張志發(fā)， 朱夢(mèng)嬌， 周志強(qiáng)， 王學(xué)仁

（華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬同濟(jì)醫(yī)院麻醉科，湖北武漢430030）

前列腺癌是成年男性常見的惡性腫瘤之一，其生長(zhǎng)和功能高度依賴雄激素，雄激素水平愈高，細(xì)胞的增殖能力也愈強(qiáng)［1］。雄激素剝奪治療、抗雄激素等相關(guān)治療是目前的主要治療手段。但隨著病程的延長(zhǎng)，絕大多數(shù)雄激素依賴性前列腺癌最終都會(huì)進(jìn)展為雄激素非依賴性前列腺癌，導(dǎo)致后期治療效果不佳。因此，深入研究雄激素在前列腺癌中的功能對(duì)了解前列腺癌的發(fā)病機(jī)制至關(guān)重要。阿片類生長(zhǎng)因子受體（opioid growth factor receptor，OGFr）是內(nèi)源性阿片類肽OGF 的特異性受體，與其他經(jīng)典的阿片類受體無(wú)結(jié)構(gòu)上的同源性［2］。OGFr 在正常表皮細(xì)胞［3］及腫瘤細(xì)胞［4］中均有表達(dá)，在調(diào)節(jié)傷口愈合、細(xì)胞增殖、血管形成以及細(xì)胞周期等方面發(fā)揮著重要作用［5-7］。近期Yu 等［8］研究證實(shí)，在雄激素依賴的人前列腺癌LNCaP 細(xì)胞增殖過(guò)程中OGFr表達(dá)下調(diào)，但對(duì)OGFr 是否參與了LNCaP 細(xì)胞增殖過(guò)程及發(fā)揮何種功能尚不清楚。因此，本研究擬通過(guò)體外構(gòu)建高表達(dá)OGFr 的LNCaP 細(xì)胞模型，初步探討OGFr 在雄激素誘導(dǎo)LNCaP 細(xì)胞增殖過(guò)程中的作用及可能的分子機(jī)制。

材料和方法

1 材料

LNCaP 細(xì)胞系購(gòu)自中科院上海細(xì)胞生物醫(yī)學(xué)研究所。DMEM、胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS）和青-鏈霉素（Hyclone）；二氫睪酮（dihydrotestosterone，DHT）、Trizol 和RIPA 裂解液（Sigma）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和KOD SYBR?qPCR Mix（TOYOBO）；真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-OGFr 及pcDNA3.1 空白質(zhì)粒（Ambion）；LipofectamineTM2000 Reagent和Opti-MEM I還原型血清培養(yǎng)液（Gibco）；CCK-8 試劑盒（Sigma）；Annexin V-FITC/PI 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒和細(xì)胞周期試劑盒（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司）；鼠抗人細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶2（cyclin-dependent kinase 2，CDK2）、細(xì)胞周期蛋白E（cyclin E）和p21 抗體（Santa Cruz）；兔抗人OGFr 抗體（Sigma）；辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠和羊抗兔IgG（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；內(nèi)參照β-actin抗體（武漢博士德有限公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及實(shí)驗(yàn)分組 LNCaP 細(xì)胞用含10%FBS、1×105U/L 青霉素和100 mg/L 鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)條件下常規(guī)培養(yǎng)。選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞接種于6 孔板，待融合度達(dá)到80%以上，更換為500 μL 不含F(xiàn)BS 的OPTI-MEM I 培養(yǎng)液，按照轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000 說(shuō)明書分別加入預(yù)先制備的pcDNA3.1 空白質(zhì)粒和pcDNA3.1-OGFr 重組質(zhì)粒分別與脂質(zhì)體的復(fù)合物，記為陰性對(duì)照組和pcDNA3.1-OGFr 質(zhì)粒組，非轉(zhuǎn)染（nontransfection，NT）組加入等體積的OPTIMEM I 培養(yǎng)液。孵育6 h 后更換為DMEM 完全培養(yǎng)液，48 h 后加入300 mg/L G418 篩選試劑。2 周后出現(xiàn)單細(xì)胞克隆，挑選單克隆擴(kuò)增后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 RT-qPCR 收集不同組細(xì)胞，用Trizol 試劑提取RNA，添加DEPC 水將RNA 溶解，紫外分光光度計(jì)測(cè)定A260/A280比值合格（1.8～2.0 之間）后，置于-80℃保存?zhèn)溆?。按照cDNA 合成試劑盒步驟逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄條件為：37℃30 min，50℃2 min，98℃5 min。取1 μL cDNA，分別加入KOD SYBR?qPCR Mix、引物及去離子水，冰浴中配制20 μL 反應(yīng)體系：去離子水7 μL，KOD SYBR?qPCR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 模板1 μL。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性60 s；95℃變性10 s，60℃退火60 s，循環(huán)40 次。所有樣品均按照3 個(gè)復(fù)孔進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所用引物序列見表1［9-10］。結(jié)果按照2-ΔΔCt法計(jì)算，數(shù)值代表實(shí)驗(yàn)組目的基因的表達(dá)水平是對(duì)照組的2-ΔΔCt倍，以GAPDH作為內(nèi)參照。

表1 RT-qPCR所用引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.3 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，以每孔5×103個(gè)的密度接種于96孔板中常規(guī)培養(yǎng)，每孔100 μL。待細(xì)胞貼壁后向各孔中加入終濃度為10 nmol/L 的DHT，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分 組，control 組加入同體積培養(yǎng)液。DHT分別作用24、48、72和96 h后加入10 μL CCK-8 溶液，37℃孵育1 h。用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在450 nm 處吸光度（A），再計(jì)算細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，重復(fù)3次并取平均值。細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組A 值-空白組A 值）/（對(duì)照組A 值-空白組A值）×100%。

2.4 細(xì)胞周期與凋亡檢測(cè) 取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以每孔2×105個(gè)的密度接種于6 孔板，按照DHT、DHT+pcDNA3.1 和DHT+pcDNA3.1-OGFr 分組。按細(xì)胞周期檢測(cè)試劑盒推薦步驟操作：消化收集細(xì)胞，用預(yù)冷PBS緩沖液重懸、洗滌細(xì)胞，加入1 mL預(yù)冷的70%乙醇，4℃固定過(guò)夜；離心棄上清，加入預(yù)先配制的RNase A/PI 染色工作液，37℃避光染色30 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期分布。使用Annexin Ⅴ-FITC/PI 細(xì)胞凋亡試劑盒檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞的凋亡：細(xì)胞經(jīng)胰酶消化、離心，調(diào)整細(xì)胞密度并制備單細(xì)胞懸液，加入5 μL 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑Annexin Ⅴ-FITC，混勻后加入10 μL PI 試劑，避光、室溫孵育10 min；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

2.5 Western blot 實(shí)驗(yàn) 收集不同組的細(xì)胞加入適量的RIPA 全裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，利用BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度。在細(xì)胞總蛋白樣品中加入loading buffer，沸水使其充分變性。然后用SDSPAGE 分離蛋白，經(jīng)蛋白轉(zhuǎn)膜、封閉、Ⅰ抗（OGFr 抗體、CDK2 抗體和cyclin E 抗體均1∶500 稀釋，p21 抗體1∶1 000稀釋）及Ⅱ抗孵育雜交后進(jìn)行ECL 化學(xué)發(fā)光反應(yīng)。以β-actin為內(nèi)參照，對(duì)條帶進(jìn)行灰度掃描，比較目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）表示。多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），進(jìn)一步多重比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 重組質(zhì)粒pcDNA3.1-OGFr 轉(zhuǎn)染上調(diào)OGFr 在LNCaP細(xì)胞中的表達(dá)

RT-qPCR 和Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示，與非轉(zhuǎn)染組（NT 組）和陰性對(duì)照組（pcDNA3.1 組）比較，pcDNA3.1-OGF組OGFr的mRNA和蛋白表達(dá)顯著增加（P＜0.05），見圖1。

Figure 1. The mRNA（A）and protein（B）expression of OGFr in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was determined by RT-qPCR and Western blot，respectively. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs pcDNA3.1 group or NT group.圖1 LNCaP細(xì)胞中OGFr的mRNA和蛋白表達(dá)

2 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-OGFr可抑制DHT對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的作用

與control 組相比，10 nmol/L DHT 可呈時(shí)間依賴性的促進(jìn)LNCaP 細(xì)胞活力（P＜0.05）；與空白對(duì)照組（DHT 組）相比，在10 nmol/L DHT 作用72 h 和96 h后，pcDNA3.1-OGFr 轉(zhuǎn)染組LNCaP 細(xì)胞的增殖能力受到顯著抑制（P＜0.05），見圖2。后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取10 nmol/L DHT處理LNCaP細(xì)胞72 h為研究時(shí)點(diǎn)。

3 過(guò)表達(dá)OGFr 的LNCaP 細(xì)胞在DHT 作用下發(fā)生G0/G1期阻滯，但凋亡不受影響

Figure 2. The effect of DHT on the viability of LNCaP cells was inhibited by pcDNA3.1-OGFr plasmid transfection at different time points（72 and 96 h）. Mean±SD. n=3.#P＜0.05 vs control group；*P＜0.05 vs DHT group.圖2 OGFr抑制DHT對(duì)LNCaP細(xì)胞活力的作用

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)10 nmol/L DHT 作用于LNCaP細(xì)胞72 h 后細(xì)胞周期及凋亡的變化。細(xì)胞周期檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于DHT 組，DHT+pcDNA3.1-OGFr組LNCaP 細(xì)胞在G0/G1期細(xì)胞百分比顯著升高［（70.3±7.5）% vs（51.7±5.1）%，P＜0.05］，S 期比例顯著降低［（13.5±3.3）% vs（34.2±2.7）%，P＜0.05］，見圖3；細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果表明，相對(duì)于DHT組，DHT+pcDNA3.1-OGFr 組LNCaP 細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異［（8.3±1.7）% vs（5.6±1.1）%，P＞0.05］，見圖4。

4 過(guò)表達(dá)OGFr 導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯與CDK2 和p21的表達(dá)有關(guān)

相對(duì)于control 組，10 nmol/L DHT 作用72 h 可上調(diào)LNCaP 細(xì)胞CDK2 的mRNA 和蛋白表達(dá)，同時(shí)下調(diào)p21 的mRNA 和蛋白表達(dá)（P＜0.05），而cyclin E 表達(dá)無(wú)顯著差異；相對(duì)于DHT 組，DHT+pcDNA3.1-OGFr 轉(zhuǎn)染組CDK2 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著降低，p21 的mRNA 和蛋白表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），而cyclin E表達(dá)無(wú)顯著差異，見圖5。

Figure 3. Over-expression of OGFr in LNCaP cells resulted in G0/G1 phase arrest in the presence of DHT. After treatment with 10 nmol/L DHT for 72 h，the cell cycle of the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr was evaluated by flow cytometry.Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT+pcDNA3.1 group or DHT group.圖3 過(guò)表達(dá)OGFr導(dǎo)致DHT處理的LNCaP細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯

Figure 4. Over-expression of OGFr had no effect on DHT-induced LNCaP cell apoptosis. The apoptosis of the LNCaP cells trans?fected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h was measured by flow cytometry. Mean±SD. n=3.圖4 過(guò)表達(dá)OGFr與DHT引起的LNCaP細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)

Figure 5. The mRNA（A）and protein（B）expression of CDK2 and p21 in LNCaP cells promoted by DHT was partly reversed by overexpression of OGFr. The mRNA and protein expression levels of CDK2，cyclin E and p21 in the LNCaP cells transfected with pcDNA3.1-OGFr and treated with 10 nmol/L DHT for 72 h were determined by RT-qPCR and Western blot. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs DHT group；#P＜0.05 vs control group.圖5 過(guò)表達(dá)OGFr可部分逆轉(zhuǎn)DHT對(duì)LNCaP細(xì)胞CDK2和p21 mRNA和蛋白表達(dá)的刺激作用

討 論

OGFr 是OGF 抑制細(xì)胞增殖的特異性受體，抑制或敲除OGFr 可促進(jìn)細(xì)胞的增殖［11-12］。本研究將pcDNA3.1-OGFr 重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染LNCaP 細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)LNCaP 細(xì)胞中存在OGFr 的表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcCDNA3.1-OGFr 重組質(zhì)粒可進(jìn)一步增加細(xì)胞中OGFr 表達(dá)水平，說(shuō)明pcDNA3.1-OGFr 重組質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)入細(xì)胞，并可上調(diào)OGFr 蛋白的表達(dá)。Zagon 等［13］證實(shí)高表達(dá)OGFr 可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，本研究也觀察到轉(zhuǎn)染重組OGFr 表達(dá)質(zhì)粒可顯著抑制DHT 對(duì)LNCaP 細(xì)胞活力的促進(jìn)效應(yīng)，提示OGFr可能參與了DHT調(diào)控LNCaP 細(xì)胞增殖的過(guò)程，但目前對(duì)其如何在胞核或胞質(zhì)內(nèi)與雄激素受體“互話”而影響LNCaP 細(xì)胞的增殖尚不清楚，需要進(jìn)一步研究以及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

細(xì)胞周期紊亂或凋亡增加可導(dǎo)致細(xì)胞增殖抑制。本研究證實(shí)OGFr 可引起DHT 處理的LNCaP 細(xì)胞出現(xiàn)細(xì)胞周期阻滯，與Zagon 等［13］研究顯示OGFr的活化引起腫瘤細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯結(jié)論一致，其原因可能與OGFr 的表達(dá)上調(diào)增加了其與特異性配體OGF 的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)。細(xì)胞發(fā)生G0/G1期阻滯多與G1/S 期檢測(cè)點(diǎn)通過(guò)受限有關(guān)，而CDK2、cyclin E 以及CDK 的抑制劑p21 是G1期進(jìn)入S 期的關(guān)鍵調(diào)控因子［14-15］。本研究提示，在雄激素DHT 的刺激下，高表達(dá)OGFr可部分逆轉(zhuǎn)DHT 對(duì)p21和CDK2 mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，它與胰腺癌［16］中OGFr 調(diào)節(jié)細(xì)胞周期阻滯的方式相似，卻與OGFr 在正常細(xì)胞中通過(guò)p21/p16［3］或甲狀腺癌細(xì)胞通過(guò)p16［17］調(diào)節(jié)細(xì)胞周期并抑制增殖的機(jī)制不同，但以上結(jié)果均表明OGFr 主要通過(guò)CDK抑制因子調(diào)節(jié)細(xì)胞周期。

此外，我們也檢測(cè)了OGFr對(duì)LNCaP 細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示過(guò)表達(dá)OGFr對(duì)DHT處理的細(xì)胞凋亡率并無(wú)影響。目前關(guān)于OGFr 是否可引起細(xì)胞凋亡尚無(wú)定論。Wang 等［18］證實(shí)OGFr 可導(dǎo)致胃癌細(xì)胞發(fā)生凋亡；而我們的研究結(jié)果與Campbell 等［19］的報(bào)道相似：OGFr 的表達(dá)與細(xì)胞凋亡無(wú)關(guān)，分析其原因可能與腫瘤細(xì)胞的來(lái)源差異有關(guān)。

總之，人前列腺癌LNCaP 細(xì)胞在雄激素DHT 刺激下出現(xiàn)增殖效應(yīng)的過(guò)程中，OGFr基因表現(xiàn)出類似抑癌基因在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中受抑制的特性。但本研究?jī)H僅觀察了DHT 作用下OGFr 對(duì)細(xì)胞活力的影響，并未涉及OGFr 對(duì)LNCaP 細(xì)胞的直接作用；另外，本研究以單一的細(xì)胞系作為研究對(duì)象，其實(shí)驗(yàn)結(jié)果還需要體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步驗(yàn)證。因此，后續(xù)的研究應(yīng)從分子水平及動(dòng)物層面研究不同來(lái)源、不同特性的前列腺癌細(xì)胞中OGF、DHT 與OGFr的作用方式，以期為闡明前列腺癌的發(fā)生發(fā)展機(jī)制提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。