王美月， 賀燕婷， 于 潔， 崔曉棟， 成 敏， 張曉蕓

（濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東濰坊261053）

目前心血管疾?。╟ardiovascular diseases，CVD）占據(jù)人類(lèi)死因的首位［1］，內(nèi)皮損傷與修復(fù)的失衡導(dǎo)致的內(nèi)皮功能障礙是眾多心血管疾病的主要原因［2］。內(nèi)皮損傷可通過(guò)損傷部位附近內(nèi)皮細(xì)胞的局部遷移和增殖，或通過(guò)祖細(xì)胞的動(dòng)員并加入損傷部位來(lái)修復(fù)。內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cells，EPCs）存在于循環(huán)系統(tǒng)中，當(dāng)血管產(chǎn)生損傷時(shí)，EPCs由骨髓動(dòng)員到受損部位，通過(guò)增殖并向內(nèi)皮細(xì)胞分化參與受損血管的內(nèi)皮修復(fù)，在參與及維持血管的正常功能中起著重要作用［3-4］。EPCs 因?yàn)槠漭^高增殖、遷移以及血管形成能力成為了再生心血管醫(yī)學(xué)治療內(nèi)皮損傷以及缺血性損傷的有效工具及重要靶點(diǎn)［5］。

剪切應(yīng)力（shear stress，SS）是由血管壁上血液流動(dòng)產(chǎn)生的流體動(dòng)力，在維持內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［6-7］。文獻(xiàn)及我們前期的實(shí)驗(yàn)表明，血流產(chǎn)生的剪切應(yīng)力能對(duì)EPCs 分化及血管修復(fù)能力起調(diào)節(jié)作用，穩(wěn)定的層流剪切應(yīng)力（laminar shear stress，LSS）會(huì)促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞向內(nèi)皮細(xì)胞分化并增強(qiáng)其血管修復(fù)能力［8-9］，但具體機(jī)制并不十分明朗。

p53 在細(xì)胞內(nèi)的生物學(xué)功能主要是對(duì)外界各類(lèi)應(yīng)激原產(chǎn)生應(yīng)答，啟動(dòng)損傷的DNA 修復(fù)，維持基因組的穩(wěn)定，因此p53 曾被稱為“基因組衛(wèi)士”。近年來(lái)，隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)p53 還參與眾多細(xì)胞的分化與轉(zhuǎn)分化。Lin 等［10］的實(shí)驗(yàn)表明，LSS 可以通過(guò)p53 調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡，維持血管內(nèi)皮的穩(wěn)定。LSS 是否能夠通過(guò)p53 調(diào)節(jié)EPCs 的功能及分化尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究主要探討了LSS 通過(guò)p53 對(duì)EPCs 功能及分化的影響，以期探尋潛在的生物靶點(diǎn)分子。

材料和方法

1 主要試劑和材料

SD 大鼠購(gòu)自濟(jì)南朋悅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物繁殖中心，許可證號(hào)為SCXK（魯）2019-0003。EGM-2MV 培養(yǎng)基（Lonza）；M199 培養(yǎng)基和Trizol 試劑（Invitrogen）；纖維連接蛋白（fibronectin，F(xiàn)N）、Histopaque-1083 淋巴細(xì)胞分離液和FITC-UEA-1（Sigma）；0.25%胰蛋白酶和胎牛血清（Hyclone）；Matrigel（BD）；pifithrin-α（Selleck）；DiI-Ac-LDL（上海懋康生物科技有限公司）；vWF 酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒（上海生工生物工程股份有限公司）；CCK-8 檢測(cè)試劑盒（Dojindo）、EdU 檢測(cè)試劑盒（廣州銳博生物科技有限公司）；熒光定量PCR 試劑盒［寶生物工程（大連）有限公司］；抗p-p53 抗體、抗p53 抗體、抗CD31 抗體和抗vWF 抗體（Abcam）；抗CD45抗體（Cyagen）；抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體2（vascular endothelial growth factor recep?tor 2，VEGFR2）抗體（Cell Signaling Technology）。

2 主要方法

2.1 骨髓單個(gè)核細(xì)胞分離、培養(yǎng)與晚期EPCs 的鑒定 將大鼠頸椎脫臼處死，置于75%乙醇中浸泡10 min，然后將大鼠四肢剪下，放在含有75%乙醇的平皿中，超凈工作臺(tái)中剃去肌肉組織，剪去四肢長(zhǎng)骨兩端骨骺，反復(fù)吹打直至骨髓腔變白。將獲得的細(xì)胞懸液離心、清洗并重懸，加到密度梯度離心液上方，離心后吸取中間層云霧狀細(xì)胞，用PBS 清洗3 次，最后一次清洗完畢之后加入EGM-2 培養(yǎng)基誘導(dǎo)培養(yǎng)，5 d 后換液，以后每隔3 d 更換培養(yǎng)液。本實(shí)驗(yàn)采用晚期EPCs（3～4代細(xì)胞）作為研究對(duì)象。

待細(xì)胞傳代至3 代以后，將細(xì)胞消化接種至24孔板中。將DiI-Ac-LDL 按5 mg/L 加入24 孔板中，置于37℃培養(yǎng)箱中孵育5 h，培養(yǎng)液吸出，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS 清洗，按500 mg/L 加入FITCUEA-1置于37℃培養(yǎng)箱孵育2 h，PBS清洗，熒光顯微鏡下拍照。采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)晚期EPCs 細(xì)胞表面標(biāo)志物CD45、CD31、vWF及VEGFR2的表達(dá)。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組 選取3～5 代的大鼠EPCs，分為：（1）LSS 組：施加12 dyn/cm2的LSS 處理細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)；（2）LSS+pifithrin-α 組：在培養(yǎng)基中加入pifithrin-α（10 μmol/L）并施加12 dyn/cm2的LSS 處理細(xì)胞，檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)。

2.3 LSS 的加載 LSS 系統(tǒng)（Flexcell）由蠕動(dòng)泵、流室系統(tǒng)、儲(chǔ)液瓶及導(dǎo)管組成。將細(xì)胞接種于用FN 打底的專用載玻片上，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右將其放于無(wú)菌處理的流動(dòng)腔系統(tǒng)中，連接裝置。蠕動(dòng)泵帶動(dòng)培養(yǎng)基構(gòu)建層流剪切應(yīng)力裝置，通過(guò)計(jì)算機(jī)控制力學(xué)加載系統(tǒng)，設(shè)置12 dyn/cm2的LSS 作用于細(xì)胞。整個(gè)裝置置于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中。

2.4 Western blot實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞經(jīng)不同處理之后，取下載玻片，放在4 孔板中，PBS 洗2 次，將殘余PBS 用吸水紙吸凈；加入蛋白裂解液裂解細(xì)胞，蛋白收集完之后用BCA蛋白試劑盒測(cè)定蛋白濃度，進(jìn)行蛋白定量。用5%濃縮膠以及10%的分離膠進(jìn)行蛋白樣品的分離，然后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上封閉，分別用抗pp53（1∶500，兔源）和p53（1∶1 000，兔源）、β-actin（1∶2 000，兔源）的Ⅰ抗孵育過(guò)夜，次日用1× TBST 洗5次，加入Ⅱ抗（1∶2 000，羊抗兔）孵育，在ECL 化學(xué)發(fā)光儀上顯影并記錄數(shù)據(jù)。

2.5 RT-qPCR 細(xì)胞經(jīng)不同條件處理之后，用PBS洗2次，吸去殘余液體，加入1 mL Trizol裂解細(xì)胞，提取總的RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，再用RT-qPCR 法擴(kuò)增相應(yīng)的目的基因，將GAPDH 作為參照，引物序列見(jiàn)表1。以2-ΔΔCt公式計(jì)算相關(guān)基因的相對(duì)表達(dá)改變。

2.6 流式細(xì)胞術(shù) 胰酶消化收集細(xì)胞，PBS 洗2次，1 500 r/min 離心5 min，棄上清；加入抗CD31（或CD45）抗體室溫孵育1 h，洗滌后加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，4℃避光孵育1 h，PBS再次洗滌后上機(jī)檢測(cè)；vWF（或VEGFR2）染色時(shí)，先用4%多聚甲醛中固定10 min，離心，加入0.2%的吐溫破膜，而后洗滌加入vWF（或VEGFR2）I 抗室溫孵育1 h，加入熒光標(biāo)記的Ⅱ抗，4℃孵育1 h，上機(jī)檢測(cè)。

2.7 ELISA 檢測(cè) 收集流槽系統(tǒng)中的上清，置于凍干機(jī)凍干20 h，取出凍干粉末，加2 mL 的培養(yǎng)基溶解，4℃、1 000×g 離心20 min，取上清檢測(cè)，具體步驟按照大鼠血管性血友病因子（von Willebrand factor，vWF）酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒操作。

2.8 體外成管能力檢測(cè) 將預(yù)冷24 h 的Matrigel基質(zhì)膠按每孔80 μL 的量接種到96 孔板中，放置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中膠化1 h，將處理后的EPCs按每孔2×104的細(xì)胞量接種到已固化處理的基質(zhì)膠上，顯微鏡下觀察不同時(shí)點(diǎn)細(xì)胞體外成管形成情況。

表1 RT-qPCR引物序列Table 1. The sequences of the primers for RT-qPCR

2.9 細(xì)胞遷移 胰酶消化細(xì)胞并制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度至3×104。在Boyden 小室的下室加滿培養(yǎng)液，中間放8 μm 濾膜，上室懸空滴加200 μL 細(xì)胞懸液，蓋上蓋玻片，將小室放于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 h。取下濾膜，用棉簽輕輕擦去上層未完全遷移的細(xì)胞，反向放置在12 孔板中，1×PBS 清洗，4%多聚甲醛固定15 min，DAPI 染核15 min，避光保存，在熒光顯微鏡下觀察拍照，計(jì)數(shù)細(xì)胞遷移量。

2.10 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞活力 將處理組的EPCs用胰酶消化，按每孔2×104細(xì)胞量加入96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)取出，加入CCK-8 檢測(cè)緩沖液，置于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育2 h，在450 nm 處檢測(cè)每孔的A 值，計(jì)算細(xì)胞活力。

2.11 EdU 染色法檢測(cè)細(xì)胞增殖 將不同處理之后的細(xì)胞，消化制成細(xì)胞懸液，按每孔1×104個(gè)細(xì)胞量接種于96 孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞長(zhǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，按1∶1 000 的比例每孔加入100 μL 的EdU 溶液，培養(yǎng)2 h 后棄培養(yǎng)基，PBS 洗2 次，加入4%多聚甲醛固定液，固定30 min，棄固定液，每孔加入50 μL 的2 g/L 的甘氨酸，脫色搖床孵育5 min，棄甘氨酸溶液，PBS 清洗3 次，每孔加入100 μL 的0.5% Triton-X 孵育10 min，1×PBS 洗1次，每孔加入100 μL 的1× Apollo?染色反應(yīng)液，避光孵育30 min，棄染色液，加入100 μL 的甲醇，清洗1～2 次，1×PBS 洗1 次，加入100 μL 的DAPI 染色液，避光染色15 min，棄染色液，1×PBS洗，熒光顯微鏡下觀察并根據(jù)EdU 顯色和細(xì)胞核熒光量，計(jì)算細(xì)胞增殖率。

2.12 細(xì)胞黏附的檢測(cè) 經(jīng)過(guò)不同處理的細(xì)胞消化，制成細(xì)胞懸液。按每孔2×104個(gè)細(xì)胞量加入12孔板中，置于37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)30 min，取出后PBS洗3次，洗去未貼壁細(xì)胞，顯微鏡下拍照。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。以上實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3 次以上，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（mean±SD）來(lái)表示，兩組數(shù)據(jù)采用Student t檢驗(yàn)分析，多組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用多因素方差分析（oneway ANOVA）處理數(shù)據(jù)，以P＜0.05 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 EPCs的鑒定

晚期EPCs形態(tài)呈鵝卵石樣或紡錘形（圖1A），具有血管形成能力（圖1B）；DiI-Ac-LDL及FITC-UEA-1熒光染色后，呈染色雙染陽(yáng)性的細(xì)胞認(rèn)為是正在分化的EPCs（圖1C）。流式細(xì)胞術(shù)鑒定結(jié)果顯示，晚期EPCs中CD31、vWF以及VEGFR2內(nèi)皮標(biāo)志分子表達(dá)呈陽(yáng)性，CD45表達(dá)陰性（圖1D）。

2 LSS對(duì)EPCs中p53及p-p53蛋白水平的影響

12 dyn/cm2的層流剪切應(yīng)力作用于EPCs 后，Western blot 檢測(cè)p-p53 和總p53 的蛋白水平。結(jié)果顯示LSS 作用3 h 后，p53 總蛋白水平的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性，6 h 與12 h 后總p53 蛋白表達(dá)量有明顯升高（P＜0.01），見(jiàn)圖2A。p-p53 蛋白水平在LSS 處理30 min 和1 h 后增加，在30 min 時(shí)升高最明顯（P＜0.01），見(jiàn)圖2B。

3 p53在層流剪切應(yīng)力促EPCs分化中的作用

與單純的LSS 相比，LSS+pifithrin-α 組內(nèi)皮標(biāo)志分子CD31 和vWF 的mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3A。CD31 蛋白表達(dá)量較單純LSS 組也明顯下降，但流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示LSS處理對(duì)EPCs上vWF蛋白的表達(dá)量無(wú)影響，見(jiàn)圖3B。鑒于vWF 為分泌型蛋白，我們進(jìn)一步檢測(cè)了流槽液上清中vWF 的分泌情況，結(jié)果顯示LSS+pifithrin-α組上清液中vWF較單純LSS組明顯降低（P＜0.01），見(jiàn)圖3C。

4 p53在LSS對(duì)EPCs增殖及活性影響中的作用

Figure 1. Identification of late EPCs. A：the morphological changes of late EPCs（scale bar=200 μm）；B：the ability of tube forma?tion（scale bar=200 μm）；C：fluorescence staining of FITC-UEA-1 binding and DiI-Ac-LDL uptaking（scale bar=20 μm）；D：the expression of CD31，vWF，VEGFR2 and CD45 detected by flow cytometry.圖1 晚期EPCs的鑒定

Figure 2. Effects of LSS on the protein levels of p-p53 and p53. A：effect of LSS on the protein levels of p53 at 0，3，6 and 12 h；B：effect of LSS on the protein levels of p-p53 at 0，10 min，30 min，1 h and 2 h. Mean±SD. n=3. **P＜0.01 vs 0 h group.圖2 LSS對(duì)p-p53以及p53蛋白水平的影響

與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EdU 陽(yáng)性率增高（P＜0.05），見(jiàn)圖4A；CCK-8 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)也顯示，其細(xì)胞活力增加（圖4B），與EdU 實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。以上檢測(cè)結(jié)果均顯示，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的增殖活性高于單純LSS組。

5 p53 在LSS 對(duì)EPCs 黏附、遷移和成管能力影響中的作用

EPCs 的黏附、遷移和成管是決定其內(nèi)皮修復(fù)的基本能力。我們前期研究顯示，LSS 可促進(jìn)EPCs 黏附、遷移和體外成管能力。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)現(xiàn)，與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組EPCs 的黏附（圖5A）、遷移（圖5B）和成管能力（圖5C）均降低。

Figure 3. Role of p53 in differentiation of EPCs under LSS. A：the mRNA expression of CD31 and vWF after pretreatment with pifithrin-α under LSS；B：the protein expression of CD31 and vWF in EPCs treated with pifithrin-α under LSS；C：the pro?tein level of vWF in medium after pretreatment with pifithrin-α under LSS. Mean±SD. n=3. ##P＜0.01 vs static group；*P＜0.05，**P＜0.01 vs LSS group.圖3 p53在LSS促EPCs分化中的作用

Figure 4. The effect of p53 on proliferation of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on proliferation of EPCs under LSS tested by EdU staining（scale bar=50 μm）；B：effect of pifithrin-α on viability of EPCs under LSS tested by CCK-8 assay. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖4 p53在LSS下對(duì)EPCs增殖的影響

討 論

當(dāng)血管發(fā)生損傷時(shí)，EPCs 通過(guò)骨髓動(dòng)員到血液循環(huán)當(dāng)中，進(jìn)而趨化、黏附到損傷部位，并向內(nèi)皮細(xì)胞分化，代替損傷或者發(fā)生凋亡的內(nèi)皮細(xì)胞，參與受損血管內(nèi)皮的修復(fù)［11］。文獻(xiàn)表明，EPCs 存在2 種類(lèi)型，分別為早期與晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞，早期EPCs 增殖能力較弱，以分泌功能為主，表達(dá)有干細(xì)胞標(biāo)記分子，如CD133 等；而晚期EPCs 增殖能力較強(qiáng)，表達(dá)內(nèi)皮標(biāo)志分子VEGFR2、CD31 及vWF 等，并可受局部?jī)?nèi)環(huán)境影響，轉(zhuǎn)化為成熟的內(nèi)皮細(xì)胞，維持血管發(fā)生與血管生成。近期研究表明，EPCs 尤其是晚期EPCs 可作為心血管疾病中的內(nèi)皮功能的標(biāo)志物，并且在臨床細(xì)胞移植治療中具有廣闊的前景［12］。

Figure 5. Effect of p53 on adhesion，migration and tube-forming ability of EPCs under LSS. A：effect of pifithrin-α on adhesion of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）；B：effect of pifithrin-α on migration ability of EPCs under LSS（scale bar=50 μm）；C：effect of pifithrin-α on tube formation of EPCs under LSS（scale bar=200 μm）. Mean±SD. n=3. *P＜0.05 vs LSS group.圖5 p53在LSS下對(duì)EPCs黏附、遷移和成管能力的影響

剪切應(yīng)力是血流在血管內(nèi)皮表面流動(dòng)所產(chǎn)生的物理應(yīng)力，在調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞眾多重要蛋白的表達(dá)及調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮穩(wěn)態(tài)中起著重要作用［13］。文獻(xiàn)［8］及我們的前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明［9，14］，剪切應(yīng)力作為一種內(nèi)在的物理因素，可以引起EPCs分化及功能改變，即LSS促進(jìn)EPCs 向內(nèi)皮分化（內(nèi)皮標(biāo)志分子表達(dá)增加），遷移，黏附以及血管生成能力增強(qiáng)，進(jìn)而影響體內(nèi)血管再內(nèi)皮化。但也有實(shí)驗(yàn)表明，EPCs 在某些異常情況下，也可以向間質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)分化。我們前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，振蕩剪切應(yīng)力（oscillating shear stress，OSS；模擬體內(nèi)的擾動(dòng)流）可以促進(jìn)EPCs向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化，提示EPCs 在不同環(huán)境中具有雙向分化潛能。

在過(guò)去的40 年里，眾多研究證實(shí)了p53 是強(qiáng)大的“基因組守護(hù)者”，而近年來(lái)研究顯示，p53 還參與細(xì)胞代謝、表觀遺傳調(diào)控、細(xì)胞多能性維持、衰老調(diào)節(jié)，也有研究表明p53 的表達(dá)升高會(huì)對(duì)細(xì)胞起保護(hù)作用，故越來(lái)越多的數(shù)據(jù)顯示p53 是一個(gè)全能的“細(xì)胞守護(hù)者”，而不僅僅是“基因組守護(hù)者”［15-16］。當(dāng)細(xì)胞受到刺激時(shí)，p53 通過(guò)磷酸化、乙酰化及泛素化等翻譯后修飾，從而導(dǎo)致一系列的反應(yīng)。磷酸化是穩(wěn)定p53 及增強(qiáng)其轉(zhuǎn)錄活性的重要因素，充當(dāng)了快速打開(kāi)以及關(guān)閉p53 功能的分子開(kāi)關(guān)的角色［17］。部分實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，p53 還參與多種細(xì)胞的分化與轉(zhuǎn)分化過(guò)程［18-19］。本研究中，我們對(duì)EPCs施加12 dyn/cm2的LSS，結(jié)果顯示LSS 能夠增加p-p53 及p53 總蛋白的水平。pifithrin-α 是一種p53 的阻斷劑，也可降低核p53 的穩(wěn)定性，抑制p53 依賴性的p53 應(yīng)答基因的轉(zhuǎn)錄。本實(shí)驗(yàn)中使用p53 阻斷劑pifithrin-α（10 μmol/L）阻斷p53 的作用后，發(fā)現(xiàn)與LSS 組相比，LSS+pifithrin-α 組的EPCs 分化程度降低。內(nèi)皮分化標(biāo)記分子CD31 和vWF mRNA 表達(dá)較LSS 組明顯降低；流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，雖然CD31 蛋白表達(dá)較LSS 組明顯降低，與mRNA 表達(dá)的結(jié)果一致，但vWF蛋白變化的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。因?yàn)関WF為分泌型蛋白，我們進(jìn)一步檢測(cè)了上清中vWF的變化，ELISA 檢測(cè)結(jié)果顯示，LSS+pifithrin-α 組流槽液中vWF蛋白的分泌量與LSS組相比明顯降低。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，p53 在LSS 促內(nèi)皮祖細(xì)胞分化中起著調(diào)控作用，抑制p53 功能后，LSS 引起的EPCs成血管、遷移及黏附能力下降，但其增殖能力增強(qiáng)，后者可能與p53 調(diào)控細(xì)胞衰老的機(jī)制相關(guān)［20］。結(jié)合我們近期研究，即擾動(dòng)流剪切應(yīng)力可以通過(guò)下調(diào)p53的表達(dá)促進(jìn)EPCs 向間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)分化［21］，我們推測(cè)，p53 可能在EPCs 的分化與轉(zhuǎn)分化中起到“分子開(kāi)關(guān)”的作用，即p53 可以在LSS 作用下調(diào)節(jié)EPCs 的功能，促進(jìn)EPCs 向內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化，而在OSS 作用下促進(jìn)EPCs向間質(zhì)細(xì)胞分化。

綜上所述，LSS 可能通過(guò)促進(jìn)p53 的磷酸化，入核后發(fā)揮啟動(dòng)子的作用，促進(jìn)EPCs 向內(nèi)皮細(xì)胞分化，進(jìn)而影響EPCs 各種功能。p53 分子生物學(xué)功能多樣，本實(shí)驗(yàn)中p53 分子在入核后發(fā)揮的具體作用以及機(jī)制我們?nèi)匀徊幻鞔_，目前正在進(jìn)行深入研究。