王小月，李丹，藍肇煜，武靜橋，范真瑋，姚景麗，何敬文，趙微，陳婷，金天明

(天津農(nóng)學院動物科學與動物醫(yī)學學院，天津 300384)

抗菌肽(antimicrobial peptides)是一類具有免疫功能的小分子多肽，由10～60個氨基酸殘基構成，廣泛存在于各種生物體內[1]。由于抗菌肽易被蛋白酶分解，在生物體內不易形成殘留，因此，不易形成耐藥性，現(xiàn)已成為抗生素替代領域的研究大熱點。TLN-58是2016年被發(fā)現(xiàn)于人掌跖膿皰病中的一種抗菌肽[2]，含有58個氨基酸，帶有7個靜正電荷，疏水性為34%，對人紅細胞無溶血活性，對金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和鏈球菌均具有抑菌活性[3]。人溶菌酶(human lysozyme，hLYZ)又名N-乙?；谒崴饷福侨梭w免疫防御的組成部分，其通過水解細菌細胞壁中N-乙酰胞壁酸和N-乙酰葡糖胺之間的β-1，4糖苷鍵而起到裂解細菌的作用[4]。hLYZ抗菌作用廣，因獨特的作用機理使得其不會產(chǎn)生抗藥性、耐藥性、藥物蓄積、藥物殘留及其他副作用。hLYZ對致病菌(包括革蘭陽性和陰性菌)都具有明顯的抑菌作用，還可增強機體的免疫力[5]。鑒于上述特性，本試驗對TLN-58和hLYZ融合基因的細胞毒性進行檢測，為后續(xù)利用hLYZ和TLN-58融合基因替代常規(guī)抗生素時的安全性提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料

pMD-TLN-58(KanR)、pMD-hLYZ(KanR)、pEGFP-N1 Vector(KanR)、大腸桿菌XL-10Gold感受態(tài)細胞購自上海捷瑞生物工程有限公司；HEK293細胞由天津農(nóng)學院預防獸醫(yī)學實驗室保存。

1.2 重組真核質粒的構建

根據(jù)The Antimicrobial Peptide Database中的TLN-58基因序列(APD ID：AP02750)和GeneBank中hLYZ基因標準序列(NC_000012.10)結合真核表達載體pEGFP-N1分別設計特異性引物(見表1)，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 擴增目的片段的引物

利用限制性內切酶BamHⅠ和EcoRⅠ分別對質粒pMD-TLN-58、pMD-hLYZ和真核表達載體pEGFP-N1進行消化。通過薄型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒對消化產(chǎn)物進行回收和純化，采用SanPrep柱式膠回試劑盒回收酶切產(chǎn)物。利用T4 DNA連接酶，將雙酶切后膠回收獲得的hLYZ和TLN-58基因分別與真核表達載體pEGFP-N1于16 ℃連接過夜，采用融合表達的方式構建雙基因重組質粒。將制備成功的重組真核質粒分別轉化感受態(tài)XL-10Gold，再經(jīng)PCR鑒定和測序分析篩選出陽性菌。

1.3 重組真核質粒轉染條件的摸索

根據(jù)文獻設定重組真核質粒pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58的DNA用量分別為0.5、1、1.5和2 μg，GeneTwinTW轉染試劑和質粒的比例設定為1∶3。將GeneTwinTW稀釋液滴加到DNA稀釋液中，獲得轉染復合物，然后將轉染復合物逐滴加入到24孔板各孔中央，置于5% CO2細胞培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)。分別在8，12，24及48 h，用倒置熒光顯微鏡觀察并記錄，計算轉染后細胞存活率，確定質粒DNA的最佳用量，GeneTwinTW轉染試劑和質粒的比例及轉染時間，試驗重復3次。

1.4 RT-PCR檢測目的基因表達情況

采用TRIzol法從轉染24 h后的HEK293細胞中提取細胞總RNA，利用逆轉錄試劑盒獲得cDNA模板后，以表1中的引物，PCR檢測目的基因，對構建的重組質粒進行鑒定。

1.5 DAPI染色和AO/EB染色檢測細胞凋亡

首先選擇DAPI作為染色劑，將轉染成功的HEK293細胞，棄上清液，加少量DAPI覆蓋樣品，室溫染色5～10 min；吸出DAPI染色液，用PBS洗滌2～3次；置熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長360～400 nm，試驗重復3次。然后進行AO/EB染色，當轉染成功的HEK293細胞匯合度達到80%～90%且生長狀態(tài)良好時，離心后調整細胞濃度為1×106個/mL，取90 μL細胞懸液，加入5 μL AO染色液和5 μL EB染色液(AO∶EB=1∶1)，室溫避光孵育1～5 min，充分作用后置于熒光顯微鏡下觀察，試驗重復3次。

1.6 CCK-8法檢測重組真核表達產(chǎn)物的細胞毒性

為了確定重組真核質粒對HEK293細胞的的細胞毒性，通過CCK-8試驗檢測重組質粒對細胞活力的影響。將對數(shù)生長期且狀態(tài)良好的HEK293細胞調整細胞濃度為5×104個/mL，充分混勻后，96孔板中每孔加100 μL，置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。重組真核質粒的DNA用量分別為0.5、1、1.5和2 μg，GeneTwinTW轉染試劑和質粒的比例為1∶3混勻，終體積為100 μL，每組均設5個復孔，同時設置PBS加細胞、培養(yǎng)基加細胞和只加培養(yǎng)基3組對照。孵育一定時間(24，48，72及96 h)，到達檢測時間點時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入100 μL稀釋后的CCK-8溶液；37 ℃培養(yǎng)箱中避光孵育0.5，1，2及4 h，使用酶標儀檢測OD450值，試驗重復3次。

按下列公式計算細胞活力：細胞活力(%)=(AC-A0)/(AS-A0)×100% 。

AC(試驗組)：轉染后細胞的吸光度；A0(空白組)：不含細胞的吸光度；AS(對照組)：有細胞，但細胞沒被轉染的吸光度。

1.7 流式細胞術檢測轉染重組質粒對細胞周期的影響

在6孔細胞培養(yǎng)板中轉染成功的HEK293細胞匯合度達到80%～90%且生長狀態(tài)良好時，進行細胞周期檢測。根據(jù)細胞周期檢測試劑盒KGA511-KGA512說明書處理細胞：用PBS洗滌2次，離心棄去上清后，收集并調整細胞濃度為1×106/mL，取1 mL單細胞懸液離心，去除上清液，在細胞中加入體積分數(shù)為70%冷乙醇500 μL固定(2 h至過夜)，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液，將Rnase A∶PI工作液按1∶9體積配制成染色工作液，在每管中各加500 μL染色工作液，室溫避光30～60 min，用流式細胞儀檢測，記錄激發(fā)波長488 nm處紅色熒光，每組設3個重復。

2 結果與分析

2.1 重組真核質粒的構建

利用特異性引物，以pMD-TLN-58和pMD-hLYZ質粒為模板，經(jīng)過雙酶切和產(chǎn)物膠回收轉化感受態(tài)細胞XL-10Gold，獲得重組真核質粒，菌液PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，分別擴增到638 bp的hLYZ和TLN-58融合基因片段、464 bp的hLYZ基因片段和197 bp的TLN-58基因片段，目的條帶與預期相符，結果見圖1。將測序結果與GenBank中的標準序列進行BLAST分析比對，結果表明，TLN-58基因和hLYZ基因序列與已發(fā)表的基因序列的同源性為100%，且無堿基缺失、增添和突變。陽性重組真核質粒分別命名為pEGFP-N1-TLN-58、pEGFP-N1-hLYZ和pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58。

M.DL2500 Marker；1.hLYZ-TLN-58 基因；2. hLYZ 基因；3. TLN-58 基因

2.2 重組真核質粒轉染HEK293細胞的條件優(yōu)化

在熒光倒置顯微鏡的藍色激發(fā)光下，觀察24孔細胞培養(yǎng)板中經(jīng)重組真核質粒轉染24 h后的HEK293細胞綠色熒光蛋白表達量和細胞狀態(tài)。當質粒DNA用量為1 μg和GeneTwinTW轉染試劑用量為3 μL時，轉染24 h為最佳轉染條件，此時的綠色熒光蛋白表達量最高且細胞狀態(tài)較好，見圖2。

2.3 RT-PCR檢測目的基因表達情況

分別利用表1中的引物，PCR檢測各重組真核質粒轉染24 h后的HEK293細胞中hLYZ-TLN-58融合基因、hLYZ基因和TLN-58基因轉錄情況，結果顯示分別在638、464和197 bp處獲得目的基因條帶(見圖3)。表明重組質粒攜帶目的基因，并可在HEK293細胞中正確轉錄表達。

2.4 重組質粒對細胞凋亡的影響

將重組真核質粒分別轉染HEK293細胞，24 h后將轉染后的細胞經(jīng)DAPI染色，顯微鏡下觀察，細胞核變化情況較對照組區(qū)別不大，未呈致密濃染，未見明顯細胞凋亡。用重組真核質粒轉染HEK293細胞24 h后，經(jīng)AO/EB染色結果顯示，對照組的細胞多呈綠色熒光，未見細胞病變(CPE)，在pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58組中觀察到凋亡細胞現(xiàn)象較少，結果見圖4。

圖2 熒光顯微鏡下觀察轉染HEK293細胞

M.DL2500 Marker；1.hLYZ-TLN-58 基因；2. hLYZ 基因；3. TLN-58 基因

圖4 DAPI染色和AO/EB染色檢測細胞凋亡

2.5 重組真核表達產(chǎn)物對細胞毒性作用的檢測

重組真核質粒轉染HEK293細胞24 h后細胞活力隨著質粒用量的增加而降低，當質粒用量為1 μg時細胞活力最大，加CCK-8后孵育2 h，用酶標儀在450 nm波長處檢測每孔的光吸收值較穩(wěn)定。利用CCK-8測定分析重組質粒的細胞毒性，當pEGFP-N1質粒用量為4 μg時，轉染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為62.48%；當pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58質粒用量為2 μg時，轉染96 h加CCK-8后孵育2 h其細胞活力最小為61.01%；當pEGFP-N1-hLYZ質粒用量為4 μg時，轉染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為65.47%；當pEGFP-N1-TLN-58質粒用量為4 μg時，轉染96 h加CCK-8后孵育4 h其細胞活力最小為66.62%。重組真核質粒的細胞活力較好，說明重組真核質粒的細胞毒性較小，為安全低毒，重組真核質粒的構建是完全有意義的。結果見圖5-圖8。

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

A. 孵育0.5 h；B. 孵育1 h；C. 孵育2 h；D. 孵育4 h

2.6 轉染重組質粒對細胞周期的影響

流式細胞儀檢測細胞周期，結果顯示，試驗組pEGFP-N1-TLN-58轉染的細胞與對照組未經(jīng)轉染的細胞相比G1%、G2%比例升高，S%比例降低，但升高和降低均不顯著(見圖9)。經(jīng)重組真核質粒轉染后的試驗組細胞與對照組的細胞相比G1%、G2%和S%無顯著區(qū)別。說明經(jīng)重組質粒轉染后對細胞周期無顯著影響。

圖9 流式細胞儀檢測細胞周期

3 討論

隨著分子生物學技術的發(fā)展，抗生素的頻繁使用，導致越來越多的病原微生物對傳統(tǒng)抗生素不僅出現(xiàn)了耐藥性，還有很強的毒副作用。這一情況使得人類對新型抗菌藥物的探究變得非常迫切，利用基因工程技術在生物、食品、醫(yī)學等領域開展相關研究變得越來越廣泛[6]。研究表明抗菌肽是生物體內天然防御系統(tǒng)的一個重要組成部分，抗菌肽TLN-58抗菌譜廣，對革蘭陽性菌和陰性菌均有抑制作用[7]。hLYZ具有廣譜抗菌性，對奶牛乳房炎的主要致病菌如金黃色葡萄球菌、鏈球菌和大腸桿菌等都具有明顯的抑制作用[8]。TLN-58和hLYZ聯(lián)用可增加抑菌效果和抑菌譜。天然的TLN-58和hLYZ抗菌肽分布廣但獲取困難，因其分子量大，難以形成正確的空間構象，無法實現(xiàn)人工直接合成，需要采用基因表達的方式純化出蛋白。通過本研究可實現(xiàn)TLN-58和hLYZ融合表達，無細胞毒性，為后續(xù)純化蛋白奠定基礎。

一般情況下，通過篩選、優(yōu)化影響轉染效率最大的因素，即轉染試劑GeneTwinTW和DNA質粒的用量以及轉染時間，進而確定轉染試劑和DNA質粒的最佳用量[9]。本研究結果表明，轉染試劑GeneTwinTW和DNA質粒的用量及轉染時間都影響著細胞的轉染效率。當質粒DNA用量為1 μg、GeneTwinTW轉染試劑用量為3 μL時，即GeneTwinTW轉染試劑和質粒DNA用量比例為1∶3，轉染時間為24 h時，能得到最佳的轉染條件，且該轉染條件不會影響綠色熒光蛋白的正常表達。本研究構建的重組真核質粒均在HEK293細胞中獲得轉錄，篩選出最優(yōu)轉染條件可以提高目的基因的表達效率。

通過DAPI染色、AO/EB染色和CCK-8法檢測細胞凋亡，測定經(jīng)過不同質粒DNA用量轉染HEK293細胞的相對增殖率，可用于分析重組質粒的細胞毒性[10]。本研究獲得的重組質粒經(jīng)試驗證實細胞毒性相對較小。利用流式細胞術檢測細胞周期，結果顯示，在G1、G2及S期各處理組無顯著差異，證明構建的重組質粒對HEK293細胞周期無顯著影響。

綜上，本研究首次將TLN-58和hLYZ融合表達，構建出能夠高效穩(wěn)定融合表達外源基因的真核表達載體pEGFP-N1-hLYZ-TLN-58，通過對重組真核表達質粒細胞毒性的驗證，為后續(xù)該融合蛋白抑菌活性研究奠定基礎。