吳柳松， 何 英， 徐洪波， 陳 艷

（遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院小兒內(nèi)二科，貴州遵義563000）

手足口病（hand，foot and mouth disease，HFMD）是一種由屬于小RNA 病毒科的多種腸道病毒引起的兒童常見(jiàn)急性傳染?。?］，好發(fā)于學(xué)齡前兒童。部分患兒可出現(xiàn)腦炎、肺水腫、無(wú)菌性腦膜腦炎以及循環(huán)衰竭等嚴(yán)重并發(fā)癥，嚴(yán)重危害嬰幼兒身體健康，甚至可能導(dǎo)致死亡。雖然手足口病的易感因素、發(fā)病機(jī)制及免疫特點(diǎn)等至今尚未完全明確，但宿主基因與病毒易感性的關(guān)系越來(lái)越受重視［2］。已經(jīng)證實(shí)，宿主基因遺傳背景在HFMD 的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，宿主的遺傳因素可通過(guò)調(diào)控某些細(xì)胞因子的表達(dá)或?qū)?xì)胞因子的反應(yīng)性而調(diào)控宿主的免疫狀態(tài)［3］。

干擾素γ（interferon-γ，IFN-γ）是一種由特異性抗原刺激T 淋巴細(xì)胞產(chǎn)生的多功能細(xì)胞因子，具有抗病毒、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)等重要作用［4］。研究證實(shí)，IFN-γ 的異常表達(dá)與HFMD 的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，是HFMD 病情嚴(yán)重程度及病情進(jìn)展過(guò)程中的重要細(xì)胞因子，在HFMD 發(fā)病早期就出現(xiàn)表達(dá)升高，并可提示疾病重癥發(fā)展的趨勢(shì)［5］。2'，5'-寡聚腺苷酸合成酶1（2'，5'-oligoadenylate synthetase 1，OAS1）是一種由干擾素誘導(dǎo)的抗病毒蛋白，具有激活潛在性RNA 酶活性、降解病毒mRNA、抑制病毒蛋白合成和促進(jìn)病毒感染細(xì)胞發(fā)生凋亡的作用［6］。OAS1也是細(xì)胞信號(hào)通路中對(duì)細(xì)胞和環(huán)境脅迫產(chǎn)生響應(yīng)的重要激酶，參與機(jī)體非特異性免疫和特異性免疫，在機(jī)體的抗病毒、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用［3，7］。有研究報(bào)道，OAS1 作為干擾素刺激基因（IFN-stimulated genes，ISGs）成員之一，其SNP 類(lèi)型以及表達(dá)異常與HFMD 的易感性和臨床表型相關(guān)［8］。然而，在HFMD中，IFN-γ 是否可以介導(dǎo)OAS1 基因的表達(dá)上調(diào)，依賴(lài)何種途徑？目前尚不清楚。本研究主要探討IFNγ 介導(dǎo)OAS1 基因表達(dá)升高的分子機(jī)制，并從遺傳學(xué)角度為兒童HFMD 病情進(jìn)展的早期診治及發(fā)病機(jī)制提供理論依據(jù)。

材料和方法

1 研究對(duì)象

本研究選取于2015 年10 月～2019 年12 月在遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院兒科住院治療的140 例HFMD患者，其中男童95 例，女童45 例，中位年齡2 歲5 個(gè)月，診斷均符合我國(guó)衛(wèi)建委制定的《手足口病診療指南（2018 版）》標(biāo)準(zhǔn)。另外以同期在我院體檢的健康兒童60 例作為健康對(duì)照組，其中男童34 例，女童26例，中位年齡2 歲1 個(gè)月；所有病例組及對(duì)照組兒童入組實(shí)驗(yàn)均經(jīng)過(guò)家屬同意，并簽署知情同意書(shū)，所有檢測(cè)對(duì)象均于住院或就診當(dāng)日清晨空腹采集外周靜脈血5 mL，上述研究得到遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意。

2 病例分組

根據(jù)不同臨床表現(xiàn)以及病情輕重，分為普通或輕癥手足口?。╩ild HFMD，mHFMD）以及重癥手足口?。╯evere HFMD，sHFMD），其中mHFMD 組82例，sHFMD 組58 例。mHFMD 為急性起病，伴或不伴發(fā)熱，口腔粘膜出現(xiàn)散在皰疹，手、足和臀部出現(xiàn)斑丘疹、皰疹，可伴有咳嗽、流涕、食欲不振等癥狀。sHFMD 表現(xiàn)為中樞神經(jīng)系統(tǒng)或者心肺功能損傷，在發(fā)病1～5 d 左右出現(xiàn)腦膜炎、腦炎、腦脊髓炎、肺水腫、循環(huán)障礙等，體征可見(jiàn)腦膜刺激征，腱反射減弱或消失，MRI顯示有腦部病變。

3 試劑與儀器

RPMI-1640 培養(yǎng)基和胎牛血清（Gibco）；IFN-γ和AG490（Sigma）；兔抗OAS1、Janus 激酶（Janus ki?nase，JAK）1、JAK2、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（sig?nal transducer and activator of transcription，STAT）1、p-JAK1、JAK2 和p-STAT1 單克隆抗體（Abcam）；兔抗β-actin 單克隆抗體和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG（H+L）購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)公司；Trizol（Invitrogen）；PCR 引物（上海生工生物工程公司）；RT-qPCR 試劑盒（TaKaRa）。超微量分光光度計(jì)（Implen）；高速離心機(jī)和Centrifuge 5804R 高速冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；ChemiDoc 型凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad）；超凈工作臺(tái)（北京亞泰科隆科技公司）；賽默飛3111 型CO2培養(yǎng)箱和Varioskan Lux 全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀（Thermo Scientific）。

4 方法

4.1 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononu?clear cells，PBMCs）的提取和培養(yǎng) 取HFMD 患兒肝素抗凝外周血2 mL，用等體積生理鹽水稀釋混勻后，緩慢沿試管壁加入到含有等總體積的Ficoll 液面之上；室溫下2 000 r/min 離心30 min，可見(jiàn)試管內(nèi)的液體清晰地分為4 層，單個(gè)核細(xì)胞為處于第1 層和第2層中間的白色細(xì)胞；用吸管將單個(gè)核細(xì)胞層吸出收集到另1 試管中，用生理鹽水洗滌2 遍，室溫下1 500 r/min 離心10 min，棄上清后即得到較高純度的單個(gè)核細(xì)胞懸液。

4.2 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 將PBMCs 加入到含10%胎牛血清的RPMI-l640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。使用前將常規(guī)培養(yǎng)的PBMCs細(xì)胞無(wú)血清同步化培養(yǎng)24 h后隨機(jī)分成3 組：對(duì)照（control）組、IFN-γ 干預(yù)組（用5×105U/L IFN-γ 干預(yù)細(xì)胞）和IFN-γ+AG490 干預(yù)組（用200 mmol/L AG490預(yù)處理45 min后加入5×105U/L IFN-γ 干預(yù)細(xì)胞），分別于加IFN-γ 前（0 h）和加IFN-γ后2、4、8、12和24 h收集細(xì)胞。

4.3 RT-qPCR 檢測(cè)OAS1 的mRNA 表達(dá) 取新鮮肝素抗凝外周血4 ml，室溫下2000 r/min 離心10 min，棄上清。取250 μL 血細(xì)胞按1∶4 體積加入RNAiso Plus，冰上裂解10 min，按說(shuō)明書(shū)要求分別加入氯仿、異丙醇、無(wú)水乙醇以及離心處理，待提出總RNA 后，用適量的DEPC 水稀釋?zhuān)贜D-1000分光光度計(jì)上檢測(cè)RNA 的濃度和純度。按Trizol 法提取PBMCs 總RNA，經(jīng)紫外分光光度計(jì)定量。嚴(yán)格按RT-qPCR 試劑盒操作進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件：37℃15 min，85℃5 s，4℃hold。逆轉(zhuǎn)錄完成后的cDNA 加入到RT-qPCR 反應(yīng)體系中。OAS1 的上游引物序列為5'-GTCAGTTGACTGGCGGCTAT-3'，下游引物序列為5'-CGCTGCTTCAGGAAGTCTCT-3'；GAPDH 的上游引物序列為5'-TCAAGAAGGTGGTGAAGCAGG-3'，下游引物序列為5'-AGCGTCAAAGGTGGAG?GAGTG-3'。RT-qPCR 條件為：95℃3 min；95℃5 s，59.5℃30 s，共30 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 作為內(nèi)參照，目的基因OAS1的表達(dá)根據(jù)儀器檢測(cè)的Ct值，通過(guò)公式2-ΔΔCt進(jìn)行相對(duì)定量分析計(jì)算得到。

4.4 Western blot 檢測(cè)OAS1、JAK1、JAK2、p-JAK1、JAK2、STAT1和p-STAT1的蛋白水平 如4.3所述將外周血離心、棄上清后，取500 μL 血細(xì)胞，按1∶2 體積加入RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，收集充分裂解的細(xì)胞及所有殘液，4℃、12000 r/min 離心30 min，取上清，用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。收集不同時(shí)點(diǎn)的PBMCs，按說(shuō)明書(shū)要求冰上提取細(xì)胞總蛋白和核蛋白，用BCA法進(jìn)行蛋白定量。取蛋白40～80 μg，進(jìn)行SDS-PAGE 分離和轉(zhuǎn)膜操作，室溫下用5%脫脂奶粉溶液封閉2 h，磷酸化抗體用5% BSA 溶液封閉2 h，按對(duì)應(yīng)抗體推薦濃度加入I 抗4℃孵育過(guò)夜，經(jīng)TBST洗膜后加入對(duì)應(yīng)HPR 標(biāo)記的IgG，孵育后洗膜，ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)目的條帶，在凝膠成像系統(tǒng)上觀(guān)察分析并拍照。用目的蛋白與內(nèi)參照蛋白的灰度值之比計(jì)算相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。實(shí)驗(yàn)計(jì)量數(shù)據(jù)按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示，資料經(jīng)正態(tài)性及方差齊性檢驗(yàn)后，進(jìn)行單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 和Dunnett 法。以P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 OAS1在HFMD患兒外周血中的表達(dá)

分別用RT-qPCR 以及Western blot 檢測(cè)HFMD患兒外周血OAS1 的表達(dá)，結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，mHFMD 組和sHFMD 組OAS1 的mRNA 表達(dá)明顯升高（P＜0.01），sHFMD 組OAS1 的mRNA 表達(dá)顯著高于mHFMD 組（P＜0.01），即隨著HFMD 病情加重，OAS1的mRNA 表達(dá)進(jìn)一步升高；Western blot 的結(jié)果與RT-qPCR結(jié)果一致，見(jiàn)圖1。

2 IFN-γ 能夠上調(diào)HFMD 患兒PBMCs 中OAS1 的表達(dá)

在HFMD 患兒PBMCs中加入5×105U/L IFN-γ和200 mmol/L AG490 進(jìn)行干預(yù)，分別于0、2、4、8、12 和24 h 不同時(shí)點(diǎn)收集細(xì)胞，Western blot 檢測(cè)PBMCs 細(xì)胞中OAS1蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組相比，IFN-γ干預(yù)組PBMCs中各觀(guān)察時(shí)點(diǎn)OAS1的蛋白水平隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，并呈時(shí)間依賴(lài)性（P＜0.05），而AG490+IFN-γ 組PBMCs 中OAS1 蛋白的表達(dá)較IFN-γ 組呈時(shí)間依賴(lài)性顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 IFN-γ 能 夠 促 進(jìn)PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1磷酸化

在HFMD 患兒PBMCs 中加入IFN-γ 以及AG490進(jìn)行干預(yù)，分別于0、2、4、8、12 和24 h 不同時(shí)點(diǎn)收集細(xì) 胞，Western blot 檢 測(cè)PBMCs 中JAK1、JAK2 和STAT1 蛋白及磷酸化的水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IFN-γ 刺激組的細(xì)胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各時(shí)點(diǎn)p-JAK1、p-JAK2和p-STAT1的蛋白水平較正常對(duì)照組均顯著升高（P＜0.05），并隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，呈時(shí)間依賴(lài)性；在各時(shí)點(diǎn)之間，JAK1、JAK2和STAT1蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性（P?0.05）；AG490+IFNγ 組 的p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 蛋 白 水 平 較 較IFN-γ組均顯著降低，并隨著干預(yù)時(shí)間的延長(zhǎng)呈時(shí)間依賴(lài)性降低（P?0.05），見(jiàn)圖3。

4 IFN-γ促進(jìn)PBMCs中STAT1蛋白核轉(zhuǎn)位

Figure 1. The expression of OAS1 at mRNA（A）and protein（B）levels in the peripheral blood of children with HFMD. Mean±SD. *P＜0.05 vs control group；▲P＜0.05 vs mHFMD group.圖1 OAS1在HFMD患兒外周血中的表達(dá)

提取細(xì)胞的核蛋白，以histone H3 為內(nèi)參照，采用Western blot 檢測(cè)PBMCs 中STAT1 核蛋白水平，結(jié)果顯示，IFN-γ 刺激組的細(xì)胞在0、2、4、6、8、12 和24 h 各時(shí)點(diǎn)STAT1 核蛋白水平較正常對(duì)照組均顯著升高（P?0.05），并隨著刺激時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸升高，呈時(shí)間依賴(lài)性；AG490+IFN-γ 組STAT1 核蛋白的表達(dá)較IFN-γ組則呈時(shí)間依賴(lài)性顯著降低，核轉(zhuǎn)位顯著減少（P?0.05），見(jiàn)圖4。

討 論

Figure 2. The expression of OAS1 protein in the PBMCs of chil?dren with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖2 HFMD患兒PBMCs細(xì)胞中OAS1蛋白的表達(dá)

HFMD 是一種由多種腸道病毒引起的兒童常見(jiàn)傳染病，若不及早有效準(zhǔn)確進(jìn)行診治和干預(yù)極易進(jìn)展為重癥，嚴(yán)重危害患兒身體健康。目前，HFMD 的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，越來(lái)越多的研究證實(shí)，機(jī)體免疫細(xì)胞功能紊亂和細(xì)胞因子的表達(dá)異常在HFMD的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵和核心作用［9］。INF-γ 作為一種多功能細(xì)胞因子，是抗病毒感染、抗腫瘤免疫反應(yīng)等多個(gè)生理病理過(guò)程中的關(guān)鍵調(diào)控因子。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，INF-γ 在HFMD 的發(fā)病過(guò)程中起重要作用，并可作為HFMD 病情嚴(yán)重程度的重要評(píng)估指標(biāo)之一（文章待發(fā)）。通常，INF-γ誘導(dǎo)的自身免疫反應(yīng)是通過(guò)介導(dǎo)下游誘導(dǎo)基因的功能來(lái)實(shí)現(xiàn)的。近年來(lái)，有研究顯示INF-γ及其誘導(dǎo)的下游基因在病毒感染性疾病特別是HFMD 的發(fā)病中具有重要作用。已經(jīng)證實(shí)，ISGs 在機(jī)體內(nèi)可放大INF-γ 信號(hào)，激活適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒和免疫調(diào)節(jié)作用，但其具體機(jī)制尚不清楚。

近年來(lái)，JAK/STAT 信號(hào)通路的激活，在對(duì)抗病毒感染方面起到十分重要的作用［10］。研究已經(jīng)證實(shí)，IFN-γ 可介導(dǎo)JAK/STAT 信號(hào)通路的激活，IFN-γ首先與靶細(xì)胞上受體結(jié)合，發(fā)生二聚體化后，再與細(xì)胞表面的受體結(jié)合，同時(shí)激活JAK-1 和JAK-2，JAK-1與受體α 亞基相互作用，JAK-2 與β 亞基相互作用，引起STAT1 的磷酸化，磷酸化的STAT1 形成二聚體INF-γ 激活因子（INF-gamma activated factor，GAF），進(jìn)入核內(nèi)與INF-γ 激活位點(diǎn)（INF-gamma activated site，GAS）反應(yīng)元件結(jié)合［11］，從而啟動(dòng)下游相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)［12］。

Figure 3. The protein and phosphorylation levels of JAK1，JAK2 and STAT1 in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖3 HFMD患兒PBMCs細(xì)胞中JAK1、JAK2和STAT1的蛋白和磷酸化水平

Figure 4. The expression of STAT1 nucleoprotein in the PBMCs of children with HFMD. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs 0 h group.圖4 HFMD患兒PBMCs中STAT1核蛋白的表達(dá)

本研究發(fā)現(xiàn)，HFMD 患兒外周血OAS1 基因的表達(dá)明顯高于正常對(duì)照組，并且隨著HFMD 病情從mHFMD 到sHFMD 逐漸加重，OAS1 基因的表達(dá)進(jìn)一步顯著升高，這提示了OAS1 基因可能參與了HFMD的發(fā)生發(fā)展。OAS1屬于OAS 家族，是病毒感染先天反應(yīng)的免疫蛋白，OAS1 的C 末端可以激活潛在的RNase L，調(diào)節(jié)核糖核酸酶L的抗病毒活性，導(dǎo)致病毒RNA 的降解，抑制病毒復(fù)制［13-14］。本研究在體外培養(yǎng)的HFMD 患兒PBMCs 細(xì)胞中加入IFN-γ 進(jìn)行干預(yù)，結(jié) 果 顯 示，IFN-γ 能 夠 顯 著 上調(diào)HFMD 患 兒PBMCs 細(xì)胞中OAS1基因的表達(dá)，并隨著刺激時(shí)間延長(zhǎng)，其相對(duì)表達(dá)量也呈時(shí)間依賴(lài)性上升趨勢(shì)，這表明IFN-γ能夠通過(guò)刺激介導(dǎo)OAS1的表達(dá)，來(lái)放大INF-γ信號(hào)，激活機(jī)體適應(yīng)性免疫反應(yīng)，發(fā)揮抗病毒感染和病毒清除作用。

本研究還發(fā)現(xiàn)，在IFN-γ 刺激下，p-JAK1、p-JAK2 和p-STAT1 的蛋白水平呈時(shí)間依賴(lài)性升高，而JAK1、JAK2和STAT1 蛋白表達(dá)水平的差異未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性；STAT1 核蛋白的表達(dá)也呈時(shí)間依賴(lài)性升高，有研究曾在人宮頸上皮細(xì)胞（End1/E6E7細(xì)胞）中證實(shí)，STAT1 可以誘導(dǎo)OAS1 的表達(dá)升高［15］，這提示IFN-γ 可能是通過(guò)激活JAK/STAT1 信號(hào)通路從而上調(diào)HFMD患兒OAS1表達(dá)的。

為了進(jìn)一步證實(shí)JAK/STAT 信號(hào)途徑是否參與了IFN-γ 誘導(dǎo)的OAS1基因表達(dá)升高，本研究預(yù)先采用JAK/STAT 特異性信號(hào)通路抑制劑AG490 處理細(xì)胞后，再加入IFN-γ 進(jìn)行干預(yù)。結(jié)果顯示，在IFN-γ+AG490 組p-JAK1、p-JAK2、p-STAT1 和STAT1 核蛋白以及OAS1 的水平均較IFN-γ 單獨(dú)刺激組呈時(shí)間依賴(lài)性顯著降低。這說(shuō)明PBMCs 細(xì)胞經(jīng)AG490 處理后，IFN-γ 刺激不能引起細(xì)胞內(nèi)JAK 磷酸化，STAT1蛋白的核轉(zhuǎn)位也顯著降低，IFN-γ 刺激OAS1 的表達(dá)也受到抑制，提示IFN-γ 可能是通過(guò)磷酸化JAK1、JAK2-STAT1 信號(hào)通路，并促進(jìn)了STAT1 蛋白核轉(zhuǎn)位，從而誘導(dǎo)OAS1表達(dá)的。

綜上所述，本研究結(jié)果表明IFN-γ 可以上調(diào)HFMD 患兒OAS1基因的表達(dá)，其機(jī)制可能與激活JAK/STAT信號(hào)途徑有關(guān)。