL24是一種次要的PRV 毒力基因。

1.3.3PRV 逃避CRISPR/Cas9抑制及其機制研究 病毒從CRISPR/Cas9介導的抑制中逃逸可能會限制該技術在病毒防制中的應用，而相關研究表明PRV可以逃避CRISPR/Cas9介導的抑制。PENG等[22]使用CRISPR/Cas9技術獲得了敲除PRV UL30基因的PX459細胞系，可顯著抑制PRV 的復制，然而隨著細胞傳代的增加，病毒滴度也逐漸增加，發(fā)現(xiàn)了PRV 可以逃脫CRISPR/Cas9系統(tǒng)的抑制。REN等[23]進一步研究闡明了經過編輯的PX459細胞傳代對CRISPR/Cas9介導的PRV復制沒有影響。TANG等[24]研究證實了單個sgRNAs 靶向會產生PRV 逃逸，而多個sgRNAs 同時靶向完全抑制PRV 復制，強調了多靶向的重要性。

1.3.4在PRV其他方面的應用 GUO等[25]使用CRISPR/Cas9技術大幅度提高同源重組的效率，建立了一種快速的插入大基因組細菌人工染色體BACs 的方法，重組效率高達86%。α皰疹病毒的病毒宿主關閉蛋白基因UL41被認為可誘導降解宿主mRNAs 并關閉宿主蛋白質合成，在PRV 的宿主關閉機制研究中，YE等[26]利用CRISPR/Cas9結合Gibson 組件獲得了UL41基因敲除的PRV,結果顯示該病毒不能顯著降低感染早期宿主基因的表達量，表明PRV 的其他病毒因素也可能參與宿主關閉。

1.4 豬病毒性腹瀉豬病毒性腹瀉是一種急性的豬消化道傳染疾病，仔豬最易感且病死率高，臨床癥狀表現(xiàn)為嘔吐、嚴重腹瀉和脫水，引起該病的主要病原包括豬傳染性胃腸炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)、豬流行性腹瀉病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)和輪狀病毒(rotavirus,RV)，該病給全球養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失。

1.4.1TGEV TGEV是α屬冠狀病毒，是一種包膜、單股正鏈的RNA病毒。氨基肽酶N(APN)被認為是多種α冠狀病毒的受體，包括TGEV[27]、PDCoV和人冠狀病毒229E(HCoV-229E)。冠狀病毒spike蛋白的N末端結構域也被認為是導致該病不同臨床癥狀的原因。WANG等[28]用CRISPR/Cas9技術構建了一個TGEV spike基因N端域224個氨基酸缺失的重組病毒，其結果表明，spike基因N端域的缺失對TGEV的毒力影響較小，spike蛋白的N端域不是TGEV的毒力決定因子。SHEN等[29]研究則表明α屬冠狀病毒的nsp1蛋白是TGEV重要的毒力決定因子，使用CRISPR/Cas9技術構建重組TGEV，改變了nsp1的特定序列，發(fā)現(xiàn)該突變不影響病毒的復制，但降低了TGEV的致病性，還發(fā)現(xiàn)α屬冠狀病毒nsp1的特定序列(氨基酸91～95)是抑制宿主基因表達的保守區(qū)域，該結果為開發(fā)基于修飾nsp1的減毒疫苗提供了參考。

1.4.2PEDV PEDV是α屬冠狀病毒，盡管APN被認為是多種α屬冠狀病毒的受體，但相關研究證明APN基因編輯豬不能抵抗PEDV的感染，APN對PEDV的入侵感染不是必需的[30-32]。為了探究淋巴毒素β受體(LTβR)在PEDV感染中的作用，ALTAWATY等[33]用CRISPR/Cas9技術獲得了LTβR敲除IPEC-J2細胞，LTβR的缺乏導致細胞S期積累，增加了細胞對PEDV感染的易感性，表明LTβR介導的信號傳導在維持IPEC-J2細胞增殖和保護IPEC-J2細胞免受PEDV感染中起關鍵作用，但其調節(jié)機制還需進一步研究。TU等[34]用CRISPR/Cas9技術獲得了胞苷磷酸-N-乙酰神經氨酸羥化酶(CMAH)基因敲除的仔豬，使N-羥乙基神經氨酸(NGNA)無表達，攻毒結果顯示該豬不能對PEDV免疫，但可以減輕PEDV感染的嚴重性并延緩其發(fā)生。

1.4.3RV RV是重要的人畜共患病原之一，是引起嬰幼兒和多種幼齡動物急性腹瀉的主要病原體之一，其基因組由11段雙鏈RNA組成，編碼6種病毒結構蛋白(VP1～VP4、VP6和VP7)和5種非結構蛋白(NSP1～NSP5/6)，在9個RV基因組(A～I)中，RVA、RVB、RVC和RVH與仔豬腹瀉有關。

研究者用CRISPR/Cas9技術編輯用以生產RV疫苗的Vero細胞[35-37]，編輯了細胞的NUE2、NAT9、COQ9、EMX2等基因，使RV產量顯著增加，改進了RV在Vero細胞系產量較低的問題。LI等[38]在研究RV感染的機制中發(fā)現(xiàn)，在RV感染期間一種肌動蛋白結合蛋白drebrin(DBN1)與VP4共沉淀和共定位，通過siRNA沉默、CRISPR敲除或化學抑制阻斷DBN1功能，顯著提高了宿主細胞對RV的易感性，表明DBN1基因有限制RV進入宿主細胞的能力。在翻譯啟動因素調節(jié)RV感染的機制研究中，CHEN等[39]分析了真核翻譯起始因子4F(eIF4F)復合物在RV感染中的作用，使用CRISPR/Cas9技術分別對eIF4F復合物的組分進行敲除，結果eIF4F的3個組分(包括eIF4A、eIF4E和eIF4G)功能喪失，均顯著提升了RV基因組RNA和病毒蛋白VP4的表達水平，還證實eIF4F復合物是通過調節(jié)抗病毒蛋白IRF1和IRF7來抵抗RV感染。DING等[40]用CRISPR/Cas9全基因組篩選促進RV感染的宿主因子，研究表明Cohesin 蛋白的核心亞基STAG2會促進RV感染，STAG2的缺失會激活cGAS-STING-IRF3信號傳導途徑誘導干擾素應答，并廣泛限制病毒(包括RV)感染，STAG2突變在多種腫瘤類型中被檢測到，該研究結果可為相關腫瘤的治療提供參考。

1.5 豬瘟豬瘟俗稱“爛腸瘟”，又稱古典豬瘟，是一種傳染性極強的病毒性疾病，由豬瘟病毒(classical swine fever virus,CSFV)引起，CSFV為單股正鏈RNA病毒，病毒基因組編碼一種多蛋白前體，該前體進一步被蛋白酶水解為4種結構蛋白(C、Erns、E1和E2)和8種非結構蛋白(Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B)[41]。NS4B蛋白對病毒RNA復制至關重要，且與CSFV毒力有關[42]，有研究表明RING E3泛素連接酶通過各種機制抑制病毒復制[43]。豬RNF114蛋白(pRNF114)是RING E3泛素連接酶的成員，ZHANG等[44]使用CRISPR/Cas9技術在PK-15細胞中敲除RNF114，促進了CSFV的復制，研究結果表明pRNF114是一種抗CSFV因子，其抗CSFV作用取決于其RING E3泛素連接酶的活性，pRNF114結合NS4B蛋白，并催化NS4B蛋白K27連接的多聚泛素化，引起NS4B蛋白降解從而抑制CSFV的復制。XIE等[45]篩選了抗病毒小發(fā)夾RNA(shRNAs)，通過CRISPR/Cas9技術將其插入豬Rosa26基因座，并成功獲得了抗CSFV感染的基因編輯豬，其抗病性可以穩(wěn)定地傳遞到F1代。RSAD2基因具有針對多種DNA和RNA病毒的抗病毒活性，XIE等[46]用CRISPR/Cas9技術將豬RSAD2基因(pRSAD2)插入豬Rosa26基因座，并成功獲得可以抵抗CSFV感染的豬。

1.6 豬圓環(huán)病毒病豬圓環(huán)病毒(porcine circovirus,PCV)的血清型有PCV1、PCV2和PCV3。PCV1無致病性，PCV2、PCV3為致病性的病毒，PCV2與一系列疾病的發(fā)生有關，這些疾病被稱為豬圓環(huán)病毒相關疾病，如斷奶后多系統(tǒng)消瘦綜合征、豬皮炎腎病綜合征等。有研究表明，PCV2感染通過上調P53誘導細胞凋亡，XU等[47]使用CRISPR/Cas9技術獲得了p53基因敲除的PK-15細胞系，進一步探究p53 在PCV2感染中的作用，結果表明在PK-15細胞中，PCV2通過p53調控p21、Cyclin E的上調和Cyclin A、CDK 2蛋白的下調誘導細胞S期積累，從而維持其自身復制。SYNGR2基因是一組主要在神經元細胞突觸囊泡膜中表達的基因，WALKER等[48]研究結果顯示PCV2b(UNL2014001)毒株在SYNGR2基因敲除的PK-15細胞中病毒產量降低，為SYNGR2參與促進PCV2感染提供了證據。

1.7 豬流感豬流感(swine influenza,SI)是由甲型流感病毒(IAV)引起的豬急性呼吸道傳染病，不僅給養(yǎng)豬業(yè)造成危害，對人類健康也具有潛在威脅。目前,豬群中流行的IAV以H1N1、H1N2和H3N2亞型為主，這里簡要回顧了CRISPR/Cas9技術在IAV相關研究中的應用。

1.7.1IAV與宿主相互作用機制研究 CRISPR/Cas9技術可應用于探究IAV與宿主之間相互作用機制，為IAV的防控提供線索。IAV基因組的轉錄和復制發(fā)生在感染細胞的核內，宿主對抗IAV感染的有效途徑是靶向核導入。劉麗素等[49]用CRISPR/Cas9技術在人肺癌細胞A549中敲除核輸入蛋白 importin α7，研究importin α7 對不同來源和亞型的流感病毒生長的影響，其結果表明不同亞型流感病毒結合 importin α的特異性不同，流感病毒可能進化出不同機制來利用importin α亞型進行核輸入。LUO等[50]研究顯示用CRISPR/Cas9技術在細胞中敲除磷脂爬行酶1(PLSCR1)的表達促進了多種亞型IAV復制，證明了PLSCR1是對抗IAV感染的重要因素，其機制是PLSCR1與核蛋白(NP)和importin α家族成員形成三聚體復合物，該復合物抑制了importin β與importin α形成功能性核導入受體復合物，損害NP的核導入從而抑制IAV復制，PLSCR1不影響NP的磷酸化狀態(tài)，也不激活IFN途徑。IAV在感染過程中利用多種宿主蛋白，SAMMAIBASHI等[51]用CRISPR/Cas9技術獲得了真核翻譯延長因子1γ(eEF1G)敲除A549細胞系，在該細胞中，A/WSN/33(H1N1)病毒的復制和蛋白表達受到顯著抑制，但病毒基因表達水平未降低，表明eEF1G在病毒蛋白的轉化中起著重要的作用，還驗證了WSN病毒的PB2和PA蛋白受eEF1G的調控，但具體機制仍需進一步的研究。許多病毒在進入細胞后會下調p53從而減弱宿主的抗病毒反應，但IAV感染會上調p53。WANG等[52]用CRISPR/Cas9技術獲得p53敲除的A549細胞，p53的缺失可引起IAV產量降低，其研究表明激活p53途徑是IAV感染過程中的重要步驟，通過上調p53，抑制干擾素誘導跨膜蛋白(IFITMs)的表達從而維持IAV感染。

1.7.2IAV疫苗開發(fā)和抗病毒策略研究 miR-21在流感病毒易感宿主中普遍表達，WARING等[53]用CRISPR/Cas9技術獲得了miR-21敲除的MDCK細胞系，成功開發(fā)了一種新的IAV疫苗生產方法。有研究表明，流感病毒感染依賴于細胞脂質，包括鞘脂、鞘磷脂和鞘氨醇。DREWS等[54]用CRISPR/Cas9技術獲得了敲除葡萄糖神經酰胺酶(GBA)基因的HEK293和A549細胞系，觀察到PR8(H1N1)綠色熒光蛋白(GFP)報告病毒在2種細胞系中的產量降低，結果表明病毒產量降低與IAV的運輸受損有關，證明了GBA對于病毒以及細胞物質的內吞運輸至關重要。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一種新的基因調控機制，關于lncRNA與流感病毒感染期間基因表達調控和抗病毒活性有關的研究較少。MORE等[55]鑒定了涉及IAV復制的lncRNA，證明了PSMB8反義RNA 1(PSMB8-AS1)是一種促進IAV復制的lncRNA，PSMB8-AS1可能是開發(fā)抗IAV治療新的宿主因子靶點。SANYAL等[56]用CRISPR/Cas9技術參與編輯，探究NF-κB在IAV感染中的作用，結果表明IAV的基因型影響NF-κB是否顯示其抗病毒功能。

2 結束語及應用前景

豬作為一種重要的農業(yè)經濟動物和醫(yī)學動物模型，其選育和疾病防控越來越受到人們重視，尤其是近年非洲豬瘟疾病的流行對我國乃至全球養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經濟損失。新型基因編輯技術CRISPR/Cas9在豬相關領域的研究已經得到廣泛應用，比如在抗病育種、疫苗生產、異種器官移植、疾病模型構建、藥物靶點挖掘和疫病防制等方面。CRISPR/Cas9技術在豬病毒性疾病防控領域具有較高的科研價值和臨床治療意義，合理地應用CRISPR/Cas9技術，可探究病毒基因的功能、篩選毒力基因，探究病毒感染過程中關鍵的宿主因子和病毒因子，用于疫苗生產、研發(fā)抗病毒藥物和抗病毒分子育種等，可為生物醫(yī)學和豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展做出重大貢獻，應用前景極為廣闊。