孫奇華， 蔡紅慧， 何愛(ài)玉， 祝炳軍

（紹興文理學(xué)院附屬醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科，浙江紹興312000）

骨質(zhì)疏松是一種常見(jiàn)的代謝性骨病變，表現(xiàn)為骨量減少，骨微結(jié)構(gòu)破壞、骨脆性和骨折風(fēng)險(xiǎn)增加［1］。成骨細(xì)胞是骨重建中的關(guān)鍵細(xì)胞，其活力減弱和功能降低可導(dǎo)致骨形成和骨吸收之間失衡，最終導(dǎo)致骨質(zhì)疏松發(fā)生［2］。因此，如何有效的提高成骨細(xì)胞活力，對(duì)于防治骨質(zhì)疏松癥具有重要意義。菟絲子別名黃絲、黃藤子和豆寄生，是雙子葉植物旋花科植物菟絲子的干燥種子，《中國(guó)藥典》等典籍對(duì)其藥理作用均有記載。菟絲子黃酮（total flavones from Cuscuta chinensis，TFCC）是菟絲子的主要活性成分之一，具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目和免疫增強(qiáng)作用［3-5］。此外，TFCC可能通過(guò)抑制成骨細(xì)胞凋亡對(duì)大鼠激素型骨質(zhì)疏松癥具較好的骨保護(hù)作用［6］，但其具體的分子機(jī)制尚不明確。含BED 型鋅指蛋白3 反義RNA 1（zinc finger BED-type containing protein 3 antisense RNA 1，ZBED3-AS1）是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，lncRNA），可誘導(dǎo)間充質(zhì)干細(xì)胞的成骨分化，提高骨再生能力［7］。然而TFCC 能否通過(guò)調(diào)控ZBED3-AS1 表達(dá)進(jìn)而影響成骨細(xì)胞凋亡尚未可知。因此，本研究通過(guò)觀察TFCC 對(duì)腫瘤壞死因子α（tu?mor necrosis factor-α，TNF-α）處理的成骨細(xì)胞增殖、凋亡及ZBED3-AS1表達(dá)的影響，揭示其分子機(jī)制，以期為TFCC用于防治骨質(zhì)疏松提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料和主要試劑

成骨樣細(xì)胞株UMR-106購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。DMEM 培養(yǎng)液、胎牛血清和青-鏈霉素溶液購(gòu)于Gibco；TNF-α 購(gòu)于Sigma；TFCC 粉購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；ZBED3-AS1 過(guò)表達(dá)載體（pcDNA3.1-ZBED3-AS1）及其對(duì)照（pcDNA3.1）、ZBED3-AS1 小干擾RNA（si-ZBED3-AS1）及其對(duì)照（si-NC）和PCR 引物由上海吉瑪制藥有限公司提供；CCK-8 購(gòu)于日本同仁公司；annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海翊圣生物科技有限公司；RIPA 裂解液和Trizol 試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物科技公司；兔源caspase-3 抗體、兔源p21抗體和山羊抗兔IgG購(gòu)于CST。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 UMR-106 細(xì)胞采用DMEM培養(yǎng)液（添加10%的胎牛血清和1%的青-鏈霉素溶液）進(jìn)行培養(yǎng)，按照1∶3 比例傳代，每周換液2～3 次。將對(duì)數(shù)期UMR-106 細(xì)胞按照每孔2×105接種到6 孔板，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)到50%時(shí)，更換不含血清培養(yǎng)基。首先取50 pmol 的載體與適量無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，使終體積為25 μL，記為混合物A。取1 μL 的Li?pofectamineTM2000 與24 μL 無(wú)血清培養(yǎng)基混勻，記為混合物B。靜置5 min 后，將A 與B 混合，記為混合物C。室溫靜置15 min，將混合物C 加入到融合度約為50%的UMR-106 細(xì)胞中，6 h 后更換含血清培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)染48 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 細(xì)胞分組和處理 UMR-106 細(xì)胞按照每孔2.5×104個(gè)接種于24 孔板，未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞分為對(duì)照（control）組（正常培養(yǎng)）、TNF-α 組（30 μg/L TNF-α 處理24 h［8］）、TNF-α+TFCC-1 組、TNF-α+TFCC-2 組、TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組 和TNF-α+TFCC-5 組，后5 組分別用含0.01、0.1、1、10 和100 μg/L TFCC+30 μg/L TNF-α 的 培 養(yǎng) 基培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1 的細(xì)胞用含30 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)基培養(yǎng)，記為TNF-α+pcDNA3.1組和TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1組。轉(zhuǎn)染si-NC、si-ZBED3-AS1、pcDNA3.1 和pcDNA3.1-ZBED3-AS1的細(xì)胞用含100 μg/L TFCC 和30 μg/L TNF-α 的培養(yǎng)液共同培養(yǎng)。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞用于后續(xù)檢測(cè)。

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將UMR-106 細(xì)胞按照每孔5×103（100 μL）接種于96 孔板，按照實(shí)驗(yàn)分組進(jìn)行細(xì)胞處理后，每孔加入10 μL 的CCK-8 試劑，反應(yīng)2 h；同時(shí)設(shè)置空白孔，用酶標(biāo)儀測(cè)量450 nm 波長(zhǎng)處各孔細(xì)胞吸光度（A），計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。細(xì)胞相對(duì)活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白孔A 值）/（對(duì)照組A值-空白孔A值）×100%

2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡 收集上述各組細(xì)胞，采用結(jié)合緩沖液調(diào)整為密度1×109/L 的細(xì)胞懸液。按照annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒操作步驟，用流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定各組細(xì)胞凋亡情況。

2.5 集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)集落形成能力 用胰酶消化并收集各組UMR-106 細(xì)胞，按照每板100 個(gè)，每皿5 mL 接種于直徑為60 mm 的平板，輕輕晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，培養(yǎng)至出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的細(xì)胞集落時(shí)，棄培養(yǎng)液，洗滌細(xì)胞2次，4%多聚甲醛固定細(xì)胞，0.1%結(jié)晶紫染色，顯微鏡下計(jì)數(shù)大于50個(gè)細(xì)胞的集落形成數(shù)。

2.6 Western blot 檢 測(cè)p21 和caspase-3 蛋 白 的 表達(dá) 細(xì)胞按照上述分組進(jìn)行處理后，加入RIPA 裂解液裂解細(xì)胞，獲得細(xì)胞蛋白，進(jìn)行濃度測(cè)定。取30 μg 蛋白樣品上樣進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜后，5%脫脂牛奶常溫封閉膜1 h，洗膜后將膜置于稀釋的I 抗溶液中室溫條件孵育2 h，洗膜后用稀釋的II 抗溶液在室溫條件孵育膜孵育1 h，加入化學(xué)發(fā)光顯色試劑進(jìn)行顯影。目標(biāo)蛋白的表達(dá)水平采用目標(biāo)蛋白與內(nèi)參照GAPDH蛋白灰度值的比值表示。

2.7 RT-qPCR 檢測(cè)ZBED3-AS1 的表達(dá) 按照Trizol試劑盒說(shuō)明書提取各組細(xì)胞的總RNA，采用核酸蛋白分析儀測(cè)定RNA 純度，隨后利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，采 用SYBR Green 試 劑 盒 以2-ΔΔCt法 檢 測(cè)ZBED3-AS1的表達(dá)水平。ZBED3-AS1的上游引物序列為5'-TACAACTTTGCATTAACCTTCC-3'，下游引物序列為5'-TGCCCTGTCCTCATGTTCG-3'；GAPDH的上游引物序列為5'-CTCTGCTCCTCCTGTTCGAC-3'，下游引物序列為5'-GCGCCCAATACGAC?CAAATC-3'。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。兩組間比較采用t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，組間進(jìn)一步比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞增殖的影響

與control 組比較，TNF-α 組UMR-106 細(xì)胞活力和集落形成能力顯著降低，p21 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細(xì)胞活力、集落形成能力和p21 蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化；與TNF-α組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TFCC-5 組細(xì)胞活力和集落形成能力顯著升高，p21 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖1。

2 TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞凋亡的影響

與control 組比較，TNF-α 組UMR-106 細(xì)胞凋亡率和caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05）；與TNFα 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細(xì)胞凋亡率及caspase-3 蛋白表達(dá)無(wú)顯著變化；與TNFα 組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TFCC-5 組細(xì)胞凋亡率和caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖2。

3 TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞ZBED3-AS1表達(dá)的影響

與control 組比 較，TNF-α 組UMR-106 細(xì) 胞中ZBED3-AS1 表達(dá)顯著降低（P＜0.05）；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-1 組和TNF-α+TFCC-2 組細(xì)胞中ZBED3-AS1 表達(dá)無(wú)顯著變化；與TNF-α 組比較，TNF-α+TFCC-3 組、TNF-α+TFCC-4 組和TNF-α+TF?CC-5 組細(xì)胞中ZBED3-AS1 表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

4 過(guò)表達(dá)ZBED3-AS1 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+pcDNA3.1組比較，TNF-α+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 組UMR-106 細(xì)胞活力和集落形成能力顯著升高，凋亡率顯著降低，p21 和caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

5 抑制ZBED3-AS1 能減輕TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+TFCC-5+si-NC組比較，TNF-α+TFCC-5+si-ZBED3-AS1 組UMR-106 細(xì) 胞 中ZBED3-AS1 表達(dá)顯著降低，細(xì)胞活力和集落形成能力顯著降低，凋亡率顯著升高，p21 和caspase-3 蛋白表達(dá)顯著升高（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

6 過(guò)表達(dá)ZBED3-AS1 能增強(qiáng)TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106細(xì)胞增殖和凋亡的影響

與TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1 組比較，TNF-α+TFCC-5+pcDNA3.1-ZBED3-AS1 組UMR-106 細(xì) 胞 中ZBED3-AS1 表達(dá)顯著升高，細(xì)胞活力和集落形成能力顯著升高，凋亡率顯著降低，p21 和caspase-3 蛋白表達(dá)顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)圖6。

討 論

長(zhǎng)期以來(lái)，菟絲子被認(rèn)為具有骨質(zhì)疏松保護(hù)作用。趙素霞等［9］通過(guò)切除雙側(cè)大鼠卵巢法制備骨質(zhì)疏松模型發(fā)現(xiàn)，TFCC 可增加去卵巢大鼠骨密度，改善骨質(zhì)疏松癥狀。此外，多項(xiàng)體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明10%菟絲子含藥血清和TFCC 均能夠促進(jìn)大鼠成骨細(xì)胞的增殖與分化，具有成骨促進(jìn)作用［10-11］。TNF-α是骨質(zhì)疏松組織中高表達(dá)的細(xì)胞因子之一，其可誘導(dǎo)成骨細(xì)胞凋亡，其誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞是研究骨質(zhì)疏松的常用體外細(xì)胞模型［8，12-13］。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α誘導(dǎo)后UMR-106 細(xì)胞活力顯著降低，凋亡率顯著升高，而一定濃度的TFCC 干預(yù)后TNF-α 誘導(dǎo)的UMR-106 細(xì)胞凋亡率降低，活力和集落形成能力升高，提示TFCC 可提高成骨細(xì)胞的增殖能力，降低成骨細(xì)胞凋亡率。p21是細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶（cyclin-de?pendent kinases，CDKs）抑制劑家族中的重要成員，它通過(guò)抑制CDKs 復(fù)合物活性，阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程，從而發(fā)揮抗增殖作用，抑制p21 可推動(dòng)成骨細(xì)胞周期完成，對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有潛在治療作用［14-15］。cas?pase-3是細(xì)胞凋亡的必經(jīng)之路，其激活可引起細(xì)胞不可逆轉(zhuǎn)的凋亡［16-17］。本研究發(fā)現(xiàn)，TNF-α 誘導(dǎo)后UMR-106 細(xì)胞中p21 和caspase-3 表達(dá)增加，而TFCC干預(yù)可顯著降低p21 和caspase-3 的水平，與功能分析結(jié)果一致。以上研究提示，TFCC可減輕TNF-α誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡。

Figure 1. Effects of TFCC on the viability（A），colony-forming ability（B，C）and p21 protein expression（D）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖1 TFCC對(duì)TNF-α作用下UMR-106細(xì)胞活力、集落形成能力及p21蛋白表達(dá)的影響

Figure 2. Effects of TFCC on apoptosis（A）and caspase-3 protein expression（B）in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD.n=9. *P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖2 TFCC對(duì)TNF-α作用下UMR-106細(xì)胞凋亡及caspase-3蛋白表達(dá)的影響

Figure 3. Effect of TFCC on the expression of ZBED3-AS1 in UMR-106 cells induced by TNF-α. Mean±SD. n=9.*P＜0.05 vs control group；#P＜0.05 vs TNF-α group.圖3 TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞中ZBED3-AS1表達(dá)的影響

Figure 4. Effects of over-expression of ZBED3-AS1（A）on the viability（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+pcDNA3.1 group.圖4 過(guò)表達(dá)ZBED3-AS1對(duì)TNF-α作用下UMR-106細(xì)胞活力、集落形成能力、凋亡及p21和caspase-3蛋白表達(dá)的影響

ZBED3-AS1 的基因位于5q13.3，研究顯示ZBED3-AS1 在誘導(dǎo)軟骨分化過(guò)程中上調(diào)，可促進(jìn)人滑液間充質(zhì)干細(xì)胞和骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化，對(duì)骨關(guān)節(jié)炎的治療具有重要意義［18-19］。此外，ZBED3-AS1通過(guò)靶向IL-1β可增加礦化結(jié)節(jié)數(shù)量，提高堿性磷酸酶活性，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化，提高骨再生能力［7］。本研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的TFCC 干預(yù)可升高TNF-α 誘導(dǎo)后UMR-106 細(xì)胞中ZBED3-AS1 的表達(dá)水平，提示TFCC 可能通過(guò)上調(diào)ZBED3-AS1表達(dá)來(lái)減輕TNF-α誘導(dǎo)后UMR-106細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步研究顯示，過(guò)表達(dá)ZBED3-AS1 可提高TNF-α 誘導(dǎo)下UMR-106 細(xì)胞活力和集落形成能力，減輕TNF-α 誘導(dǎo)的UMR-106 細(xì)胞凋亡，并降低增殖抑制蛋白p21 和凋亡促進(jìn)蛋白caspase-3 的表達(dá)水平，增強(qiáng)TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞活力、集落形成和凋亡的影響。抑制ZBED3-AS1表達(dá)則減輕TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞活力、集落形成和凋亡的影響。以上研究說(shuō)明，上調(diào)ZBED3-AS1 表達(dá)是TFCC 對(duì)TNF-α 誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞發(fā)揮保護(hù)作用的重要機(jī)制。

Figure 5. Inhibition of ZBED3-AS1（A）reduced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apoptosis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNFα+TFCC（100 μg/L）+si-NC group.圖5 抑制ZBED3-AS1 能減輕TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

Figure 6. Over-expression of ZBED3-AS1（A）enhanced the effects of TFCC on the viabilty（B），colony-forming ability（C），apopto?sis（D）and protein expression of p21 and caspase-3（E）in UMR-106 cells treated with TNF-α. Mean±SD. n=9. *P＜0.05 vs TNF-α+TFCC（100 μg/L）+pcDNA3.1 group.圖6 過(guò)表達(dá)ZBED3-AS1 能增強(qiáng)TFCC 對(duì)TNF-α 作用下UMR-106 細(xì)胞活力、集落形成能力、凋亡及p21 和caspase-3 蛋白表達(dá)的影響

綜上所述，本研究證實(shí)TFCC 通過(guò)上調(diào)ZBED3-AS1 表達(dá)能夠抑制TNF-α 引起的成骨細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，提示TFCC 在骨質(zhì)疏松抗成骨細(xì)胞凋亡治療方面具有潛在應(yīng)用價(jià)值。