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        溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響

        2021-03-10 06:41:36向圣錦竇仁慧姜小涵李柏村李佳
        中國(guó)中醫(yī)眼科雜志 2021年2期
        關(guān)鍵詞:模型

        向圣錦,竇仁慧,姜小涵,李柏村,李佳

        原發(fā)性視網(wǎng)膜色素變性(retinitis pigmentosa,RP)是一種主要與基因缺陷相關(guān)的感光細(xì)胞及視網(wǎng)膜色素上皮變性,從而引起夜盲、進(jìn)行性視野縮小、視力下降、眼底特征性改變的遺傳性眼病。RP 在全世界范圍內(nèi)發(fā)病率約為1/3000~1/5000,是目前尚無(wú)有效的預(yù)防和治愈的一種致盲性眼病[1-2]。中醫(yī)藥治療RP 有著悠久的歷史,一些藥物臨床與實(shí)驗(yàn)研究均被證實(shí)對(duì)本病有一定療效[3-4]?,F(xiàn)在中醫(yī)學(xué)逐漸總結(jié)和認(rèn)識(shí)到肝腎陰虛、脾腎陽(yáng)虛、清陽(yáng)不升和血瘀脈澀是RP 的重要病機(jī)[5]。臨證中,課題組應(yīng)用溫腎活血方(熟地黃、枸杞子、菟絲子、熟附子、肉桂、紅參、當(dāng)歸等)為主加減治療腎陽(yáng)不足型RP,收效尚可。同時(shí)對(duì)歷代治療RP 的方劑配伍和臨床用藥規(guī)律總結(jié)發(fā)現(xiàn),自近代醫(yī)家以來(lái),應(yīng)用滋陰補(bǔ)腎兼活血化瘀或溫補(bǔ)腎陽(yáng)兼活血祛瘀法治療RP 的報(bào)道亦越來(lái)越多,在提高視力、改善視野方面具有可靠療效[6]。為進(jìn)一步明確溫腎活血方治療本病的療效機(jī)理,本研究以皇家外科學(xué)院(royal college surgeons,RCS)大鼠為研究對(duì)象,觀察中藥溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡的影響,以探討豐富溫腎活血方治療RP的理論依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

        RCS(rdy-/-,p-/-)大鼠,SPF 級(jí)(購(gòu)自蘇州昭衍新藥研究中心有限公司,質(zhì)量合格證號(hào):201910067);正常SD 大鼠,SPF 級(jí)(購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司,質(zhì)量合格證號(hào):201614068)。RCS 大鼠按4 雌2 雄進(jìn)行交配得到純合子胎鼠RCS 24 只(雌雄各半);SD 大鼠8 只,雌雄各半,鼠齡2 周齡。所有大鼠均飼養(yǎng)在湖北中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)樓動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心,SPF 級(jí)動(dòng)物房飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料和無(wú)菌蒸餾水喂養(yǎng),自由飲食,室內(nèi)通風(fēng)良好,室溫22~25℃;予以12 h/12 h 的晝夜節(jié)律,光照時(shí)間6:00~18:00,每3~4 d 更換一次墊料。本研究經(jīng)溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

        1.2 儀器與試劑

        溫腎活血方(熟地黃、枸杞子、菟絲子、熟附子、肉桂、紅參、當(dāng)歸等)。上述藥物按原方購(gòu)買三九制藥有限公司濃縮中藥配方顆粒,按體表?yè)Q算系數(shù)換算后配置成相應(yīng)濃度后,真空包裝,4℃冰箱保存?zhèn)溆谩UNEL 凋亡熒光染色試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司);Caspase-3 抗體(艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司)、Bcl-2、Bax(美國(guó)Thermo Fisher 公司),Trizol RNA 提取試劑盒(美國(guó)Life Technologies Corporation),M-MLV Reverse Transcriptase cDNA 第一鏈合成試劑盒(美國(guó)Invitro-gen 公司)。Nanodrop 2000 超微量紫外分光光度計(jì)(美國(guó)Thermo Fisher 公司)。CRM-440 切片機(jī),日本SAKURA 公司;光學(xué)顯微鏡,日本Olympus 公司,Axio Observe Z1 全自動(dòng)倒置熒光光學(xué)顯微鏡。無(wú)水乙醇、異丙醇、氯仿等(北京化學(xué)試劑公司);水合氯醛(國(guó)藥集團(tuán)工業(yè)股份有限公司)。

        1.3 分組及給藥

        16 只RCS 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為溫腎活血方組(以下簡(jiǎn)稱治療組)和模型組,每組8 只,雌雄各半;同時(shí)設(shè)8 只SD 大鼠為正常對(duì)照組(以下簡(jiǎn)稱對(duì)照組)。自2 周齡開始喂藥。

        (1)治療組:予溫腎活血方中藥濃縮顆粒劑灌胃,灌胃濃度按中藥濃縮顆粒10.29 g/kg 體重計(jì)算,初始灌胃量為0.5 ml/次,每日2 次,1 周后(出生3 周)改為1.0 ml,每日1 次。

        (2)模型組和對(duì)照組:給予0.9%生理鹽水灌胃,方法及頻次同中藥組。

        3 組均于開始治療后28 d 隨機(jī)選取6 只大鼠處死,進(jìn)行相應(yīng)操作和各個(gè)實(shí)驗(yàn)指標(biāo)測(cè)定。

        1.4 視網(wǎng)膜組織病理學(xué)

        水合氯醛麻醉過(guò)量處死各組大鼠,快速取出右眼眼球置于4%多聚甲醛中固定48 h,然后組織脫水、石蠟包埋,每組隨機(jī)選擇3 只眼球沿冠狀面行4μm連續(xù)切片,蘇木精-伊紅染色(HE 染色)后于100 倍光學(xué)顯微鏡下觀察視盤兩側(cè)各150 μm 視網(wǎng)膜各層形態(tài)和結(jié)構(gòu)變化并拍照。

        1.5 TUNEL 法檢測(cè)感光細(xì)胞凋亡

        取材時(shí)間和方法同上,制作視網(wǎng)膜石蠟包埋切片。按照TUNEL 試劑盒說(shuō)明進(jìn)行相關(guān)檢測(cè)。切片DAPI 復(fù)染后熒光顯微鏡下觀察,自視盤向鋸齒緣方向連續(xù)取3 個(gè)視野,500 μm/視野,記錄每個(gè)視野中染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及感光細(xì)胞總數(shù),抽樣6 張不同切片,計(jì)算平均感光細(xì)胞凋亡率。細(xì)胞計(jì)數(shù)采用3YPixel-PRO 分析軟件,感光細(xì)胞凋亡率(%)=陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/感光細(xì)胞總數(shù)×100%。

        1.6 免疫組化測(cè)定大鼠視網(wǎng)膜凋亡蛋白Caspase-3、Bax、Bcl-2 表達(dá)

        常規(guī)脫蠟、復(fù)水組織切片;根據(jù)所應(yīng)用的一抗的特殊要求,對(duì)組織切片進(jìn)行預(yù)處理;3%H2O2去離子水孵育10 min,用來(lái)阻斷內(nèi)源性過(guò)氧化物酶;PBS 沖洗2 min×3 次;滴加Caspase-3、Bax、Bcl-2 單克隆抗體,室溫或37℃孵育1~2h 或4℃過(guò)夜,PBS 沖洗2 min×3 次;滴加試劑Polymer Helper,室溫或37℃孵育20 min,PBS 沖洗2 min×3 次;滴加試劑聚氧化酶兔抗大鼠IgG,室溫或37℃孵育20 min,PBS 沖洗2 min×3 次;應(yīng)用DAB 溶液顯色;自來(lái)水充分沖洗、復(fù)染、脫水、透明、封片;光學(xué)顯微鏡下觀察、拍照。用Image Plus Pro 6.0 圖像分析系統(tǒng)對(duì)相關(guān)凋亡蛋白陽(yáng)性表達(dá)進(jìn)行定量分析。每只大鼠取3 張不連續(xù)切片,每張切片隨機(jī)選取6 處視野,計(jì)算陽(yáng)性表達(dá)的平均密度值。

        1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

        采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差()來(lái)表示。3 組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)方法,組內(nèi)兩兩比較應(yīng)用LSD-t 檢驗(yàn)。結(jié)果以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        2 結(jié)果

        2.1 各組大鼠視網(wǎng)膜組織病理學(xué)變化

        治療后28 d,對(duì)照組SD 大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)完整,外核層感光細(xì)胞排列緊密整齊,其外側(cè)依次可見(jiàn)感光細(xì)胞的內(nèi)節(jié)與外節(jié)。模型組RCS 大鼠視網(wǎng)膜外核層均較正常組明顯變薄,細(xì)胞排列疏松,欠整齊;外層感光細(xì)胞數(shù)明顯減少,其余結(jié)構(gòu)基本正常。治療組大鼠視網(wǎng)膜外核層亦較正常組變薄,感光細(xì)胞數(shù)量明顯減少;但與模型組比較視網(wǎng)膜更厚,感光細(xì)胞層數(shù)較后者為多,細(xì)胞排列也較為整齊(圖1)。

        2.2 各組大鼠TUNEL 法檢測(cè)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡情況

        圖1 治療前后各組大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)改變(HE 染色×400)。1A 對(duì)照組治療前;1B 模型組治療前;1C 治療組治療前;1D 對(duì)照組治療后;1E模型組治療后;1F 治療組治療后

        治療后28 d,對(duì)照組大鼠在視網(wǎng)膜外核層偶見(jiàn)陽(yáng)性細(xì)胞,但模型組和治療組大鼠視網(wǎng)膜外核層陽(yáng)性染色細(xì)胞較正常組均明顯增多,出現(xiàn)明顯的細(xì)胞凋亡現(xiàn)象,但治療組外核層陽(yáng)性染色細(xì)胞較模型組少(圖2)。對(duì)照組、模型組、治療組感光細(xì)胞凋亡率分別為(12.15±3.83)%、(50.78±6.36)%、(33.53±6.26)%。3組之間經(jīng)單因素方差分析,外核層細(xì)胞凋亡計(jì)數(shù)組間差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=71.58,P=0.000)。與模型組比較,治療組凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著減少(t=4.74,P=0.001)

        2.3 各組RCS大鼠視 網(wǎng)膜Caspase-3、Bax、Bcl-2的表達(dá)

        在治療后28d,對(duì)照組SD大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)形態(tài)規(guī)則,排列整齊,在視網(wǎng)膜外層可見(jiàn)少量Caspase-3、Bax 蛋白分散表達(dá),Bcl-2蛋白表達(dá)水平較高。模型組和治療組RCS大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)紊亂萎縮變薄,病灶集中在外層視網(wǎng)膜,Caspase-3、Bax 蛋白表達(dá)在視網(wǎng)膜內(nèi)外層均可見(jiàn),但Caspase-3表達(dá)水平較對(duì)照組高,Bax 表達(dá)則同樣較低;而Bcl-2蛋白表達(dá)水平則在視網(wǎng)膜各層均較對(duì)照組低(圖3)。3組間比較,Caspase-3陽(yáng)性表達(dá)水平(F=59.37,P=0.000);Bcl-2陽(yáng)性表達(dá)水平(F=31.35,P=0.000),均有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Bax 陽(yáng)性表達(dá)水平(F=1.69,P=0.190),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與模型組比較,治療組Caspase-3表達(dá)顯著減少(t=2.36,P=0.040),Bcl-2 表達(dá)顯著增多(t=3.15,P=0.010),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        圖3 治療后28d 各組視網(wǎng)膜Caspase-3、Bax 及Bcl-2 表達(dá)比較(×400)。3A-3C分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Caspase-3蛋白表達(dá)情況;3D-3F 分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Bax 蛋白表達(dá)情況;3G-3I分別代表對(duì)照組、模型組、治療組Bcl-2 蛋白表達(dá)情況。Caspase-3、Bax、Bcl-2均呈綠色染色,陽(yáng)性表達(dá)(白箭頭)

        3 討論

        RP 屬于中醫(yī)學(xué)“高風(fēng)內(nèi)障”“高風(fēng)雀目”“陰風(fēng)障”范疇。歷代醫(yī)家多認(rèn)識(shí)到元陽(yáng)(腎陽(yáng))不足在本病發(fā)病中具有重要作用?!赌拷?jīng)大成》[7]認(rèn)為該病的病機(jī)為元陽(yáng)不足,陽(yáng)不勝陰所致,曰:“至晚不見(jiàn),曉則復(fù)明,蓋元陽(yáng)不足致病”“人而陽(yáng)不勝陰,則氣必下陷,陽(yáng)氣下陷,則陰氣升騰,縱有火光月色,終不能睹”?!秾徱暚幒穂8]認(rèn)為該病“蓋元陽(yáng)不足致病,或曰既陽(yáng)不足”。因此,先天稟賦不足,元陽(yáng)不足,命門火衰;陽(yáng)虛日久,必?fù)p及陰,陰陽(yáng)俱衰,陰陽(yáng)不濟(jì),陽(yáng)氣不能為用。同時(shí),陽(yáng)虛無(wú)以鼓動(dòng)血行,目中脈絡(luò)瘀阻,氣滯血瘀。李傳課教授團(tuán)隊(duì)研究證實(shí)RP 證候具有虛中夾瘀的特點(diǎn)[9]?!堆劭平痃R》[10]認(rèn)為該病是由于“陽(yáng)光不足,腎陰虛損,乃陽(yáng)微陰盛”所致。因此,先天稟賦不足,命門火衰,陽(yáng)虛日久,陽(yáng)損及陰,陰陽(yáng)不濟(jì)。同時(shí),陽(yáng)虛無(wú)以鼓動(dòng)血行,目中脈絡(luò)瘀阻,氣血瘀滯是本病的重要病機(jī)[5,11],治療當(dāng)溫腎助陽(yáng)、補(bǔ)腎填精,兼以益氣活血。溫腎活血方選用杜仲、菟絲子并配以大熱之熟附子、肉桂溫補(bǔ)腎陽(yáng),枸杞子、熟地黃滋補(bǔ)腎陰、益精明目,陰陽(yáng)雙補(bǔ),并可陰中求陽(yáng),共補(bǔ)腎中真精元陽(yáng),具體較好的補(bǔ)腎明目功效。由于眼居高位,配以紅參大補(bǔ)元?dú)?,補(bǔ)后天以資先天,并助腎中陽(yáng)氣蒸騰,直達(dá)病所;當(dāng)歸、川芎活血化瘀通絡(luò)。諸藥合之,共奏溫補(bǔ)腎陽(yáng)、活血明目之功,切中元陽(yáng)不足、脈絡(luò)瘀阻之病機(jī)。

        RCS 大鼠是一種較成熟的視網(wǎng)膜退化性病變動(dòng)物,因視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞吞噬光感受器細(xì)胞外節(jié)盤膜能力缺陷,導(dǎo)致大量的盤膜碎片堆積,最終導(dǎo)致光感受器細(xì)胞進(jìn)行性變性和凋亡,是一種常染色體隱性遺傳病,具有人類RP 的主要特征,是廣泛用于RP 病因及治療方法研究的經(jīng)典模型鼠[12]。既往研究發(fā)現(xiàn),在出生14 d 時(shí)視網(wǎng)膜結(jié)構(gòu)正常,之后睜眼并接受光線刺激后開始視網(wǎng)膜變性,在出生后28 d 可見(jiàn)視網(wǎng)膜明顯變薄,感光細(xì)胞層數(shù)減少,外節(jié)不規(guī)則甚至消失,到42 d 時(shí)視網(wǎng)膜變性進(jìn)一步加重,56 d 時(shí)則視網(wǎng)膜外層光感細(xì)胞完全消失[13]。因此,選擇出生后42 d進(jìn)行相關(guān)檢測(cè),即在視網(wǎng)膜感光細(xì)胞損傷較為嚴(yán)重階段,評(píng)估溫腎活血方對(duì)視網(wǎng)膜感光細(xì)胞的保護(hù)作用。

        目前RP 的確切發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚,但是大量研究已證實(shí)細(xì)胞凋亡是該病發(fā)生發(fā)展的重要分子機(jī)制,因此,通過(guò)有效的方法延緩或者抑制感光細(xì)胞的凋亡是治療RP 的關(guān)鍵所在,對(duì)保護(hù)患者的視功能具有重要意義。本研究HE 染色結(jié)果顯示,溫腎活血方治療后,RCS 大鼠視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)排列相對(duì)規(guī)整,視網(wǎng)膜外層感光細(xì)胞層數(shù)以及細(xì)胞核密度較模型組有不同程度改善,說(shuō)明溫腎活血方能使RCS大鼠視網(wǎng)膜保留更多的感光細(xì)胞。同時(shí),TUNEL 感光細(xì)胞凋亡染色進(jìn)一步證實(shí),凋亡陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)程度與外核層變薄的程度具有一致性,溫腎活血方能顯著較少感光細(xì)胞凋亡,且高劑量組較低劑量組可以更顯著降低感光細(xì)胞凋亡率,提示溫腎活血方可以減少RCS 大鼠視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,對(duì)視網(wǎng)膜損傷具有一定保護(hù)作用。既往也研究發(fā)現(xiàn),溫陽(yáng)益氣活血方可以有效抑制RDS 小鼠感光細(xì)胞的凋亡,保護(hù)視網(wǎng)膜外層損傷[4]。結(jié)合本研究結(jié)果,進(jìn)一步說(shuō)明溫補(bǔ)腎陽(yáng)、活血通絡(luò)為主的治法可以較好地抑制元陽(yáng)虧虛、脈絡(luò)瘀阻所致RP 患者的視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,進(jìn)而達(dá)到保護(hù)和延緩視功能下降的目的。

        Caspase-3 是外源性凋亡通路和內(nèi)源性凋亡通路激活的Caspase 級(jí)聯(lián)的啟動(dòng)因子,能夠直接促發(fā)細(xì)胞凋亡,是最重要的凋亡執(zhí)行者,一旦Caspase-3被激活并進(jìn)一步激活下游信號(hào)通路,感光細(xì)胞凋亡就會(huì)啟動(dòng)[14]。Bcl-2 因子是重要的凋亡抑制因子,現(xiàn)已證實(shí)Bcl-2 可以阻斷感光細(xì)胞的凋亡從而促進(jìn)其存活[15]。為了進(jìn)一步明確溫腎活血方抑制或延緩感光細(xì)胞凋亡的機(jī)制,通過(guò)免疫組化測(cè)定了溫腎活血方對(duì)RCS 大鼠視網(wǎng)膜凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)的溫腎活血方可以不同程度影響RCS 大鼠視網(wǎng)膜中凋亡相關(guān)基因Caspase-3、Bcl-2 的表達(dá),主要表現(xiàn)為抑制Caspase-3 的表達(dá),并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)。由于細(xì)胞凋亡過(guò)程主要發(fā)生在視網(wǎng)膜外層,故凋亡蛋白的表達(dá)主要是由感光細(xì)胞誘導(dǎo)的。因此,溫腎活血方可能主要通過(guò)抑制視網(wǎng)膜Caspase-3 的表達(dá),并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)從而減少視網(wǎng)膜感光細(xì)胞凋亡,達(dá)到恢復(fù)和保護(hù)視功能的目的,但溫腎活血方誘導(dǎo)感光細(xì)胞凋亡的下游分子機(jī)制仍值得進(jìn)一步研究。

        綜上所述,本研究證實(shí)了溫腎活血方可以抑制RCS 大鼠感光細(xì)胞變性和凋亡的進(jìn)程,對(duì)視網(wǎng)膜變性具有一定的保護(hù)作用,其作用可能與抑制Caspase-3 并促進(jìn)Bcl-2 的表達(dá)有關(guān),但具體的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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