陳 苗，莊俊玲

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)院血液科，北京 100730

造血干細胞(hematopoietic stem cells，HSCs)具有維持自我更新和多向分化為不同譜系血細胞的特性，不同發(fā)育階段及不同譜系分化受到嚴(yán)格調(diào)控，其中表觀遺傳調(diào)控在造血干細胞和祖細胞的分裂、擴增和譜系限制中發(fā)揮重要作用[1- 2]。表觀遺傳通過高度協(xié)調(diào)的基因激活和沉默，促使HSCs分化為多系成熟血細胞。

HSCs是處于G0/G1的靜止細胞，在體外培養(yǎng)環(huán)境下，經(jīng)歷有限次數(shù)細胞分裂，不可控制地進入分化過程，喪失自我更新能力。研究者采用了多種技術(shù)方法，嘗試促進HSCs自我更新復(fù)制，抑制定向分化，以期獲得大量干細胞應(yīng)用于干細胞治療，并更深入地理解造血干細胞更新和分化的機制[3- 5]。基于組蛋白乙?；揎棇τ诨蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的重要作用，研究發(fā)現(xiàn)，組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACIs)影響干細胞中的表觀遺傳密碼[6- 7]，在體外培養(yǎng)中能促進HSCs擴增，抑制分化。本文探討了HDACIs在造血干細胞體外擴增中的作用及可能的機制。

組蛋白乙?；揎椀霓D(zhuǎn)錄調(diào)控作用

HSCs定向分化過程中的轉(zhuǎn)變主要取決于基因表達模式的改變，維持自我更新的基因沉默，促進細胞分化的基因激活。表觀遺傳修飾是調(diào)控基因表達的重要機制之一，主要包括DNA/RNA甲基化、組蛋白修飾、組蛋白變體、染色質(zhì)重塑、非編碼RNA等[8- 10]。在干細胞分化過程中，表觀遺傳標(biāo)記由染色質(zhì)修飾酶動態(tài)調(diào)節(jié)，并應(yīng)答于胞外分化誘導(dǎo)信號[11]。維持干細胞數(shù)量和干性需要穩(wěn)定抑制與干細胞分化有關(guān)的基因，增加多能基因的表達[12- 13]。

組蛋白翻譯后修飾可以調(diào)控基因表達，包括乙?；⒓谆?、磷酸化、泛素化等多種共價修飾[7- 9]，其中特征最明顯的就是賴氨酸乙酰化。組蛋白乙?；腿ヒ阴；绊懭旧|(zhì)的轉(zhuǎn)錄活性。組蛋白乙?；{(diào)節(jié)組蛋白的整體電荷，影響其與帶負電荷DNA的相互作用，開放染色質(zhì)，通過染色質(zhì)構(gòu)象改變控制基因表達，一般和轉(zhuǎn)錄激活相關(guān)[14]。因此，組蛋白乙?；D(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的賴氨酸乙?；龠M基因轉(zhuǎn)錄，組蛋白去乙?；复呋嚢彼崛ヒ阴；瘜?dǎo)致染色質(zhì)失活。HDACIs則維持組蛋白乙?；谷旧|(zhì)變構(gòu)促進基因表達。

組蛋白去乙?；负虷DACIs

組蛋白去乙?；?histone deacetylase，HDAC)作為多蛋白復(fù)合物的亞基存在于細胞中，去除賴氨酸殘基乙?；?，抑制基因轉(zhuǎn)錄。在哺乳動物中，有18種HDACs，根據(jù)序列同源性分為以下4類：Ⅰ類HDACs(HDAC1、2、3和8)，Ⅱ類HDACs(HDAC4、5、6、7、9和10)，Ⅳ類(HDAC 11)和Ⅲ類(sirtuin家族：SIRT1- 7)[15- 16]。其中 Ⅰ 類HDACs與酵母轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子鉀依賴性降低3(reduced potassium dependency，RPD3)關(guān)系最為密切[17]，Ⅱ 類HDACs分為兩個亞組：Ⅱa類，有1個大的C-末端；Ⅱb類，有2個去乙酰酶結(jié)構(gòu)域。Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ類HDACs依賴鋅離子(Zn2+)并共享1個類似的催化核心催化乙酰賴氨酸水解，而 Ⅲ 類HDACs酶活性依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD)[18- 19]。Ⅰ類HDACs廣泛存在，主要分布在細胞核內(nèi)；而Ⅱ類HDACs具有組織特異性，可以在細胞核和細胞質(zhì)之間穿梭。轉(zhuǎn)錄共抑制因子，如哺乳動物sin3因子(mammalian Sin3，mSIN3)、核受體共抑制因子(nuclear receptor co-repressor，NCoR)和維甲酸與甲狀腺激素受體轉(zhuǎn)錄沉默子(silencing mediator of retinoid and thyroid hormone receptor，SMRT)將Ⅰ類和Ⅱ類HDACs招募到轉(zhuǎn)錄因子中并發(fā)生相互作用，抑制基因表達[15]。

HDACIs抑制HDACs的活性和功能，增加賴氨酸乙?；?，促進基因轉(zhuǎn)錄表達。根據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)，HDACIs可分為羥肟酸、羧酸、苯甲酰胺和環(huán)肽類[20]，各類代表化合物及其作用特點見表1。

表1 HDACIs的化學(xué)結(jié)構(gòu)分類及特點

HDACIs可以抑制HSCs中HDACs的活性，增加組蛋白乙?；剑拐{(diào)節(jié)關(guān)鍵細胞和分子功能的基因數(shù)量增加[21]。研究表明，丙戊酸鈉(valproate acid，VPA)聯(lián)合細胞因子培養(yǎng)明顯增加臍帶血(cord blood，CB)CD34+細胞組蛋白H3乙?；剑t系特異性基因(如Eklf、EpoR、Gata2、Pu.1)及干細胞基因(c-Kit)啟動子的組蛋白H3K9/14和H3K27乙?；黾訑?shù)倍[1]。采用3種Ⅰ類和Ⅱ類HDACIs(包括SCR、C433、VPA)分別處理CB-CD34+細胞24 h，檢測HDACs活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Ⅰ類(HDAC1、 2、3)、Ⅱa類(HDAC4、5)和Ⅱb類(HDAC6)活性不同程度下降，不同HDACIs作用強度有差異，其中SCR和C433抑制活性最強；但VPA對CB-CD34+細胞的擴增率最高，HDACIs對CD34+細胞的擴增效率并不與對HDACs的抑制強度直接相關(guān)[2]。

HDACs的過度表達在一些疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，HDACIs已經(jīng)被用于多種疾病的治療，尤其是抗腫瘤治療，如SAHA/Vorinostat和FK228/Romidepsin治療皮膚T細胞淋巴瘤[22- 23]，PXD101/Belinostat治療外周T細胞淋巴瘤[24]，LBH589/Panobinostat治療多發(fā)性骨髓瘤[25]。還有一些HDACIs則被用來在體外培養(yǎng)中促進干細胞重編程。

體外HDACIs促進造血干細胞擴增、抑制分化

HSCs的分裂有3種模式：(1)不對稱分裂：1個HSC細胞分裂為1個HSC和1個分化的造血祖細胞(hematopoietic progenitor cells，HPCs)，既保持了HSC數(shù)量，同時使HPCs進行性增加；(2)對稱分裂(包括2種模式)：1個HSC可以分裂產(chǎn)生2個HSC(對稱更新，使HSCs池擴張)或2個分化的造血祖細胞(對稱分化，產(chǎn)生分化細胞而HSC耗竭)[4- 5]。HSC在體內(nèi)通過控制不對稱和對稱的細胞分裂比例，能夠平衡自我更新和分化，但在體外培養(yǎng)中會失去這種平衡，導(dǎo)致HSCs分化。使用細胞因子組合[包括干細胞因子、Fms樣酪氨酸激酶(FMS like tyrosine kinase，F(xiàn)LT- 3)配體、血小板生成素、粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素(interleukin，IL)- 3、IL- 6或促紅細胞生成素等不同組合]組成體外培養(yǎng)系統(tǒng)來擴增HSCs，有利于細胞大量增殖、分化，但產(chǎn)生大量祖細胞，不具備干細胞的長期重建能力[26]。多種小分子化合物被用來在體外培養(yǎng)中處理HSCs，抑制分化、促進對稱性自我更新分裂，如芳香烴受體(AhR)拮抗劑(stemregenin 1，SR1)、嘧啶吲哚衍生物UM171，以及HDACIs[26]。HDACIs可以上調(diào)將早期HPCs重編程為HSCs的基因表達，這些與HSCs擴增和功能維持有關(guān)的基因在HSCs培養(yǎng)過程中被沉默，組蛋白乙?；艽龠M這些基因表達。

羧酸類HDACI丙戊酸(valproate acid，VPA)抑制Ⅰ類和Ⅱa類HDACs，能使CB-CD34+細胞表觀重編程，促進CB-HSCs擴增。研究發(fā)現(xiàn)，含血清培養(yǎng)體系下VPA處理HSCs產(chǎn)生更多分化細胞，即大量祖細胞和短期重建細胞而非長期重建細胞[7]。Chaurasia等[2]將CB-CD34+細胞采用無血清培養(yǎng)基細胞因子組合預(yù)分化后，加入VPA培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)多能細胞(CD34+CD90+)顯著擴增。將預(yù)分化CB-CD34+細胞加入VPA培養(yǎng)(不含細胞因子)和VPA與細胞因子組合共同培養(yǎng)7 d相比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)后者擴增效果和移植重建造血能力更強，VPA的重編程作用和細胞因子的促增殖作用具有協(xié)同效應(yīng)。這些發(fā)現(xiàn)支持使用無血清培養(yǎng)基，并將細胞因子組合和表觀修飾劑聯(lián)合，來擴增HSC。VPA處理使CD34+細胞中乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性增加，CD90、CD117、CD49f和 CXCR4表達增強。以這種方式擴增的HSCs能夠在1、2、3和4級免疫缺陷小鼠受體中植入，重建多系造血。Walasek等[27]研究表明，在體外培養(yǎng)條件下，單獨VPA處理或與氯化鋰聯(lián)用均能夠保持小鼠HSCs的功能，與干細胞維持相關(guān)基因的上調(diào)和分化相關(guān)基因的下調(diào)，有效抑制誘導(dǎo)分化的細胞因子作用。

羥肟酸基團類非選擇性HDACIs曲古他汀A(tricostatin A，TSA)也能促進CD34+細胞擴增。Milhem等[28]將成人骨髓CD34+細胞用TSA和/或地西他濱處理后培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)TSA處理的細胞與僅用細胞因子培養(yǎng)的細胞相比，CD34+細胞增殖率為6倍，CD34+CD90+細胞增殖率為2.5倍。但在此研究中，單獨TSA處理的細胞在免疫缺陷小鼠中不能多系植入，而地西他濱和TSA先后聯(lián)合處理的細胞有多系植入能力。DNA甲基化也是分化期間發(fā)育調(diào)控者之一，表觀遺傳機制存在相互交聯(lián)，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase，DNMT1、3a)和HDAC相互作用抑制基因轉(zhuǎn)錄[29]。Saraf等[30]報道地西他濱/TSA處理動員的外周血CD34+細胞，CD34+CD90+細胞擴增(3.6±0.5)倍，原始克隆形成單位-混合(CFU-mix)擴增(10.1±0.5)倍，長期卵石樣區(qū)域形成細胞(cobble stone-area forming cells，CAFC)增加(2.2±0.5)倍，并具有體內(nèi)造血重建能力。DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑和HDACI聯(lián)合可能具有協(xié)同激活沉默基因的作用，提示不同途徑表觀修飾劑聯(lián)合可能具有協(xié)同擴增HSCs作用。

Tatetsu等[31]系統(tǒng)評估了466種小分子藥物對人動員的外周血CD34+CD90+HSPCs的擴增能力，結(jié)果發(fā)現(xiàn)表觀遺傳修飾劑，尤其是HDACIs，能優(yōu)先維持和擴增這些細胞。特別是單劑量HDACI濃度為50 nmol/L的TSA處理CD34+PBSCs與對照組(DMSO和細胞因子)相比CD34+CD90+細胞擴增最大(11.7倍)，TSA處理的PBSC-CD34+細胞異種移植實驗中植入率顯著高于對照組。這個小分子篩選實驗進一步證實了HDACIs在HSCs體外維持/擴增培養(yǎng)技術(shù)中的強大作用。

HDACIs體外擴增造血干細胞的機制

HDACIs體外擴增HSCs的主要機制為上調(diào)與HSCs自我更新和功能維持有關(guān)的多能基因及將早期HPCs重編程為HSCs的基因表達。VPA培養(yǎng)擴增使CD34+細胞中乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase，ALDH)活性增加，多能基因(包括SOX2、OCT4、NANOG和Z1C3)的上調(diào)，敲除這些多能基因可以消除這種擴增作用[2]。VPA處理能夠使小鼠HSCs的與干細胞維持相關(guān)基因的上調(diào)和分化相關(guān)基因的下調(diào)，抑制誘導(dǎo)分化的細胞因子[27]。TSA處理人動員的外周血CD34+HSCs，與HSPC相關(guān)基因(如GATA2和SALL4)表達增加[31]。地西他濱/TSA處理動員的外周血CD34+細胞，HSCs自我更新相關(guān)基因(包括HOXB4、GATA2、EZH2)的轉(zhuǎn)錄水平增加，髓系分化相關(guān)的基因(PU.1)轉(zhuǎn)錄水平下降[30]。HDACIs通過調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄發(fā)揮作用，并可能與DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑具有協(xié)同作用。

相同培養(yǎng)條件下，不同的HDACIs對HSC的命運決定有不同的影響。每個HDACI具有1個獨特的表達模式，如VPA上調(diào)糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor，GCP)/STAT網(wǎng)絡(luò)(紅細胞生成需要)的轉(zhuǎn)錄，但scriptaid并不能使其上調(diào)[21]。采用不同HDACIs處理CB-CD34+細胞，包括TSA、SAHA、VPA、SCR、CAY10433(C433)、CAY10398(MD85)和CAY10603，擴增效率有顯著差異；VPA可以重激活Oct4啟動子，促進誘導(dǎo)性多能干細胞(induced pluripotent stem cells，iPSCs)產(chǎn)生，而TSA則無此作用[2]。暴露于不同的HDACIs會導(dǎo)致潛在調(diào)節(jié)因子在HSCs不同階段的不同表觀遺傳改變。非特異性HDACIs廣泛抑制所有HDACs，靶點多作用復(fù)雜。篩選特異性HDACIs抑制特定類型的HDAC，可能針對性更強。如HDAC5屬于Ⅱa型HDACs，特異性HDAC5抑制劑(LMK235)增加細胞核中p65乙?；?，顯著上調(diào)人CB-HSCs和HPCs表面CXCR4的轉(zhuǎn)錄表達，促使SDF- 1/CXCR4-介導(dǎo)的趨化作用增強，增加干細胞在骨髓微環(huán)境中的歸巢，并增加SCID-重建細胞(SCID-repopulating cell，SRC)數(shù)和增強在NSG小鼠長期重建能力[32]。下調(diào)HDAC3對于體外HSCs擴增是必要的[33]。

不同來源的HSCs擴增能力有差異，在相同的培養(yǎng)條件下，骨髓、動員的外周血和臍帶血來源的CD34+CD90+細胞分別擴增2.4、3.6和10.9倍[30]。這種差異可能與個體發(fā)育階段相關(guān)，也可能是由于不同來源HSC中促進對稱分裂和重編程基因表達的表觀遺傳修飾深度差異所致。

表觀修飾劑不僅能在體外擴增HSCs數(shù)量，對其免疫功能也產(chǎn)生影響。地西他濱/TSA擴增后的臍血中樹突狀細胞(dendritic cell，DC)HLA-DR/CD86和HLA-DR/CD11c共表達及混合淋巴細胞培養(yǎng)的同刺激能力均顯著下降。HSC分化為DC依賴于STAT3。地西他濱/TSA擴增細胞中STAT3和STAT3抑制劑(包括SHP1、 p21和GATA1)的轉(zhuǎn)錄均顯著增加，但p-STAT3占總STAT3的比率明顯下降，說明 STAT3失活。延長培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，地西他濱/TSA擴增細胞STAT3和STAT3抑制劑(包括SHP1)的轉(zhuǎn)錄水平與對照相當(dāng)，而且仍能產(chǎn)生DC，說明STAT3 失活只是暫時的。擴增細胞中STAT3依賴的DC 分化被可逆性抑制導(dǎo)致同刺激能力下降[34]。

HDACIs擴增造血干細胞的安全性

擴增造血干細胞的目的是為臨床干細胞治療提供足夠數(shù)量的干細胞，必須明確體外小分子化學(xué)物質(zhì)處理后的細胞能否安全應(yīng)用于人體。采用重編程因子創(chuàng)造iPSCs目前并不適合用于產(chǎn)生大量可移植的HSCs，因為有惡性轉(zhuǎn)化的傾向(如形成畸胎瘤)[35]。

Lam等[36]報道在體外細胞實驗中，采用TSA和VPA擴增CB-HSCs，臍血細胞中白血病相關(guān)基因，包括CDKN1C、CEBPα、HOXA9、MN1和DLK1表達上調(diào)。但目前在小分子HDACIs處理HSCs誘導(dǎo)的動物實驗中，均未觀察到明顯的惡性腫瘤，在移植擴增后細胞的1代或2代NSG小鼠也未發(fā)現(xiàn)畸胎瘤的形成，而且在胚胎干細胞注射后形成畸胎瘤的部位注射擴增后的臍血多能干細胞并沒有導(dǎo)致畸胎瘤形成[2]。表觀遺傳修飾劑(包括HDACIs、DNMTI)處理的HSCs未在受體小鼠中產(chǎn)生畸胎瘤或血液惡性腫瘤，可能是由于短期暴露于低劑量CMAs，多能性基因僅短暫上調(diào)，在連續(xù)移植后的人細胞中已觀察不到這種上調(diào)。這些小分子只是暫時激活HSCs自我更新所需的基因程序，建立一個有限但充分的表觀遺傳特征時期，允許更多HSCs在短暫的培養(yǎng)期間產(chǎn)生，但并未創(chuàng)造出不可逆改變的永生細胞系。培養(yǎng)結(jié)束后，去除表觀遺傳修飾劑，預(yù)期使HSCs擴增的基因程序沉默，因此使白血病轉(zhuǎn)化風(fēng)險最小化，但又不影響已產(chǎn)生的HSCs遺傳和功能特性。但HDACIs擴增的干細胞應(yīng)用于細胞治療的安全性還有待更充分的數(shù)據(jù)支持。

展 望

表觀遺傳修飾在多種人體生理、病理過程中發(fā)揮不同作用，HDACIs已成功治療多種HDAC高表達的腫瘤性疾病，可誘導(dǎo)惡性克隆細胞凋亡和分化[22- 25]；在體外細胞研究中，HDACIs可以誘導(dǎo)髓系定向分化，如MS- 275誘導(dǎo)人K562紅白血病細胞系的紅系分化[37]，VPA增加人CD34+造血祖細胞體外培養(yǎng)巨核細胞/紅系祖細胞的數(shù)量，同時抑制了巨核細胞分化[38]；而在體外造血干細胞擴增中，HDACIs促進培養(yǎng)的正常CD34+細胞自我更新產(chǎn)生造血干祖細胞。組蛋白乙酰化修飾的復(fù)雜作用是進一步研究的難點。從高選擇性HDACIs和特異性HDAC著手，可能有助于確定分化信號誘導(dǎo)染色質(zhì)修飾酶活性轉(zhuǎn)變的信號通路，從而解釋HDACIs的不同作用[39]。

體外擴增造血干細胞，尤其是臍血造血干細胞，增加治療用干細胞的數(shù)量及干細胞歸巢、重建造血和重建免疫的能力，將大大促進干細胞治療技術(shù)的進步。信號通路化學(xué)小分子或骨髓基質(zhì)共培養(yǎng)體系體外擴增的臍血細胞已進入臨床試驗。表觀遺傳小分子擴增造血干細胞在擴增效率、維持長期造血方面仍需提升，可以通過大規(guī)模高通量篩選擴增作用強的HDACIs和選擇不同通路表觀修飾劑協(xié)同作用，預(yù)期將進一步提高擴增效果，提供更高質(zhì)量的干細胞產(chǎn)品。