MAQBOOL Babar，王 勇，崔雪梅，袁麗佳，胡松華

(浙江大學(xué) 動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 310058)

偽狂犬病(pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)引起的一種高度接觸性動(dòng)物傳染病，主要感染豬、牛、羊、犬、貓、兔等動(dòng)物[1]。豬是PRV的唯一自然宿主，15日齡以?xún)?nèi)仔豬感染PRV后的病死率可達(dá)100%，斷奶仔豬感染發(fā)病后的病死率為10%～20%，此病給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。長(zhǎng)期以來(lái)，預(yù)防此病的方法主要通過(guò)給豬接種gE基因缺失弱毒疫苗。然而，近些年一些豬場(chǎng)免疫了弱毒疫苗后出現(xiàn)PRV變異株流行暴發(fā)情況[3]。與弱毒疫苗比較，滅活疫苗具有更好的安全性。但滅活疫苗主要誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生體液免疫，而對(duì)細(xì)胞免疫作用不大[4]。動(dòng)物在抵御PRV感染過(guò)程中，主要是細(xì)胞免疫發(fā)揮保護(hù)作用。因此，研究提高疫苗免疫效果的方法，增強(qiáng)動(dòng)物的抗病能力具有重要的臨床意義。

研究表明，從中藥人參(PanaxginsengC.A.Meyer)莖和葉中提取的人參莖葉總皂苷(GSLS)對(duì)許多動(dòng)物疫苗的免疫具有增強(qiáng)作用。馬艷粉等[5-6]報(bào)道，口服GSLS能夠顯著性提高口蹄疫(FMD)疫苗免疫小鼠的特異性IgG及其亞類(lèi)水平。據(jù)報(bào)道，飲水口服GSLS對(duì)雞免疫新城疫(ND)滅活疫苗和禽流感(AI)滅活疫苗均有免疫增強(qiáng)作用[7-8]。硒是一種人和動(dòng)物必需的微量元素，具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力的作用，以亞硒酸鈉(Na2SeO3，簡(jiǎn)稱(chēng)Se)的形式在畜牧業(yè)生產(chǎn)中應(yīng)用廣泛[9-10]。本試驗(yàn)擬研究動(dòng)物口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se對(duì) PRV滅活疫苗免疫的增強(qiáng)作用，為臨床上如何采用中藥提高滅活疫苗的免疫效果提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雌性ICR小鼠(18～22 g)，購(gòu)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限責(zé)任公司。飼養(yǎng)于實(shí)驗(yàn)室IVC獨(dú)立送風(fēng)飼養(yǎng)籠具，自由采食與飲水，室內(nèi)溫度為(25±1)℃，濕度為(50±10)%，飼養(yǎng)1周后開(kāi)始試驗(yàn)。

1.2 細(xì)胞、病毒和疫苗豬腎傳代細(xì)胞系PK-15由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院中獸醫(yī)實(shí)驗(yàn)室保存；偽狂犬病病毒野毒株(fPRV)，由浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院惠贈(zèng)，分離自PR病死豬，用于PK-15細(xì)胞擴(kuò)增和TCID50檢測(cè)；豬PR滅活疫苗，購(gòu)自武漢科前生物股份有限公司(批號(hào)：180416)。

1.3 主要試劑和藥品豬PRV gB抗體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自美國(guó)IDEXX公司；胎牛血清，購(gòu)自浙江天杭生物科技股份有限公司；人參莖葉總皂苷(GSLS)，購(gòu)自吉林宏久生物科技股份有限公司；亞硒酸鈉(Na2SeO3，Se)購(gòu)自上海今品化學(xué)技術(shù)有限公司；刀豆蛋白(ConA)、脂多糖(LPS)和MTT，購(gòu)自Sigma公司；胰酶消化液(0.25% 胰酶+0.02% EDTA)，購(gòu)自杭州吉諾生物醫(yī)藥有限公司；HRP標(biāo)記標(biāo)記山羊抗小鼠IgG1、IgG2a抗體，購(gòu)自Santa Cruz公司；紅細(xì)胞裂解液，購(gòu)自北京索萊寶生物科技有限公司；Mouse IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-6 ELISA檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自杭州聯(lián)科生物科技有限公司。

1.4 主要耗材與儀器MCO-15AC CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，購(gòu)自日本SANYO公司；Multiskan MK3酶標(biāo)儀，購(gòu)自美國(guó)Thermo公司；XDS-1B 倒置顯微鏡，購(gòu)自重慶光電儀器有限公司；5810R離心機(jī)，購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司。

1.5 疫苗免疫劑量的篩選ICR小鼠隨機(jī)分成4組，每組6只，分別肌肉注射免疫0.1 mL用生理鹽水稀釋10，50，100倍和未稀釋的PRV滅活疫苗，免疫后2周采血，檢測(cè)血清特異性PRV gB抗體水平，篩選出合適的疫苗免疫劑量。

1.6 動(dòng)物分組與處理ICR小鼠隨機(jī)分成5組，每組6只。第1組為空白組(non-immune)，不免疫；第2組,PRV滅活疫苗對(duì)照組(PRV)；第3組,免疫前灌胃GSLS(0.5 mg/d)，連續(xù)給藥4 d，然后注射PRV滅活疫苗(GSLS/Pre+PRV)；第4組，在PRV滅活疫苗添加30 mg/L的Se(Se+PRV)；第5組，免疫前灌胃GSLS(0.5 mg GSLS)，連續(xù)給藥 4 d，然后注射添加Se(30 mg/L)的PRV滅活疫苗(GSLS-Se+PRV)。小鼠肌肉注射疫苗2次，每次注射疫苗0.1 mL，間隔2周。加強(qiáng)免疫后2,3,4周采血，制備血清，最后一次采血后處死小鼠并分離脾淋巴細(xì)胞。用ELISA方法檢測(cè)血清gB抗體及亞類(lèi)水平，脾淋巴細(xì)胞用于檢測(cè)淋巴細(xì)胞增殖水平及細(xì)胞因子水平。

1.7 血清特異性PRV gB抗體及其亞類(lèi)檢測(cè)根據(jù)PRV gB抗體檢測(cè)試劑盒說(shuō)明，用阻斷ELISA法檢測(cè)血清中特異性PRV gB抗體水平。抗體阻斷率=[1-S(樣品D值)/N(陰性對(duì)照D值)]×100%。使用同樣的ELISA檢測(cè)試劑盒，向試劑盒包被板每孔加入100 μL待檢測(cè)血清(1∶2稀釋)，置于18～26℃ 孵育60 min后用洗滌液洗板3～5次;將板拍干，隨后每孔加入100 μL 1∶1 000稀釋的HRP標(biāo)記的山羊抗鼠IgG1或IgG2a抗體，置于37℃孵育60 min后用洗滌液洗板3～5次;將板拍干后每孔加入100 μL TMB底物溶液，置于18～26℃ 孵育，15 min后每孔加入50 μL終止液，于D450 nm讀數(shù)。

1.8 淋巴細(xì)胞增殖試驗(yàn)將小鼠斷頸處死，用75%酒精浸泡5～10 min，無(wú)菌操作取脾臟，加入5 mL完全Hank's液，用研缽研磨后過(guò)200目銅網(wǎng)，濾液離心(1 500 r/min，10 min)，棄上清。加入3 mL紅細(xì)胞裂解液裂解紅細(xì)胞，靜止3 min后離心，棄上清。使用完全Hank's液清洗細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用RPMI-1640培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL。將細(xì)胞加入至96孔板中(100 μL/孔)，后加入100 μL ConA(終質(zhì)量濃度5 mg/L)、LPS(終質(zhì)量濃度5 mg/L)或PRV抗原(經(jīng)56℃、30 min處理后的fPRV野毒，5×105TCID50)，輕輕混勻后，培養(yǎng)板置于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h。培養(yǎng)結(jié)束前4 h加入20 μL MTT(5 g/L)。離心培養(yǎng)板(1 800 r/min，10 min)并小心倒去細(xì)胞培養(yǎng)液，再向每孔加入150 μL DMSO，避光振蕩溶解結(jié)晶后置于酶標(biāo)儀上測(cè)量D570 nm。刺激指數(shù)(SI)的計(jì)算公式如下：SI=(D刺激孔-D空白孔)/(D未刺激孔-D空白孔)。

1.9 細(xì)胞因子檢測(cè)按1.8中方法收集脾細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度至5×106/mL，使用PRV抗原(經(jīng)56℃ 30 min處理后的fPRV野毒，5×105TCID50)刺激，于37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞上清液，按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟，檢測(cè)Th1(IFN-γ，IL-2)和Th2(IL-4，IL-6)型細(xì)胞因子的分泌水平。

1.10 攻毒保護(hù)試驗(yàn)小鼠加強(qiáng)免疫后2周，腹腔注射致死劑量的fPRV(5×105TCID50)，連續(xù)觀察10 d，并記錄小鼠癥狀和死亡情況。

2 結(jié)果

2.1 疫苗免疫劑量篩選給小鼠分別免疫未稀釋和用生理鹽水稀釋10，50，100倍后的PRV滅活疫苗，檢測(cè)免疫后2周小鼠血清gB抗體水平。由圖1可知，隨著稀釋倍數(shù)的增加，疫苗誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生的gB 抗體水平也逐漸降低。為更好觀察GSLS-Se對(duì)PRV滅活疫苗的佐劑效果，最終選擇100倍作為后續(xù)試驗(yàn)疫苗的稀釋倍數(shù)。

2.2 GSLS-Se對(duì)小鼠血清特異性PRV gB抗體水平的影響由圖2可知，與PRV疫苗對(duì)照組相比，免疫前口服GSLS或者在疫苗中添加Se可顯著提高抗體水平，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se可產(chǎn)生更高的抗體水平。

圖1 不同稀釋倍數(shù)對(duì)PRV滅活疫苗誘導(dǎo)的小鼠gB抗體水平的影響

*.示P<0.05;**.示P<0.01;***.示P<0.001。下同

2.3 GSLS-Se對(duì)小鼠血清特異性PRV gB抗體亞類(lèi)水平的影響與PRV疫苗對(duì)照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se顯著提高了小鼠血清中特異性PRV gB抗體的IgG1和IgG2a水平(圖3)。

2.4 GSLS-Se對(duì)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖及產(chǎn)生細(xì)胞因子的影響與PRV疫苗對(duì)照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在疫苗中添加Se顯著提高了小鼠脾淋巴細(xì)胞在體外受ConA、LPS和PrV抗原刺激后的增殖能力(圖4)，并顯著上調(diào)了淋巴細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子(INF-γ、IL-2和IL-6)水平(圖5)。

2.5 小鼠攻毒保護(hù)試驗(yàn)用強(qiáng)毒(fPRV)腹腔注射小鼠，空白組小鼠和口服GSLS組小鼠在攻毒后36 h 均出現(xiàn)啃咬后背，后肢抽搐和共濟(jì)失調(diào)等神經(jīng)癥狀，并從48 h開(kāi)始死亡，60 h時(shí)2個(gè)組小鼠全部死亡。PRV疫苗組小鼠在攻毒后48 h出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，從60 h開(kāi)始死亡，最終小鼠存活率為50%(5/10)，而GSLS-Se+ PRV疫苗組的小鼠的存活率為70%(7/10)(圖6)。

圖3 小鼠血清特異性PRV gB抗體亞類(lèi)IgG1 (A)和IgG2a (B)水平

圖4 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖水平

3 討論

本試驗(yàn)結(jié)果表明，與PRV疫苗對(duì)照組相比，免疫前口服GSLS聯(lián)合在PRV滅活疫苗中添加Se能夠促進(jìn)小鼠產(chǎn)生更高的特異性PRV gB抗體水平，增強(qiáng)動(dòng)物的體液免疫應(yīng)答。體液免疫在動(dòng)物抗PRV的過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。PRV表面的gB糖蛋白是一種主要的保護(hù)性抗原，抗PRV gB抗體可以阻斷病毒入侵細(xì)胞[11-12]。當(dāng)病毒入侵細(xì)胞之后，細(xì)胞的免疫應(yīng)答發(fā)揮重要的抗病毒作用。淋巴細(xì)胞增殖水平反映了機(jī)體細(xì)胞免疫應(yīng)答水平。不同的絲裂原刺激不同的淋巴細(xì)胞發(fā)生增殖和分化，Con A刺激T淋巴細(xì)胞，而LPS刺激B淋巴細(xì)胞[13]。本試驗(yàn)結(jié)果表明，GSLS-Se能夠顯著提高ConA、LPS和PRV抗原誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞增殖水平，說(shuō)明細(xì)胞免疫水平提高了。在細(xì)胞免疫應(yīng)答過(guò)程中，激活的T細(xì)胞分泌多種具有免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子，Th1型細(xì)胞主要分泌IFN-γ、IL-2、IL-12等細(xì)胞因子，Th2型細(xì)胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子。機(jī)體抗體亞類(lèi)的產(chǎn)生受不同細(xì)胞因子的影響，Th1型細(xì)胞因子促進(jìn)B淋巴細(xì)胞產(chǎn)生具有抗病毒作用的IgG2a，而Th2主要促進(jìn)機(jī)體產(chǎn)生IgG1[14-17]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GSLS-Se能夠顯著性提高小鼠血清IgG2a和IgG1亞類(lèi)水平，并顯著上調(diào)免疫小鼠脾淋巴細(xì)胞經(jīng)PRV抗原刺激后Th1型(IFN-γ，IL-2)和Th2型(IL-6)細(xì)胞因子的分泌水平，說(shuō)明GSLS-Se對(duì)Th1型和Th2型免疫應(yīng)答均有促進(jìn)作用。

圖5 小鼠脾淋巴細(xì)胞細(xì)胞因子IFN-γ(A)、IL-2 (B)、IL-4 (C)和IL-6 (D)水平

圖6 小鼠攻毒后的生存率

口服是中藥的傳統(tǒng)給藥途徑。YU等[8]證明口服GSLS能夠顯著提高免疫抑制狀態(tài)下的雞對(duì)滅活雞新城疫和流感二聯(lián)疫苗的免疫應(yīng)答水平。LI等[6]報(bào)道，免疫前口服GSLS能夠顯著性提高小鼠特異性FMD IgG及其亞類(lèi)水平。Se是人和動(dòng)物必需的微量元素，有研究報(bào)道在豬瘟疫苗中添加Se使動(dòng)物血液中B淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，并能夠快速誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生特異性抗體，且維持較長(zhǎng)時(shí)間[18]。毛跟年等[19]報(bào)道，在AI滅活疫苗中添加Se能顯著提高雞HI抗體水平。在本研究中，口服GSLS配合在疫苗中添加Se可顯著增強(qiáng)PRV滅活疫苗誘導(dǎo)的體液免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答水平，提高免疫動(dòng)物抵抗PRV野毒感染的能力。因此，GSLS-Se的免疫增強(qiáng)作用是由于GSLS和Se共同起作用的結(jié)果，值得在本動(dòng)物上進(jìn)行進(jìn)一步的研究。