湯文川, 常 靖, 王元鳳*, 王愛(ài)華, 王瑞花

(1. 公安部物證鑒定中心, 北京 100038; 2. 中國(guó)政法大學(xué)證據(jù)科學(xué)研究院, 北京 100088)

兩個(gè)互為鏡像而不能重合的立體異構(gòu)體,稱(chēng)為對(duì)映異構(gòu)體。對(duì)映異構(gòu)體的分子中有一個(gè)連有4個(gè)不同原子或基團(tuán)的碳原子,叫手性碳原子。對(duì)映異構(gòu)體在自然界中普遍存在,并且在生命活動(dòng)中起到極為重要的作用,例如一些氨基酸和糖類(lèi)對(duì)人體有營(yíng)養(yǎng)作用,但其對(duì)映異構(gòu)體沒(méi)有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值,甚至對(duì)人體會(huì)產(chǎn)生副作用。在藥物化學(xué)領(lǐng)域,對(duì)映異構(gòu)體的存在也是極為常見(jiàn)的,它們具有極為相似的理化性質(zhì),但是在人體中的作用部位、毒性、代謝過(guò)程等方面都存在較為明顯的差異。部分毒品也是如此,例如,對(duì)于甲基苯丙胺而言,S-甲基苯丙胺是常見(jiàn)的毒品,主要作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng),而其對(duì)映異構(gòu)體R-甲基苯丙胺則主要作用于心血管系統(tǒng),多用于臨床醫(yī)療[1]。因此,正確識(shí)別、恰當(dāng)分離有旋光性的毒品及其對(duì)映異構(gòu)體,不僅有利于司法領(lǐng)域認(rèn)定對(duì)毒品犯罪的準(zhǔn)確定罪、量刑,而且對(duì)醫(yī)藥、科研領(lǐng)域也有所裨益。

針對(duì)我國(guó)司法實(shí)踐,本文重點(diǎn)對(duì)苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)3類(lèi)常見(jiàn)毒品的手性色譜分離方法的共性以及手性分離在法醫(yī)毒物學(xué)中的應(yīng)用等研究進(jìn)展進(jìn)行綜述,以期對(duì)毒品犯罪的司法鑒定工作、相關(guān)醫(yī)藥研究提供參考。

1 3類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的特點(diǎn)

1.1 苯丙胺類(lèi)

苯丙胺類(lèi)興奮劑主要以興奮和致幻作用為主,其可以選擇性地作用于腦干以上的中樞神經(jīng)系統(tǒng),通過(guò)使中樞和外周單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)水平升高,增強(qiáng)中樞神經(jīng)系統(tǒng)活動(dòng),間接產(chǎn)生藥理和毒理學(xué)作用[2]。苯丙胺類(lèi)興奮劑為苯丙胺(AM)的衍生物,結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)圖1a。除了AM外,苯丙胺類(lèi)興奮劑還包括甲基苯丙胺(冰毒,MAMP)、3,4-亞甲二氧基苯丙胺(MDA)、3,4-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MDMA)、3,4-亞甲二氧基乙基苯丙胺(MDEA)、3-甲氧基-4,5-亞甲二氧基甲基苯丙胺(MMDMA)、二甲氧基乙基安非他明(DOET)等?！?018年中國(guó)毒品形勢(shì)報(bào)告》表明,“在240.4萬(wàn)名現(xiàn)有吸毒人員中,濫用冰毒人員135萬(wàn)名,占56.1%,冰毒已取代海洛因成為我國(guó)濫用人數(shù)最多的毒品”[3]。

圖 1 (a)苯丙胺類(lèi)興奮劑、(b)氯胺酮和(c)卡西酮類(lèi)毒品的結(jié)構(gòu)式Fig. 1 Structural formulas of (a) amphetamine-type stimulants, (b) ketamine, (c) cathinones* the chiral carbon atom.

麻黃素、偽麻黃素是合成苯丙胺類(lèi)毒品的重要原料,這兩種分子均具有手性碳原子。在合成過(guò)程中,麻黃素、偽麻黃素的手性碳原子不參與反應(yīng),因而利用這兩種原料合成的苯丙胺類(lèi)毒品是對(duì)映異構(gòu)體[4]。苯丙胺類(lèi)的對(duì)映異構(gòu)體在藥效性、毒性、代謝等方面有較大差異。以MAMP為例,R-MAMP多用于醫(yī)療過(guò)程,被用作鼻腔減充血藥物的活性成分,而S-MAMP因其成癮性和濫用趨勢(shì)被界定為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的強(qiáng)效興奮劑[5];相比R-MAMP,等劑量的S-MAMP對(duì)人體心血管的作用更強(qiáng)[6];當(dāng)攝入外消旋體MAMP 16 h后,可以檢測(cè)出S-MAMP在體內(nèi)代謝程度更低[7],由此可見(jiàn),S-MAMP更容易對(duì)人體產(chǎn)生長(zhǎng)時(shí)間作用。

1.2 氯胺酮

氯胺酮是一種被列管的精神藥品。它具有一定的致幻作用和成癮性,在人體內(nèi)的作用機(jī)制較復(fù)雜,能選擇性地阻斷痛覺(jué)沖動(dòng)向丘腦新皮層系統(tǒng)的傳導(dǎo),興奮腦干及邊緣系統(tǒng),引起意識(shí)模糊、短暫性記憶缺失,產(chǎn)生夢(mèng)幻、肌張力增加、血壓上升等癥狀[8]。氯胺酮在我國(guó)濫用的情況較為嚴(yán)重。根據(jù)《2018年中國(guó)毒品形勢(shì)報(bào)告》,我國(guó)濫用氯胺酮的人數(shù)僅次于冰毒和海洛因。氯胺酮的化學(xué)名稱(chēng)是2-氯苯-2-甲基胺環(huán)己酮,分子中有一個(gè)手性碳原子,結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1b。氯胺酮早在1970年就被作為麻醉劑用于臨床,臨床使用的一般為等量R-氯胺酮和S-氯胺酮的外消旋體混合物。兩種氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的麻醉效果有所差異,S-氯胺酮的麻醉效果是R-氯胺酮和外消旋體氯胺酮的2～5倍[9],相比外消旋體和R-氯胺酮,使用S-氯胺酮作為麻醉劑時(shí),產(chǎn)生的副作用更小[10]。依據(jù)以上特點(diǎn)和持續(xù)的臨床研究,近年來(lái)一些國(guó)家已將S-氯胺酮作為臨床用外消旋體氯胺酮的替代品。此外,近年來(lái)氯胺酮的抗抑郁作用引發(fā)了科學(xué)家們的關(guān)注,R-氯胺酮相比S-氯胺酮在抗抑郁藥物領(lǐng)域更有潛力[11]。

1.3 卡西酮類(lèi)

卡西酮類(lèi)毒品具有很強(qiáng)的興奮作用。近些年來(lái),卡西酮類(lèi)毒品在毒品市場(chǎng)中越來(lái)越泛濫,尤其是娛樂(lè)場(chǎng)所。國(guó)內(nèi)外因?yàn)E用卡西酮類(lèi)毒品引發(fā)的中毒、致死案例越來(lái)越多[12]。卡西酮是卡西酮類(lèi)毒品中最為主要的一種,它也被稱(chēng)為苯甲酰乙胺或β-酮苯丙胺,是一種單胺類(lèi)生物堿,存在于阿拉伯茶中,其化學(xué)性質(zhì)與麻黃堿和其他苯丙胺類(lèi)物質(zhì)類(lèi)似?？ㄎ魍慕Y(jié)構(gòu)與AM相似,包含一個(gè)手性碳原子,但又不同于AM,它有一個(gè)酮官能團(tuán)?？ㄎ魍?lèi)毒品是以卡西酮的分子結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)而衍生出來(lái)的一類(lèi)毒品,結(jié)構(gòu)通式見(jiàn)圖1c。其他常見(jiàn)的卡西酮類(lèi)毒品有甲卡西酮、4-甲基甲卡西酮(4-MMC)、3,4-亞甲基二氧吡咯戊酮(MDPV)、4-氟甲卡西酮(4-FMC)、3-氟甲卡西酮(3-FMC)、3,4-二甲基甲卡西酮(3,4-DMMC)等?？ㄎ魍?lèi)毒品在藥理作用上與苯丙胺類(lèi)毒品相似,二者在構(gòu)型上的特點(diǎn)也相似,即S構(gòu)型比R構(gòu)型對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的作用強(qiáng)[13]。甲卡西酮是卡西酮類(lèi)毒品中常見(jiàn)的一種,是卡西酮的N-甲基衍生物,比卡西酮的藥效強(qiáng)數(shù)倍。Glennon等[14]通過(guò)小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí),S-甲卡西酮和R-甲卡西酮對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)都有刺激作用;S-甲卡西酮藥效是R-甲卡西酮藥效的3～5倍,是S-苯丙胺藥效的2倍。

圖 2 “三點(diǎn)手性識(shí)別模式”示意圖Fig. 2 Diagram of “three-point chiral recognition model”a. chiral agent; b. one enantiomer; c. the other enantiomer.

2 3類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的手性分離

2.1 色譜法分離對(duì)映異構(gòu)體的原理

對(duì)映異構(gòu)體的手性分離方法主要分為色譜法和非色譜法兩大類(lèi)。由于非色譜法不能獲得較純的對(duì)映異構(gòu)體,并且操作煩瑣,耗時(shí)較長(zhǎng),現(xiàn)已被色譜法逐漸取代。色譜法分離對(duì)映異構(gòu)體的原理主要基于Dalgliesh提出的“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”[15], Pirkle等[16]發(fā)展了“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”,并較為詳盡地闡釋了對(duì)映異構(gòu)體的拆分原理,在對(duì)映異構(gòu)體和手性作用物之間存在至少3個(gè)相互作用點(diǎn),其中至少一個(gè)作用點(diǎn)應(yīng)為立體化學(xué)作用,另外兩個(gè)作用點(diǎn)可以是不同類(lèi)型的作用力,例如氫鍵、偶極相互作用、電荷轉(zhuǎn)移、配位化合物、位阻排斥、疏水吸引等分子間作用。兩個(gè)對(duì)映異構(gòu)體與手性作用物之間形成非對(duì)映體絡(luò)合物的穩(wěn)定性有差異而得到分離。如圖2所示,手性作用物a與一種待分離的對(duì)映異構(gòu)體b形成了3組相互作用點(diǎn),即A與A′、B與B′和C與C′ 3個(gè)作用力。然而,手性作用物a與另一種待分離的對(duì)映異構(gòu)體c之間不存在C與C′作用力,因此a與b、a與c形成的非對(duì)映分子絡(luò)合物的性質(zhì)不同,可以通過(guò)色譜進(jìn)行分離。

然而,隨著色譜法中手性固定相的不斷發(fā)展,一些較復(fù)雜的手性固定相與待分離的對(duì)映異構(gòu)體之間的手性識(shí)別機(jī)理不能完全用“三點(diǎn)手性識(shí)別模式”解釋。隨著研究和認(rèn)識(shí)的不斷深入以及科技的快速發(fā)展,近年來(lái)關(guān)于手性識(shí)別機(jī)理的研究方法主要有熱力學(xué)分析法[17-20],通過(guò)計(jì)算機(jī)建立分子模型模擬手性識(shí)別方法[21-24],核磁共振、熒光分析等光譜學(xué)法[25,26]等。

2.2 常見(jiàn)的色譜分析方法

常見(jiàn)的手性藥物分離和檢測(cè)方法有氣相色譜法(GC)、高效液相色譜法(HPLC)、毛細(xì)管電泳法(CE)、超臨界流體色譜法(SFC)等分離技術(shù),以及上述分離技術(shù)和質(zhì)譜(MS)、紫外光譜(UV)等檢測(cè)技術(shù)的聯(lián)用。苯丙胺類(lèi)、卡西酮類(lèi)對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離方法集中使用GC、HPLC和CE,氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的色譜分離則大部分使用HPLC和CE。

2.2.1GC

GC是色譜法中發(fā)展較早的一項(xiàng)檢測(cè)技術(shù),也是較早應(yīng)用于對(duì)映異構(gòu)體分離的檢測(cè)技術(shù),其特點(diǎn)是對(duì)映異構(gòu)體的分離度、重現(xiàn)性和精度都很高。在具有揮發(fā)性和熱穩(wěn)定性的手性分子分離方面,GC展現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢(shì)。

早期苯丙胺類(lèi)、甲卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體使用GC分離的較多,其特點(diǎn)是進(jìn)樣分析前需使用手性衍生化試劑,這兩類(lèi)毒品常用的手性衍生化試劑主要有N-三氟乙酰-L-脯胺酰氯(L-TPC)和(+)R-α-甲氧基α-三氟甲基苯乙酸(MTPA)。最初在苯丙胺類(lèi)、甲卡西酮類(lèi)毒品的手性分離中,使用L-TPC作為手性衍生化試劑的情況較為普遍,因?yàn)轷Ｂ鹊姆磻?yīng)性最強(qiáng),與仲胺、仲羥基也能發(fā)生反應(yīng),但由于L-TPC商品化純度的影響,以及在存放過(guò)程中其會(huì)發(fā)生消旋化,生成一定比例的另一構(gòu)型對(duì)映異構(gòu)體,該雜質(zhì)會(huì)影響衍生化產(chǎn)物的純度,使得檢測(cè)結(jié)果產(chǎn)生8%～19%的偏差[27]。而MTPA的衍生化效果比L-TPC更好,孟品佳[28]對(duì)比了L-TPC和MTPA對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離情況,使用MTPA進(jìn)行衍生化產(chǎn)物的穩(wěn)定性明顯好于L-TPC衍生化產(chǎn)物,并且可以對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行定量分析[29]?？ㄎ魍?lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體也能夠使用L-TPC進(jìn)行手性衍生化,但L-TPC的外消旋化會(huì)對(duì)部分卡西酮類(lèi)毒品的手性分離產(chǎn)生影響,Mohr等[30]的研究表明,使用L-TPC進(jìn)行衍生化會(huì)使S-甲卡西酮轉(zhuǎn)化成R-甲卡西酮。與使用L-TPC進(jìn)行手性衍生化相比,卡西酮類(lèi)毒品經(jīng)MTPA衍生化后的產(chǎn)物有更好的分離度,能夠在質(zhì)譜中獲得較優(yōu)的離子對(duì)[31]。

GC技術(shù)是開(kāi)發(fā)得較早的一種分離對(duì)映異構(gòu)體的色譜技術(shù),但其存在一些固有的局限性,例如:進(jìn)樣前需進(jìn)行手性衍生化，使得操作較復(fù)雜;操作溫度相對(duì)比較高，使衍生化后的非對(duì)映異構(gòu)體之間的相互作用能差別變小,對(duì)映異構(gòu)體分離困難[32];柱溫高導(dǎo)致對(duì)映異構(gòu)體的選擇性降低等。由于GC技術(shù)進(jìn)行手性分離時(shí)必須使用手性衍生化試劑,手性衍生化試劑的穩(wěn)定性非常重要,如果其中一種對(duì)映異構(gòu)體會(huì)對(duì)手性衍生化試劑產(chǎn)生消旋化的影響,這將導(dǎo)致兩種對(duì)映異構(gòu)體衍生化生成的非對(duì)映異構(gòu)體出現(xiàn)混淆,從而影響對(duì)映異構(gòu)體的正確分離檢測(cè),比如氯胺酮不宜使用常見(jiàn)的脯氨酰類(lèi)手性衍生化試劑進(jìn)行衍生就是這個(gè)原因[33]。這些局限性導(dǎo)致一部分對(duì)映異構(gòu)體不宜通過(guò)GC技術(shù)實(shí)現(xiàn)分離,目前使用該技術(shù)進(jìn)行手性分離的研究逐漸減少。

2.2.2HPLC

HPLC是在GC的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)色譜技術(shù),是手性分離領(lǐng)域應(yīng)用最廣泛的色譜方法。相對(duì)于GC的局限性,HPLC能夠有效避免因溫度過(guò)高對(duì)手性分離產(chǎn)生的影響。HPLC可以分為間接法和直接法,其中,間接法是指手性衍生化試劑法,即目標(biāo)物經(jīng)衍生化處理后再使用HPLC分離;直接法是指直接選用手性固定相或者在流動(dòng)相中加入手性添加劑。近年來(lái),直接法在手性分離中應(yīng)用較多,適用于多種對(duì)映異構(gòu)體的混合分離,該方法還能避免間接法中因添加手性衍生化試劑引入雜質(zhì)對(duì)分離檢測(cè)帶來(lái)的影響。

苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離檢測(cè)廣泛使用了HPLC技術(shù),其中現(xiàn)有文獻(xiàn)中苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離研究使用手性固定相法的居多,也有部分采用手性添加劑法,而氯胺酮和卡西酮類(lèi)則大多數(shù)使用手性固定相法。該3類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體使用的手性固定相涉及3種不同類(lèi)型的手性色譜柱,即蛋白質(zhì)類(lèi)手性柱、多聚糖類(lèi)手性柱和大環(huán)抗生素類(lèi)手性柱。蛋白質(zhì)具有復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu),其亞單位L-氨基酸具有手性特異性,因此可以識(shí)別對(duì)映異構(gòu)體。由其制成的手性固定相廣泛應(yīng)用于手性藥物的識(shí)別檢測(cè),其優(yōu)點(diǎn)是可使用水作為流動(dòng)相且手性選擇能力較好。多聚糖類(lèi)化合物(尤其是纖維素和支鏈淀粉)本身具有一定的手性識(shí)別能力,其衍生后表現(xiàn)出較好的手性識(shí)別能力,使其在手性柱方面得到廣泛應(yīng)用。大環(huán)抗生素類(lèi)化合物分子具有立體的環(huán)狀結(jié)構(gòu)、芳香基團(tuán)、氨基和羥基等活性基團(tuán),包含幾個(gè)到幾十個(gè)手性中心。作為手性固定相,大環(huán)抗生素類(lèi)化合物具有手性識(shí)別能力強(qiáng)、穩(wěn)定性高等優(yōu)點(diǎn),相體系轉(zhuǎn)化時(shí)不發(fā)生老化和變性,在對(duì)映異構(gòu)體的分離方面已經(jīng)得到了較好的應(yīng)用[34]。這3類(lèi)毒品手性分離研究中,使用較多的手性色譜柱類(lèi)型、手性選擇劑以及使用的流動(dòng)相總結(jié)見(jiàn)表1。

表 1 苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體研究中常見(jiàn)手性色譜柱類(lèi)型、手性選擇劑及相配的流動(dòng)相

苯丙胺類(lèi) 使用手性固定相法對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行手性分離的研究中,手性固定相的種類(lèi)主要是大環(huán)抗生素類(lèi)手性柱和蛋白質(zhì)類(lèi)手性柱,多糖類(lèi)手性柱的表現(xiàn)不佳。Castrignanò等[35]對(duì)比了Chiralpak CBH、Chirobiotic V和Chirobiotic T 3種手性色譜柱對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離效果。Chiralpak CBH是蛋白質(zhì)類(lèi)手性柱,通常用來(lái)拆分堿性化合物的對(duì)映異構(gòu)體,其優(yōu)勢(shì)是對(duì)包含苯環(huán)結(jié)構(gòu)的伯胺和仲胺類(lèi)化合物的手性分離能力較強(qiáng)。Chirobiotic V和Chirobiotic T是大環(huán)抗生素類(lèi)手性柱,前者的手性選擇劑是萬(wàn)古霉素,后者的手性選擇劑是替考拉寧,替考拉寧對(duì)某些天然和合成氨基酸以及小肽的對(duì)映異構(gòu)體分離能力較為突出[36]。3種手性柱中,Chiralpak CBH的總體分離效果略?xún)?yōu)于Chirobiotic V,而Chirobiotic T可以分離某些ChiralpakCBH不能分離的苯丙胺類(lèi)對(duì)映異構(gòu)體。該文獻(xiàn)[35]的方法可以分離廢水中AM、MAMP、MDMA等9種苯丙胺類(lèi)毒品的18種對(duì)映異構(gòu)體,以峰面積對(duì)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸,每種物質(zhì)線(xiàn)性良好(相關(guān)系數(shù)(r2)均大于0.997),方法平均精密度小于10%,儀器平均精密度小于5%。該方法通過(guò)監(jiān)測(cè)生物環(huán)境中的毒品廢物,能夠用來(lái)跟蹤毒品的合成路徑和使用路徑。張穎怡等[37]對(duì)比了Chirobiotic V2和Chiralpak IA-3兩種手性色譜柱,Chirobiotic V2手性柱是新型鍵合型Chirobiotic V手性柱,升級(jí)后的手性識(shí)別能力增強(qiáng),而Chiralpak IA-3是一種多聚糖類(lèi)手性柱。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:Chirobiotic V2手性色譜柱對(duì)胺類(lèi)化合物立體選擇性較優(yōu),對(duì)AM和MAMP對(duì)映異構(gòu)體的分離效果具有明顯優(yōu)勢(shì),可以在12 min內(nèi)對(duì)AM和MAMP的對(duì)映異構(gòu)體實(shí)現(xiàn)手性分離,而Chiralpak IA-3手性色譜柱不能分離苯丙胺類(lèi)對(duì)映異構(gòu)體。

使用手性添加劑法對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品進(jìn)行手性分離時(shí),手性選擇劑一般選用環(huán)糊精及其衍生物,環(huán)糊精及其衍生物加入的體積、流動(dòng)相的比例會(huì)影響手性分離的效果。Taschwer等[38]考察了流動(dòng)相的組成對(duì)苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體分離效果的影響。如果流動(dòng)相是體積比為10∶90的甲醇和水,并加入1%的硫化β-環(huán)糊精,則保留時(shí)間會(huì)縮短,但只有AM的對(duì)映異構(gòu)體可以得到分離;如果甲醇和水的體積比變?yōu)?.5∶97.5,硫化β-環(huán)糊精的體積依舊占比1%,則保留時(shí)間會(huì)增加,但是分離效果仍較差。因此經(jīng)過(guò)優(yōu)化,流動(dòng)相的條件最終設(shè)置為體積比2.5∶97.5的甲醇和水,硫化β-環(huán)糊精體積占比2%,成功實(shí)現(xiàn)了AM、MDMA等6種苯丙胺類(lèi)毒品的12種對(duì)映異構(gòu)體的分離。

氯胺酮 氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體可以使用蛋白質(zhì)類(lèi)手性柱、多聚糖類(lèi)手性柱和大環(huán)抗生素類(lèi)手性柱進(jìn)行分離,每種手性柱對(duì)應(yīng)的方法各有特點(diǎn)。

Chiralpak AGP手性柱是蛋白質(zhì)類(lèi)手性柱中分離能力最強(qiáng)、使用范圍最廣的一種,可以對(duì)中性、酸性和堿性化合物進(jìn)行手性分離。使用此種手性柱對(duì)氯胺酮對(duì)應(yīng)異構(gòu)體進(jìn)行分離的研究始于20世紀(jì)90年代初,該色譜柱的分離程度受pH、柱溫、有機(jī)溶劑比例等色譜條件影響較大,缺點(diǎn)是手性分離時(shí)間較長(zhǎng),只能耐受低比例的有機(jī)溶劑。蔣娟娟等[39]利用該手性柱,建立了檢測(cè)人體血漿中氯胺酮及其代謝物去甲基氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體濃度的方法,并將此方法應(yīng)用于研究氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的藥代動(dòng)力學(xué)。該方法手性分離效果良好,靈敏度高,無(wú)基質(zhì)效應(yīng)影響,但是進(jìn)樣量不宜超過(guò)20 μL,否則會(huì)影響峰形。

Chiralpak AS-H是一種多聚糖類(lèi)手性柱,該手性柱是Chiralpak AGP手性柱升級(jí)后的手性柱,其特點(diǎn)是克服了Chiralpak AGP手性柱運(yùn)行時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。Toki等[40]利用該手性柱建立了一種快速、高效分離大鼠血漿、大腦和腦脊髓液中氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)除了分析時(shí)間短(5 min)外,還有檢材用量少,每次僅需5 μL血漿、10 mg腦組織或2.5 μL腦脊髓液,定量限(LOQ)為1 ng/mL(血漿)、0.5 ng/g(大腦組織)和2 ng/mL(腦脊髓液)。多聚糖手性柱CHIRAL-JM-R手性柱可與高比例(有機(jī)相體積>30%)的有機(jī)試劑乙腈或甲醇一起使用,并顯示出與質(zhì)譜的良好相容性。Li等[41]利用該手性柱研究了血漿中氯胺酮對(duì)映體的檢測(cè)方法,以及給狗靜脈注射氯胺酮后,兩種對(duì)映異構(gòu)體體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)情況。他們考察了流動(dòng)相的構(gòu)成,有機(jī)相選擇乙腈,常用的甲酸銨、乙酸銨體系不能分離氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體,而當(dāng)水相為碳酸氫銨時(shí),分離效果良好。氯胺酮的兩種對(duì)映異構(gòu)體在0.5～500 ng/mL間顯示出良好的線(xiàn)性(r2>0.99), LOQ為0.5 ng/mL,日內(nèi)精密度小于7.3%,日間精密度小于10%。

選擇大環(huán)抗生素類(lèi)手性柱對(duì)氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離時(shí),將極性有機(jī)流動(dòng)相模式引入手性分離,能夠取得比較好的效果。單麗娜等[42]測(cè)定人血漿中氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的濃度時(shí),采用Chirobiotic V手性柱,使用的極性有機(jī)流動(dòng)相為甲醇中加入少量有機(jī)酸冰醋酸和有機(jī)堿三乙胺。該實(shí)驗(yàn)探究了冰醋酸和三乙胺比例對(duì)手性分離的影響,當(dāng)冰醋酸和三乙胺在甲醇中的總比例上升時(shí),氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的保留時(shí)間和分離度逐漸下降;當(dāng)甲醇、冰醋酸、三乙胺體積比為100∶0.02∶0.02時(shí),分離效果較佳,可以排除血漿中內(nèi)源性物質(zhì)及氯胺酮代謝物對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生的干擾。

卡西酮類(lèi) 使用HPLC法分離卡西酮類(lèi)毒品的對(duì)映異構(gòu)體時(shí),常用手性固定相為多聚糖類(lèi)手性柱,對(duì)流動(dòng)相的配比要求較高。Kadkhodaei等[43]使用Lux i-cellulose-5手性色譜柱,成功實(shí)現(xiàn)了47種卡西酮類(lèi)毒品的94種對(duì)映異構(gòu)體的分離。該實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始選用極性有機(jī)流動(dòng)相模式,以乙腈、異丙醇、二乙胺、甲酸(體積比為95∶5∶0.1∶0.1)為流動(dòng)相,但手性分離結(jié)果并不理想,經(jīng)證實(shí)正相模式更優(yōu),流動(dòng)相為正己烷、異丙醇和二乙胺(體積比為95∶5∶0.1)。H?gele等[44]以纖維素三-3,5-二甲基苯氨基甲酸酯為手性固定相,建立了一種可以快速分離數(shù)十種卡西酮衍生物對(duì)映異構(gòu)體的方法。該實(shí)驗(yàn)一開(kāi)始使用已有文獻(xiàn)中的流動(dòng)相配比,即正己烷、異丙醇、二乙胺的體積比為90∶10∶0.1,調(diào)整3種物質(zhì)的配比為95∶5∶0.1和99∶1∶0.1,但是分離度和保留時(shí)間均不佳。之后將異丙醇換成正丁醇,并將配比調(diào)整至正己烷、正丁醇、二乙胺體積比100∶0.3∶0.2,可以成功分離33種卡西酮衍生物的66種對(duì)映異構(gòu)體和11種吡咯烷酮衍生物的22種對(duì)映異構(gòu)體。如果將流動(dòng)相調(diào)整為正己烷-二乙胺體積比為100∶0.2,可以拆分另外9種卡西酮衍生物的18種對(duì)映異構(gòu)體和1種吡咯戊酮衍生物的2種對(duì)映異構(gòu)體;該方法還能對(duì)其中6種卡西酮衍生物的12種對(duì)映異構(gòu)體混合物進(jìn)行同時(shí)分離。

隨著人們對(duì)手性識(shí)別機(jī)理認(rèn)識(shí)的不斷深入以及色譜技術(shù)的不斷發(fā)展,HPLC已成為當(dāng)前手性藥物分離檢測(cè)中最常用和最有效的方法。然而,HPLC也存在一定限制,例如間接法同樣存在進(jìn)樣前需進(jìn)行手性衍生化導(dǎo)致操作較復(fù)雜的問(wèn)題,而直接法則存在手性固定相價(jià)格較高的問(wèn)題。每種手性固定相有其適宜分離的化合物,目前的應(yīng)用范圍有限,即使同屬于苯丙胺類(lèi)、卡西酮類(lèi)毒品,也會(huì)因其他基團(tuán)的影響而導(dǎo)致需要使用不同種類(lèi)的手性固定相。很難預(yù)測(cè)哪種手性固定相適用于具體的某種物質(zhì),選擇合適的手性固定相通常比較耗時(shí)并且成本較高。如果手性固定相改性升級(jí)后適用的范圍更廣,或者有更加準(zhǔn)確的手性固定相識(shí)別機(jī)理,那么有可能解決選擇困難和成本高的問(wèn)題。

2.2.3CE

CE是一類(lèi)以毛細(xì)管為分離通道、以高壓直流電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的液相分離方法,其特點(diǎn)是集高效和應(yīng)用廣泛性于一身,相對(duì)HPLC技術(shù)成本較低,在手性分離方面也顯示出了巨大潛力。目前使用CE分離手性化合物的研究中,環(huán)糊精(CD)及其衍生物是眾多手性選擇劑里最常用的一類(lèi)[45],這在苯丙胺類(lèi)、氯胺酮和卡西酮類(lèi)的手性分離研究中也有所體現(xiàn)。這3類(lèi)毒品使用CE進(jìn)行手性分離研究的重點(diǎn)主要集中在手性選擇劑的種類(lèi)和濃度對(duì)手性分離的影響,使用的手性選擇劑主要是環(huán)糊精及其衍生物?？傮w來(lái)說(shuō),苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體使用β-CD及其衍生物和硫化γ-CD進(jìn)行分離的效果最佳。

由于β-CD的空腔與大部分藥物相匹配,且易于制得,因此β-CD及其衍生物是電中性環(huán)糊精及其衍生物中最為常用的類(lèi)型之一[46],苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體均能使用β-CD及其衍生物進(jìn)行手性分離。Varesio等[47]在實(shí)驗(yàn)中對(duì)比了α-CD、β-CD和γ-CD分離尿液中AM、MDA、MDMA、MDEA外消旋體的效果,結(jié)果顯示γ-CD最不適合苯丙胺類(lèi)對(duì)映異構(gòu)體的分離,β-CD和2-羥丙基-β-CD的分離效果較好,相較于β-CD, 2-羥丙基-β-CD具有更優(yōu)的特性:稍好一些的溶解性,更短的分析時(shí)間以及200 nm下UV檢測(cè)基線(xiàn)更穩(wěn)定,因而最終被選定。該實(shí)驗(yàn)還比較了2-羥丙基-β-CD濃度對(duì)手性分離的影響,在10～40 mmol/L的濃度范圍中,20 mmol/L是最佳濃度。

硫化γ-CD屬于陰離子型環(huán)糊精,一般認(rèn)為比中性環(huán)糊精的手性分離能力更強(qiáng),其優(yōu)勢(shì)是可以通過(guò)靜電作用吸附到毛細(xì)管壁上,起到類(lèi)似固定相作用,避免樣品吸附,改善分離效果,并且還可以調(diào)整對(duì)映異構(gòu)體的出峰順序。Mikuma等[48]以高硫化γ-CD為手性選擇劑,建立了一種可以分離AM、MAMP、麻黃堿等8種苯丙胺類(lèi)衍生物的16種對(duì)映異構(gòu)體混合物的方法。Theurillat等[49]研究了硫化γ-CD分離氯胺酮及其代謝物對(duì)映異構(gòu)體的方法。他們開(kāi)展了微測(cè)定實(shí)驗(yàn),每組實(shí)驗(yàn)使用50 μL狗的血漿或血清,將0.6%～0.8%(緩沖液中的體積分?jǐn)?shù)，下同)硫化γ-CD作為手性選擇劑加入pH=3的100 mmol/L磷酸緩沖液中,于25 ℃的條件下,在16 min內(nèi)拆分出手性氯胺酮,定量限小于1 ng/mL。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)0.66%的硫化γ-CD已經(jīng)可以進(jìn)行手性分離,硫化γ-CD體積分?jǐn)?shù)升高會(huì)增加檢測(cè)時(shí)間,體積分?jǐn)?shù)降低會(huì)縮短檢測(cè)時(shí)間，體積分?jǐn)?shù)過(guò)低可能會(huì)導(dǎo)致檢測(cè)不充分。該方法的實(shí)驗(yàn)結(jié)果完全可媲美HPLC法。Moini等[50]研究了使用CE-MS技術(shù)時(shí),高硫化γ-CD的體積分?jǐn)?shù)(為0.08%～0.2%)及其在毛細(xì)管柱中的填充量對(duì)卡西酮類(lèi)對(duì)映異構(gòu)體分離的影響。當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為0.125%時(shí),手性分離效果最好?；谒麄冎暗难芯?(+)-18-冠-6-四羧酸是一種冠醚類(lèi)手性選擇劑,能對(duì)某些氨基酸、神經(jīng)遞質(zhì)的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離,將其與CD合用構(gòu)成二元體系手性分離能力更強(qiáng)。在該實(shí)驗(yàn)中,他們將15 mmol/L的(+)-18-冠-6-四羧酸填充到毛細(xì)管中,與0.125%高硫化γ-CD合用,成功分離了6種卡西酮類(lèi)衍生物的12種對(duì)映異構(gòu)體。

該3類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體通常使用的是CE技術(shù)中最為常見(jiàn)的分離模式,即毛細(xì)管區(qū)帶電泳(CZE),此外也有毛細(xì)管電色譜(CEC)模式的研究。CEC模式是CE與液相色譜相結(jié)合形成的一種微分離技術(shù),通過(guò)在毛細(xì)管柱內(nèi)填充或鍵合手性固定相,以電滲流為驅(qū)動(dòng)力,根據(jù)對(duì)映體在手性固定相和流動(dòng)相之間分配系數(shù)及電泳淌度的不同實(shí)現(xiàn)分離,該技術(shù)在對(duì)映異構(gòu)體的分離研究中有一定優(yōu)勢(shì)。Aturki等[51]利用CEC建立了一種可以分離10種卡西酮衍生物的20種對(duì)映異構(gòu)體的方法,該方法的核心是毛細(xì)管柱中填充直鏈淀粉-三(5-氯-2-甲基苯氨基甲酸酯)作為手性固定相。電壓設(shè)置為10 kV,溫度為20 ℃,可以在10 min內(nèi)分離10種對(duì)映異構(gòu)體。與GC、LC相比,CEC具有試劑用量少、手性固定相含量少等優(yōu)點(diǎn),因此在對(duì)映異構(gòu)體的分離研究中CEC法具有經(jīng)濟(jì)且環(huán)境友好的優(yōu)勢(shì)。

CE技術(shù)是近年來(lái)在手性分析中發(fā)展最快的技術(shù),已取得重要的地位和得到廣泛的應(yīng)用,但其明顯缺點(diǎn)在于沒(méi)有明確的方法判斷哪種物質(zhì)是合適的手性選擇劑,僅停留在經(jīng)驗(yàn)和實(shí)驗(yàn)階段,各種手性選擇劑確切的拆分機(jī)制及其影響因素,還有待于進(jìn)一步研究和探索。目前苯丙胺類(lèi)、氯胺酮、卡西酮類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離研究中,經(jīng)常需要對(duì)比3種以上的手性選擇劑才能選出其中較為合適的一種,如何根據(jù)待分離化合物的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)判斷適合的手性選擇劑是需要解決的難點(diǎn)問(wèn)題。

3 3類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離在法醫(yī)毒物分析中的應(yīng)用

在法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域中,對(duì)手性毒品的研究包括對(duì)已知毒品對(duì)映異構(gòu)體純度的檢驗(yàn)以及未知毒品性質(zhì)的認(rèn)定等方面。建立快速、高效的手性分析方法,對(duì)判斷毒品來(lái)源、認(rèn)定犯罪嫌疑人罪名、為法官提供量刑參考等方面都有重要影響。

近年來(lái),在法醫(yī)毒物學(xué)分析領(lǐng)域中,苯丙胺類(lèi)毒品對(duì)映異構(gòu)體的研究主要集中在測(cè)定毒品濫用者血漿、毛發(fā)、尿液中MAMP和AM的含量,并由此推斷市場(chǎng)上毒品的原型及合成路線(xiàn)。Maas等[52]通過(guò)LC-MS/MS技術(shù),研究了106份由德國(guó)兩個(gè)地區(qū)警察提供的案件血漿樣本,結(jié)果顯示在超過(guò)99%的檢材中,僅檢測(cè)到S-MAMP,從而得出結(jié)論,在德國(guó)市場(chǎng)上主要流通的是由1R,2S-麻黃堿或1S,2S-偽麻黃堿合成的S-MAMP,以及外消旋體MAMP。Binz等[53]研究了兩類(lèi)人員的頭發(fā),第一類(lèi)是瑞士警方提供的街頭服用AM的人員,第二類(lèi)是服用一種治療注意缺陷障礙藥物(活性成分是S-AM)患者,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)從第一類(lèi)人員毛發(fā)中檢測(cè)出的R/S-AM對(duì)映異構(gòu)體比例為0.9～1.3,表明這些人員攝入的是外消旋體AM,而除一名患者外,第二類(lèi)人員的頭發(fā)種僅檢測(cè)出S-AM。通過(guò)對(duì)映異構(gòu)體的比例可以簡(jiǎn)單判斷是服用藥物還是攝入AM毒品。Wang等[54]通過(guò)建立的檢測(cè)尿液中AM和MAMP對(duì)映異構(gòu)體的方法,成功檢測(cè)了86份疑似MAMP濫用者的尿樣。其中72份樣品中只檢測(cè)到S-MAMP和S-AM,有14份尿樣中兩種構(gòu)型的MAMP和AM都均檢出,但S-MAMP和S-AM占比更大,所有尿樣中都沒(méi)有單獨(dú)檢測(cè)出R-MAMP陽(yáng)性,因此可以推斷S-MAMP是非法濫用藥物的主要成分。飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)可以提供化合物的準(zhǔn)確質(zhì)量信息,因而越來(lái)越多地用于篩查未知藥物。Cui等[55]建立了一種利用毛細(xì)管電泳-飛行時(shí)間質(zhì)譜技術(shù)篩查苯丙胺類(lèi)毒品的方法,該方法可以快速、準(zhǔn)確地篩查未知樣品是否包含AM、MAMP、MDA等9種苯丙胺類(lèi)毒品的對(duì)映異構(gòu)體。

氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的分離研究涉及的人體相關(guān)檢材類(lèi)型非常豐富。Hasan等[56]利用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù),建立了一種可以從人血清、尿液和排泄物中分離出氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的方法。該方法的優(yōu)點(diǎn)為所需基質(zhì)的體積小(200 μL),洗脫液用量少(300 μL),可以延長(zhǎng)色譜柱的壽命,并且樣品制備速度快,分析時(shí)間短且靈敏度更高。該方法還可以分離10種羥基化的氯酮胺代謝物。Porpiglia等[57]研究了人毛發(fā)中氯胺酮對(duì)映異構(gòu)體的分離方法,他們還通過(guò)驗(yàn)證實(shí)踐中收集到的氯胺酮呈陽(yáng)性的毛發(fā)樣品,確認(rèn)了建立方法的有效性,為法庭科學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)毛發(fā)中是否含有手性氯胺酮提供了參考方法法。

在過(guò)去的幾年中,卡西酮類(lèi)毒品的種類(lèi)越來(lái)越多,針對(duì)這個(gè)問(wèn)題,法醫(yī)毒物學(xué)領(lǐng)域的研究趨勢(shì)是建立的方法能分離數(shù)十種卡西酮衍生物的對(duì)映異構(gòu)體,這樣的方法可以提高檢驗(yàn)效率。Alremeithi等[58]通過(guò)氣相色譜-負(fù)化學(xué)電離-質(zhì)譜法(GC-NCI-MS),使用L-TPC進(jìn)行衍生化,建立了一種可以靈敏分離36種卡西酮衍生物的72種對(duì)映異構(gòu)體的方法。該方法還可以對(duì)一次性加入14種卡西酮衍生物的28種對(duì)映異構(gòu)體混合物的尿液和血漿樣品進(jìn)行定量分析。H?gele等[59]利用CZE技術(shù)建立的方法能分離58種卡西酮衍生物的106種對(duì)映異構(gòu)體,該方法使用β-CD、乙酰基-β-CD、2-羥丙基-β-CD、CM-β-CD 4種CD衍生物作為手性選擇劑,每種手性選擇劑對(duì)應(yīng)不同的工作電壓(β-CD:陰極30 kV,乙?；?β-CD和2-羥丙基-β-CD:陰極29 kV, CM-β-CD:陰極22 kV),除工作電壓不同外,其他條件一致(10 mmol/L手性選擇劑,10 mmol/L磷酸鈉,用磷酸調(diào)節(jié)的pH=2.5,溫度25 ℃)。

4 結(jié)論與展望

分析技術(shù)的不斷發(fā)展對(duì)毒品的檢測(cè)、分離與認(rèn)定均產(chǎn)生了積極作用。在現(xiàn)有研究中,毒品對(duì)映異構(gòu)體的分離方法主要以GC、HPLC和CE技術(shù)為主,另外,近些年還有部分研究使用的是SFC技術(shù),該技術(shù)是一種以超臨界流體為流動(dòng)相的色譜分析技術(shù),其特點(diǎn)是既可以分析揮發(fā)性差的樣品,還具有比HPLC更高的效率,分析時(shí)間更短,操作條件易變換,在手性分離上具有較優(yōu)的前景。目前已有使用該技術(shù)對(duì)這3類(lèi)毒品的對(duì)映異構(gòu)體進(jìn)行分離的研究[60-62],還有將SFC與HPLC技術(shù)相結(jié)合的苯丙胺手性分離研究[63],但該技術(shù)的缺點(diǎn)是各種參數(shù)對(duì)手性分離的影響機(jī)制尚未完全確定,需要在高壓下進(jìn)行,對(duì)設(shè)備和技術(shù)上要求較高,如果未來(lái)能解決上述問(wèn)題,SFC技術(shù)可能成為對(duì)映異構(gòu)體分離中常用的技術(shù)之一。

根據(jù)國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局、公安部、國(guó)家衛(wèi)生和計(jì)劃生育委員會(huì)公布的《麻醉藥品和精神藥品品種目錄》(食藥監(jiān)藥化監(jiān)[2013]230號(hào))和公安部、國(guó)家衛(wèi)生計(jì)生委、國(guó)家食品藥品監(jiān)督管理總局、國(guó)家禁毒辦公室發(fā)布的《非藥用類(lèi)麻醉藥品和精神藥品列管辦法》(公通字[2015]27號(hào))及4次增加公告,截至目前,我國(guó)共管制麻醉藥品121種,精神藥品149種,非藥用類(lèi)麻醉藥品和精神藥品156種(另加156種以外其他符合條件的芬太尼類(lèi)物質(zhì)),而能對(duì)人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)造成嚴(yán)重危害的藥品數(shù)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不止這些,未納入管制的毒品中還包括一部分手性毒品。未來(lái)毒品對(duì)映異構(gòu)體的研究將是毒品來(lái)源判斷、純度認(rèn)定(摻雜、摻假)、對(duì)犯罪嫌疑人定罪量刑判斷的一個(gè)重要方向。隨著新精神活性物質(zhì)種類(lèi)的不斷增加,毒品種類(lèi)和成分越來(lái)越復(fù)雜,涉及的對(duì)映異構(gòu)體分離檢測(cè)會(huì)逐漸增多。今后對(duì)毒品手性分離的研究應(yīng)從以下3個(gè)方面展開(kāi):(1)進(jìn)一步借助計(jì)算機(jī)技術(shù)對(duì)手性固定相和手性選擇劑的手性識(shí)別機(jī)理進(jìn)行深入研究,建立和完善分子模型模擬手性識(shí)別方法,為日后挑選最合適的手性固定相和手性選擇劑進(jìn)行研究提供有力的理論支持;(2)研發(fā)可以應(yīng)用于手性分離的新型技術(shù),以及對(duì)SFC技術(shù)的商用研究;(3)手性分離在司法實(shí)踐、醫(yī)藥研發(fā)等實(shí)際工作中的應(yīng)用。