武俊紫， 趙 茜， 羅德霞， 范曉明， 馬 瓊， 石安華，2△

（1云南中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南昆明650504；2云南省高校中醫(yī)證候微觀(guān)辨證重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南昆明650500；3桂林醫(yī)學(xué)院廣西系統(tǒng)醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西桂林541100）

非酒精性脂肪性肝?。╪on-alcoholic fatty liver disease，NAFLD）危害極大，需在早期積極干預(yù)，干預(yù)不及時(shí)除可給自身帶來(lái)?yè)p害外，還可引起動(dòng)脈硬化、冠心病等多種疾病的發(fā)生［1］。而在引起相關(guān)血管病變的因素中，極低密度脂蛋白（very-low-density lipoprotein，VLDL）是不可忽視的一個(gè)因子［2］。VLDL由甘油三酯、膽固醇、磷脂以及一些蛋白構(gòu)成，主要由肝臟合成，正常情況下，其可以負(fù)責(zé)轉(zhuǎn)運(yùn)甘油三酯和膽固醇等以供機(jī)體需求［3］，但如果肝細(xì)胞受到損傷，肝臟過(guò)量分泌VLDL 則可引起動(dòng)脈硬化的發(fā)生。此外VLDL會(huì)在肝細(xì)胞中過(guò)量沉積，這種過(guò)量沉積可引起脂質(zhì)發(fā)生一系列代謝紊亂，這也是脂肪肝病發(fā)病的原因之一［4］。因此，如何控制肝臟VLDL 的生成對(duì)NAFLD 的治療具有積極的意義，為此本研究采用銀杏內(nèi)酯B（ginkgolide B，GB）治療脂肪肝病大鼠，以為NAFLD的治療提供一定的參考。

材料和方法

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 動(dòng)物 6 周齡清潔級(jí)雄性SD 大鼠72 只，體重160～180 g，購(gòu)買(mǎi)于昆明醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，合格證號(hào)為SCXK（滇）K2015-0002。由云南中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)部專(zhuān)業(yè)人員統(tǒng)一喂養(yǎng)，實(shí)驗(yàn)室溫度、濕度由中央空調(diào)統(tǒng)一控制，溫度22～27℃，濕度40%～60%，日常采光由燈光控制，光照/黑暗為12 h/12 h 交替，購(gòu)買(mǎi)后適應(yīng)性喂養(yǎng)10 d。

1.2 藥品與試劑 辛伐他?。╯imvastatin，SIM）購(gòu)自北京福元醫(yī)藥股份有限公司；銀杏內(nèi)酯B（成都德思特生物技術(shù)有限公司）；丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（alanine aminotransferase，ALT）和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）試劑盒（南京建成生物工程研究所）；VLDL 和低密度脂蛋白（low-density lipopro?tein，LDL）試劑盒（上海恒遠(yuǎn)生物技術(shù)發(fā)展有限公司）；微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（microsomal triglycer?ide transfer protein，MTP）、載脂蛋白B-100（apolipo?protein B-100，ApoB-100）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Santa Cruz）。

1.3 儀器 低溫高速離心機(jī)（TGL-16.5M 型，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)（UV-8000 型，上海精密儀器儀表有限公司）；酶標(biāo)儀（YT-MB96型，山東云唐智能科技有限公司）；蛋白電泳儀（Bio-Rad Mini-PROTEAN Tetra Cell 型，Bio-Rad）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 動(dòng)物分組、造模及給藥 72只大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，分別為正常對(duì)照（control，CON）組、NAFLD 模型（model，MOD）組、陽(yáng)性藥物SIM 組及銀杏內(nèi)酯B 低、中和高劑量（low-，medium- and highdose ginkgolide B，GB-L、GB-M 和GB-H）組，每組12只。造模時(shí)，正常對(duì)照組給予普通飼料+普通自來(lái)水喂養(yǎng)12 周，其余5 組給予高脂高糖飼料+5%紅糖水喂養(yǎng)12 周，12 周后每組各取2 只大鼠檢測(cè)造模是否成功，NAFLD 造模成功的標(biāo)準(zhǔn)為［5］：肝臟病理學(xué)有明顯大量脂肪空泡，同時(shí)肝功能和血脂呈明顯異常。造模成功后給予相應(yīng)治療，CON 組和MOD 組給予1 mL·kg-1·d-1生理 鹽水 灌胃 治療，SIM 組 給予2 mg·kg-1·d-1SIM 治療，銀杏內(nèi)酯B 3 個(gè)劑量組分別給予0.5、1.0和2.0 mg·kg-1·d-1銀杏內(nèi)酯B 治療。治療時(shí)間為4周。

2.2 組織收集方法 4 周后禁食不禁水12 h，分批次處死大鼠，大鼠處死時(shí)采用戊巴比妥鈉麻醉，麻醉后將其固定于解剖板，采用腹主動(dòng)脈取血法收集血液，收集后置入含有抗凝素的血液采集管中備用，后取出肝臟，肝臟取出后切取肝左葉置入組織固定液中保存用于病理學(xué)檢測(cè)，其余組織切成1 cm×1 cm×1 cm左右的小塊，置入超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 相關(guān)生化指標(biāo)檢測(cè)方法 所有生化指標(biāo)包括AST、ALT、肝臟和血液VLDL和LDL的檢測(cè)均根據(jù)試劑盒提供的說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，其中AST 和ALT 的檢測(cè)儀器為分光光度計(jì)，肝臟和血液VLDL和LDL的檢測(cè)儀器為酶標(biāo)儀。

2.4 肝臟組織病理學(xué)檢測(cè) 肝臟病理學(xué)檢測(cè)采用HE 染色法進(jìn)行，石蠟包埋、切片、脫蠟、梯度乙醇脫水、蘇木精-伊紅染色，透明后中性樹(shù)脂封片即可，完成后采用光學(xué)顯微鏡觀(guān)察并采集圖像（每張切片選取4個(gè)不同的視野）。

2.5 免疫熒光法 從超低溫冰箱中取出一塊肝臟組織，用丙醇（-20℃）固定15 min 后，采用磷酸鹽緩沖液洗滌3次，用0.5%的Triton X-100孵育10 min后洗滌3 次，細(xì)胞核染色后洗滌3 次，加入MTP 或ApoB-100 抗體，4℃冰箱中孵育過(guò)夜后洗滌3 次，加入Ⅱ抗于室溫中避光孵育30 min，洗滌3 次后封片，熒光顯微鏡觀(guān)察并采集圖像（每張切片選取4 個(gè)不同的視野）。

2.6 蛋白檢測(cè)方法 蛋白的檢測(cè)采用Western blot法進(jìn)行，從超低溫冰箱中取出肝臟組織，提取總蛋白后定量并調(diào)平，然后每組各取50 μg行SDS-PAGE，后依次經(jīng)轉(zhuǎn)模、脫脂牛奶封閉、Ⅰ抗（MTP 稀釋比例為1∶1 000，ApoB-100 稀釋比例為1∶4 000，GAPDH 稀釋比例為1∶3 000）過(guò)夜孵育，Ⅱ抗（1∶2 000）孵育30 min 后顯色收集圖像即可。結(jié)果以所測(cè)蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值作為所測(cè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS 23.0 軟件。均數(shù)間組間比較采用單因素方差分析，多組間兩兩比較采用LSD 法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組肝功能的比較

與CON 組相比，MOD 組血清AST 和ALT 顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，SIM 組和銀杏內(nèi)酯B 3個(gè) 劑 量 組AST 和ALT 均 顯 著 降 低（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 各組肝功能指標(biāo)的比較Table 1. Comparison of liver function indexes in each group（Mean±SD. n=10）

2 各組肝脂和血脂的比較

與CON 組相比，MOD 組血清VLDL 和LDL 及肝臟VLDL 和LDL 均顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，辛伐他汀和銀杏內(nèi)酯B 3個(gè)劑量組上述指標(biāo)均顯著降低（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組血脂和肝脂指標(biāo)的比較Table 2. Comparison the levels of blood lipid and liver lipid in each group（Mean±SD. n=10）

3 各組肝臟病理學(xué)變化

肝臟組織HE 染色結(jié)果可見(jiàn)，CON 組肝臟組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞排列整齊且大小基本一致，細(xì)胞核則基本均分布于細(xì)胞中央；MOD 組則彌漫有大量大小不等的脂肪顆粒，細(xì)胞核受到擠壓基本均緊貼于細(xì)胞膜；與MOD 組相比，GB-H 組肝組織結(jié)構(gòu)清晰完整，肝細(xì)胞核居中，大小一致，部分區(qū)域出現(xiàn)少量脂肪顆粒；GB-M 組肝細(xì)胞大小基本一致，出現(xiàn)少量的脂肪顆粒；GB-L 組肝小葉結(jié)構(gòu)基本完整，出現(xiàn)較少脂肪顆粒；SIM 組肝細(xì)胞大小不等，可見(jiàn)部分區(qū)域大小不等的空泡脂肪變性現(xiàn)象，見(jiàn)圖1。

Figure 1. The images of the liver tissue with HE staining. Each arrow indicates the fatty degeneration of each group.圖1 各組大鼠肝組織HE染色圖

4 MTP和ApoB-100蛋白免疫熒光染色結(jié)果

MTP 免疫熒光染色結(jié)果顯示，CON 組只有很弱的綠色熒光，且分布不均勻，而MOD 組則有很強(qiáng)的綠色熒光，且分布基本均勻，主要位于細(xì)胞質(zhì)中；與MOD 組相比，SIM 組綠色熒光分布集中，GB-L 組綠色熒光部分聚集分布，GB-M 組綠色熒光散在分布，GB-H組綠色熒光分布與CON組無(wú)明顯差異，且各治療組熒光強(qiáng)度明顯較MOD組減弱，見(jiàn)圖2。

Figure 2. Immunofluorescence of MTP in rat liver.Each arrow indicates the green fluorescence of each group.圖2 大鼠肝臟組織中MTP的免疫熒光圖

ApoB-100 免疫熒光染色結(jié)果顯示，CON 組部分區(qū)域存在散在的綠色熒光；而MOD 組則有很強(qiáng)的綠色熒光，且分布基本均勻，主要位于細(xì)胞質(zhì)中；與MOD組相比，各治療組熒光強(qiáng)度明顯減弱，且呈散在分布，見(jiàn)圖3。

Figure 3. Immunofluorescence of ApoB-100 in rat liver. Each arrow indicates the green fluorescence of each group.圖3 大鼠肝臟組織中ApoB-100的免疫熒光圖

5 MTP和ApoB-100蛋白的表達(dá)

與CON 組相比，MOD 組MTP 和ApoB-100 表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與MOD 組相比，辛伐他汀和銀杏內(nèi)酯B治療后均可以顯著降低MTP和ApoB-100表達(dá)，此外銀杏內(nèi)酯B 要低于辛伐他汀組（P＜0.05），見(jiàn)圖4。

Figure 4. The expression of MTP and ApoB-100 proteins in rat liver. Mean±SD. n=10. *P＜0.05 vs CON group；#P＜0.05 vs MOD group.圖4 大鼠肝臟中MTP和ApoB-100蛋白的表達(dá)

討 論

銀杏內(nèi)酯B 在中風(fēng)、冠心病和動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病方面有大量文獻(xiàn)報(bào)道。此外，近年來(lái)觀(guān)察到銀杏內(nèi)酯B 對(duì)改善血脂也有一定的療效，如郭茂娟等［6］研究表明，銀杏內(nèi)酯B可降低高膽固醇誘導(dǎo)的PC12 細(xì)胞膽固醇含量，龍思琴［7］等研究檢測(cè)到銀杏內(nèi)酯B 具有一定的改善脂肪肝病小鼠肝細(xì)胞脂肪變性和脂質(zhì)異常蓄積的作用，基于其可以降脂的理論，本研究采用銀杏內(nèi)酯B治療NAFLD。造模方法采用實(shí)驗(yàn)室經(jīng)典造模法，在銀杏內(nèi)酯B 劑量的選擇上，我們根據(jù)臨床治療冠心病的劑量（5 mg/kg）［8］進(jìn)行了預(yù)實(shí)驗(yàn)，但過(guò)程中觀(guān)察到5 mg/kg 銀杏內(nèi)酯B 灌胃NAFLD 大鼠出血率較高，分析原因可能與銀杏內(nèi)酯B 本身抗凝血作用有關(guān)，由于1 mg/kg 銀杏內(nèi)酯B 可以達(dá)到顯著的降脂作用，故本研究以較低的1 mg/kg為中劑量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，與CON 組相比，MOD 組大鼠肝組織、血清AST 和ALT 顯著增高，且HE 染色可見(jiàn)大量脂肪顆粒；經(jīng)銀杏內(nèi)酯B 治療4 周后，大鼠肝組織、血清AST 和ALT 顯著降低，并且改善了肝臟病理學(xué)，提示銀杏內(nèi)酯有改善NAFLD 血脂、肝功能的作用，進(jìn)一步驗(yàn)證了銀杏內(nèi)酯B的降脂作用。

肝臟甘油三酯的異常堆積是NAFLD 的發(fā)病基礎(chǔ)。VLDL 是脂肪顆粒在肝臟中聚集的主要因子，主要由肝臟合成并分泌，參與VLDL合成的兩個(gè)因子主要為ApoB-100 和甘油三酯，ApoB-100 主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中發(fā)生折疊和轉(zhuǎn)運(yùn)，最終為高爾基體內(nèi)VLDL的組裝做準(zhǔn)備［9-10］。而甘油三脂則被認(rèn)為主要借助MTP 與ApoB-100 結(jié)合形成VLDL，VLDL 在進(jìn)入血液后，大部分變成LDL，從而導(dǎo)致甘油三酯蓄積，促進(jìn)NAFLD的發(fā)生發(fā)展［11］。Chan等［12］實(shí)驗(yàn)研究顯示肝脂肪變性會(huì)增加VLDL-ApoB-100的分泌。同時(shí)，Wu等［13］實(shí)驗(yàn)研究表明廣香醇對(duì)NAFLD 的治療作用，可能是通過(guò)增加ApoB-100 分泌和微粒體MTP 活性來(lái)恢復(fù)VLDL的合成和輸出的。本研究顯示，與MOD 組相比，銀杏內(nèi)酯B治療后，大鼠血液和肝臟中VLDL 和LDL均明顯降低，提示銀杏內(nèi)酯B對(duì)VLDL 和LDL均有明顯的調(diào)節(jié)作用。此外，與MOD 組相比，大鼠肝臟中MTP 和ApoB-100 表達(dá)明顯降低，提示銀杏內(nèi)酯B 降低血脂的作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)MTP 和ApoB-100 表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上所述，銀杏內(nèi)酯B能通過(guò)調(diào)節(jié)MTP和ApoB-100 表達(dá)，進(jìn)而抑制NAFLD 大鼠肝臟VLDL 的輸出，延緩NAFLD 進(jìn)程。但本研究尚有不足之處，在今后研究中需從體外進(jìn)一步探討銀杏內(nèi)酯B 與VLDL 的具體關(guān)系及作用機(jī)制。