楊麗霞 曽希珂 易 姿

(長(zhǎng)沙市食品藥品檢驗(yàn)所，湖南 長(zhǎng)沙 410036)

四環(huán)素類抗生素(tetracyclines，TCs)是一類重要的抗生素，因其具有抗菌譜廣、藥性穩(wěn)定、低毒、價(jià)格低廉等特點(diǎn)，在治療革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌引起的人畜感染中得到了廣泛的應(yīng)用[1-2]。目前，四環(huán)素在家畜和水產(chǎn)養(yǎng)殖中常被使用[3-4]，導(dǎo)致日常食品中存在四環(huán)素殘留，特別多見于肉類、魚、牛奶和蜂蜜等動(dòng)物產(chǎn)品中[5-7]。人通過食物長(zhǎng)期低劑量攝入四環(huán)素并在體內(nèi)蓄積，易引起人體內(nèi)耐藥菌株的產(chǎn)生和增加，導(dǎo)致胃腸道疾病、過敏、腎毒性，以及血液或中樞神經(jīng)系統(tǒng)等疾病[8]。因此，應(yīng)該控制四環(huán)素等抗生素的使用，中國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[9]規(guī)定雞蛋中四環(huán)素殘留限量應(yīng)≤400 μg/kg，肌肉中≤200 μg/kg，肝臟中≤600 μg/kg，牛奶中≤100 μg/kg。其他國(guó)家也制定了動(dòng)物產(chǎn)品中四環(huán)素類藥物的最大殘留限量標(biāo)準(zhǔn)。例如，歐盟[10]規(guī)定，雞蛋中四環(huán)素殘留的最大限量應(yīng)≤200 μg/kg，肌肉中≤100 μg/kg，肝臟中≤300 μg/kg，牛奶中≤100 μg/kg。

目前，四環(huán)素的檢測(cè)已成功建立了多種分析方法，包括高效液相色譜法[11]、液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法[12]、微生物分析法[13]、毛細(xì)管電泳法[14-15]、酶免疫分析[16]以及電化學(xué)免疫傳感器[17-19]等。盡管其中一些方法[11-12]具有較高的選擇性和足夠的靈敏度，但大多數(shù)方法都或多或少地存在一些缺點(diǎn)，如儀器相對(duì)昂貴、樣品制備過程復(fù)雜、預(yù)處理耗時(shí)等。

熒光金屬納米分析方法具有操作簡(jiǎn)單、速度快、靈敏度高、選擇性好等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)引起了研究人員的廣泛關(guān)注。銅納米簇作為一種新型的功能性納米顆粒，由于合成簡(jiǎn)單、光穩(wěn)定性好以及在水溶液中具有良好的分散性，使其作為熒光探針在生物傳感領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。近年來，基于雙鏈DNA和單鏈DNA模板合成的銅納米簇的報(bào)道很多。例如，Wang等[20]基于聚T模板合成銅納米簇，建立了一種曲酸的無標(biāo)記檢測(cè)方法。Ou等[21]以聚T為模板的銅納米粒子作為熒光探針靈敏測(cè)定胰蛋白酶。Song等[22]利用雙鏈DNA模板合成銅納米離子，結(jié)合核酸外切酶催化的目標(biāo)循環(huán)擴(kuò)增能力，建立了一種檢測(cè)赭曲霉毒素A的熒光方法。Zhang等[23]運(yùn)用雙鏈DNA模板銅納米粒子作為熒光指示劑，建立了一種無標(biāo)記熒光方法檢測(cè)多核苷酸激酶活性。Hu等[24]基于雙鏈DNA模板合成銅納米粒子，用于核酸酶的檢測(cè)。Song等[25]利用雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)和雙鏈DNA模板合成的銅納米粒子，建立了一種無標(biāo)記、非酶促擴(kuò)增的DNA檢測(cè)方法。據(jù)以上文獻(xiàn)報(bào)道，以聚T為模板合成的銅納米簇，具有熒光強(qiáng)度高的特點(diǎn)，尺寸和熒光強(qiáng)度可以通過聚T單鏈DNA的長(zhǎng)度來調(diào)節(jié)；另外，相比dsDNA-銅納米簇的合成，為了保證dsDNA模板的有效雜交，通常需要耗時(shí)1 h以上，而聚T銅納米簇的合成只需要幾分鐘即可完成。

在上述基礎(chǔ)上，試驗(yàn)擬以聚T模板合成的銅納米簇作為熒光探針，構(gòu)建一種新的熒光生物傳感方法用于檢測(cè)實(shí)際樣品中的四環(huán)素類抗生素，以期為食品中四環(huán)素類抗生素的快速檢測(cè)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

含30個(gè)堿基的聚胸腺嘧啶寡聚核苷酸鏈(T30)：生工生物工程(上海)股份有限公司；

鹽酸四環(huán)素、鹽酸土霉素、鹽酸金霉素、青霉素、氨芐西林、頭孢氨芐、鹽酸林可霉素、鏈霉素、卡那霉素、氯霉素：USP級(jí)，生工生物工程(上海)股份有限公司；

CuSO4·5H2O、抗壞血酸、甘氨酸、精氨酸、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)：分子生物學(xué)級(jí)，BBI生命科學(xué)有限公司；

緩沖體系：20 mmol/L 3-(N-嗎啉基)丙磺酸(MOPS)緩沖溶液(pH=7.5)；

試驗(yàn)用水：超純水(電阻率>18.2 MΩ·cm)，超純水系統(tǒng)SMARTPLUS-N；

熒光分光光度計(jì)：LS-55型，珀金埃爾默股份有限公司；

電子天平：ME204型，瑞士Mettler Toledo公司。

1.2 熒光銅納米簇的制備

熒光銅納米簇的合成是以T30-DNA鏈為模板在文獻(xiàn)[26]的合成方法上稍作修改。將5 mmol/L抗壞血酸溶液10 μL加入到70 μL含有2 μmol/L T30-DNA的MOPs緩沖溶液(20 mmol/L MOPS，300 mmol/L NaCl，pH=7.5)中混合均勻，再加入10 μL 300 μmol/L CuSO4溶液，室溫下避光孵育5 min，得到熒光銅納米簇。

1.3 檢測(cè)條件的優(yōu)化

由于Cu2+濃度、抗壞血酸濃度、銅納米簇合成時(shí)間、加入四環(huán)素的孵育時(shí)間是影響四環(huán)素檢測(cè)的重要參數(shù)，采用單一變量的原則，對(duì)4個(gè)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。

1.3.1 Cu2+濃度的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察Cu2+濃度(100，200，300，400，500，600 μmol/L)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.2 抗壞血酸濃度的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察抗壞血酸濃度(1，2，3，4，5，6，7 mmol/L)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.3 銅納米簇合成時(shí)間的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，考察銅納米簇合成時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7，8 min)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.3.4 加入四環(huán)素的孵育時(shí)間的優(yōu)化 在T30-DNA濃度2 μmol/L，Cu2+濃度300 μmol/L，抗壞血酸濃度5 mmol/L，銅納米簇合成時(shí)間5 min，考察加入四環(huán)素的孵育時(shí)間(1，2，3，4，5，6，7 min)對(duì)體系熒光強(qiáng)度的影響。

1.4 四環(huán)素的檢測(cè)

按照1.3的最優(yōu)條件合成熒光銅納米顆粒。將10 μL 不同濃度的四環(huán)素溶液(濃度分別為0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0 μmol/L)與90 μL 熒光銅納米簇溶液混合均勻，保證總體系體積為100 μL，室溫下避光孵育5 min，將溶液移入石英比色皿，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光，激發(fā)波長(zhǎng)340 nm，發(fā)射光譜波長(zhǎng)掃描范圍500～660 nm。

1.5 四環(huán)素檢測(cè)的特異性

為了驗(yàn)證方法的特異性，將濃度為100 μmol/L的鹽酸四環(huán)素(TC)、鹽酸土霉素(OTC)、鹽酸金霉素(AM)、青霉素(PC)、氨芐西林(SAM)、頭孢氨芐(CLX)、鹽酸林可霉素(LM)、鏈霉素(SM)、卡那霉素(KAN)、氯霉素(CM)以及濃度為1 mmol/L的甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、葡萄糖(Glc)、麥芽糖、蔗糖、氯化鈣、氯化鎂等多種目標(biāo)物，按照1.4的步驟加入到熒光銅納米簇溶液中混合均勻，室溫下避光孵育5 min，使用熒光分光光度計(jì)測(cè)量熒光。

1.6 牛奶樣品的準(zhǔn)備

純牛奶樣品購于當(dāng)?shù)爻小Ｎ? g牛奶樣品用5 mL 1%的三氯乙酸超聲提取20 min，然后在15 000 r/min 轉(zhuǎn)速下離心5 min，取上清液用濾紙過濾，將收集的濾液用水定容至5 mL，最后將通過0.22 μm的濾膜后的清液用于樣品分析[27]。采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行牛奶樣品中四環(huán)素的分析。

1.7 雞肉樣品的準(zhǔn)備

1.7.1 提取 雞胸肉樣品購于當(dāng)?shù)爻小悠分兴沫h(huán)素的提取步驟按照中國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]3檢測(cè)方法中的提取步驟進(jìn)行。

1.7.2 凈化 雞肉樣品中四環(huán)素的凈化步驟參考中國(guó)現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]3檢測(cè)方法中的凈化步驟并略有修改。準(zhǔn)確吸取10 mL提取液以1滴/s的速度過HLB固相萃取柱，待樣液完全流出后，依次用5 mL水和5 mL甲醇—水(V甲醇∶V水=1∶19)淋洗，棄去全部流出液。2.0 kPa以下減壓抽干5 min，最后用10 mL甲醇—乙酸乙酯(V甲醇∶V乙酸乙酯=1∶9)洗脫。將洗脫液氮吹濃縮至干(溫度低于40 ℃)，用1.0 mL超純水溶解殘?jiān)?，過0.22 μm 濾膜，收集清液用于樣品分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法進(jìn)行實(shí)際樣品中四環(huán)素的分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測(cè)方法原理

試驗(yàn)方法的檢測(cè)原理如圖1所示。在不添加四環(huán)素的條件下，制備了以T30-ssDNA為模板的銅納米簇，并表現(xiàn)出了優(yōu)異的性能。T30-ssDNA模板銅納米簇的形成通常包括兩個(gè)步驟：胸腺嘧啶和Cu2+之間的結(jié)合作用，促進(jìn)了“胸腺嘧啶-Cu2+”復(fù)合物的形成；抗壞血酸沿poly-T模板骨架將胸腺嘧啶絡(luò)合的Cu2+還原為Cu0，形成了銅納米簇，在340 nm激發(fā)波長(zhǎng)的激發(fā)條件下，具有較強(qiáng)的熒光信號(hào)。當(dāng)傳感體系中存在目標(biāo)物四環(huán)素時(shí)，銅納米簇的熒光強(qiáng)度顯著降低。這可能是由于四環(huán)素與poly-T模板銅納米簇表面的基團(tuán)發(fā)生相互作用，猝滅了銅納米顆粒的熒光，導(dǎo)致熒光信號(hào)的降低。試驗(yàn)通過研究四環(huán)素存在與否對(duì)熒光響應(yīng)的差異，設(shè)計(jì)了一種無標(biāo)記、選擇性的四環(huán)素?zé)晒馍飩鞲衅鳌?/p>

2.2 熒光傳感檢測(cè)方法的可行性

為了檢驗(yàn)該熒光傳感方法用于四環(huán)素檢測(cè)的可行性，即四環(huán)素的存在與否對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響，測(cè)定了四環(huán)素存在與不存在時(shí)銅納米簇的熒光值。如圖2所示，當(dāng)銅納米簇體系中加入10 μL超純水時(shí)，檢測(cè)到強(qiáng)熒光值，當(dāng)加入10 μL的300 μmol/L的四環(huán)素時(shí)，熒光值顯著降低。以上結(jié)果表明該熒光傳感檢測(cè)方法用于四環(huán)素的檢測(cè)是可行的。

圖1 基于非標(biāo)記聚T單鏈DNA模板銅納米簇的四環(huán)素傳感檢測(cè)原理

2.3 試驗(yàn)條件優(yōu)化

2.3.1 Cu2+濃度的優(yōu)化 根據(jù)檢測(cè)原理，所開發(fā)傳感器的檢測(cè)性能在很大程度上取決于銅納米簇的熒光強(qiáng)度。因此，考察了合成條件對(duì)反應(yīng)的影響。如圖3所示，銅納米簇的熒光強(qiáng)度隨Cu2+濃度的增加而迅速升高，當(dāng)Cu2+濃度為300 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度達(dá)到最高，當(dāng)Cu2+濃度>300 μmol/L時(shí)，熒光強(qiáng)度隨之降低。這可能是由于較高濃度的Cu2+經(jīng)還原劑活化后，通過氧基自由基降解聚T模板。結(jié)果表明，Cu2+的最佳濃度為300 μmol/L。

2.3.2 抗壞血酸濃度的優(yōu)化 從圖4可以看出，隨著抗壞血酸濃度的增加，熒光強(qiáng)度顯著增加，當(dāng)抗壞血酸濃度為5 mmol/L時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高。因此，選擇5 mmol/L為抗壞血酸最佳濃度。

2.3.3 銅納米簇合成時(shí)間優(yōu)化 如圖5所示，當(dāng)T30-ssDNA中加入Cu2+和抗壞血酸后，隨著孵育時(shí)間的增加，熒光強(qiáng)度迅速增加，當(dāng)時(shí)間為5 min時(shí)熒光強(qiáng)度達(dá)到最高并趨于平穩(wěn)，因此，5 min被選為銅納米簇的最佳合成時(shí)間。

a. 不存在四環(huán)素 b. 存在300 μmol/L四環(huán)素

圖3 Cu2+濃度對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

圖4 抗壞血酸濃度對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

2.3.4 四環(huán)素孵育時(shí)間優(yōu)化 如圖6所示，四環(huán)素加入后，隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng)熒光強(qiáng)度逐漸降低，孵育時(shí)間超過5 min后熒光強(qiáng)度趨于平穩(wěn)。在最初的3 min內(nèi)，熒光度迅速下降(下降了89%)。因此，為了獲得較短的反應(yīng)時(shí)間，選擇5 min為四環(huán)素最佳孵育時(shí)間。熒光法對(duì)四環(huán)素的定量分析性能，在優(yōu)化的試驗(yàn)條件下

2.4 檢測(cè)方法的性能

為了進(jìn)一步研究基于T30-ssDNA模板的銅納米簇檢測(cè)了加入不同濃度四環(huán)素的熒光強(qiáng)度。圖7描繪了在不同濃度的四環(huán)素存在下，T30-ssDNA為模板的銅納米簇的典型熒光光譜。從圖7可以看出，在0～300 μmol/L的四環(huán)素濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度隨濃度的增加逐漸降低。圖8示出了四環(huán)素濃度與610 nm處的熒光強(qiáng)度之間的關(guān)系。在0～80 μmol/L的濃度范圍內(nèi)，熒光強(qiáng)度和四環(huán)素濃度之間獲得了良好的線性關(guān)系，線性回歸方程為y=-0.687 9CTC+96.122，線性回歸系數(shù)R2=0.996 1。根據(jù)空白響應(yīng)的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差，檢測(cè)限為0.01 μmol/L，按式(1)進(jìn)行換算后可得到：用于四環(huán)素殘留量的檢測(cè)范圍為0～384 720 μg/kg，且測(cè)定低限為48 μg/kg，略低于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)[28]5檢測(cè)方法(液相色譜質(zhì)譜法)的檢測(cè)限50 μg/kg。根據(jù)中國(guó)現(xiàn)行判定標(biāo)準(zhǔn)[9]的規(guī)定，牛奶樣品中的四環(huán)素殘留限量為100 μg/kg，肌肉樣品中的四環(huán)素殘留限量為200 μg/kg，該標(biāo)準(zhǔn)中四環(huán)素殘留限量均在試驗(yàn)方法四環(huán)素殘留量的檢測(cè)范圍內(nèi)，這些結(jié)果進(jìn)一步證明，試驗(yàn)提出的無標(biāo)記熒光生物傳感器可以應(yīng)用于目標(biāo)四環(huán)素的定量分析，性能良好，且該方法能對(duì)實(shí)際樣品四環(huán)素殘留量是否合格進(jìn)行判定。

圖5 銅納米簇合成時(shí)間對(duì)熒光強(qiáng)度的影響

圖6 四環(huán)素孵育時(shí)間對(duì)銅納米簇?zé)晒鈴?qiáng)度的影響

熒光曲線從上至下四環(huán)素濃度分別是0.0，0.5，5.0，10.0，20.0，40.0，60.0，80.0，100.0，150.0，200.0，300.0 μmol/L

圖8 濃度校準(zhǔn)曲線

(1)

式中：

X——樣品中待測(cè)組分的含量，μg/kg；

c——測(cè)定液中待測(cè)組分的濃度，μmol/L；

v——測(cè)定液的體積，0.1 mL；

m——待測(cè)樣品的質(zhì)量，g；

500——稀釋倍數(shù)；

480.9——四環(huán)素的摩爾分子量。

2.5 檢測(cè)方法的特異性

為了驗(yàn)證檢測(cè)方法的特異性，測(cè)試了其他抗生素、金屬離子、氨基酸、糖類等對(duì)銅納米簇的熒光影響，結(jié)果見圖9。由圖9可知，只有四環(huán)素類抗生素(鹽酸四環(huán)素、土霉素、金霉素)能顯著降低銅納米簇的熒光強(qiáng)度，其他干擾物對(duì)熒光強(qiáng)度無影響，以上結(jié)果表明四環(huán)素類抗生素對(duì)銅納米簇的熒光猝滅作用具有特異性。

2.6 實(shí)際樣品分析

為探討食品中四環(huán)素測(cè)定方法的可行性，分別在牛奶和雞肉樣品中加入標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分析，采用標(biāo)準(zhǔn)加入法評(píng)價(jià)了該方法的實(shí)用性。結(jié)果見表1。牛奶樣品中，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在98.72%～108.30%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為2.36%～4.01%，雞肉樣品中，3個(gè)加標(biāo)水平的平均回收率在97.67%～110.23%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD，n=6)為2.98%～3.84%，表明該檢測(cè)方法準(zhǔn)確性較好，能夠被用于實(shí)際樣品檢測(cè)。

3 結(jié)論

利用聚T單鏈為模板制備銅納米簇作為熒光探針構(gòu)建了一種熒光生物傳感方法用于四環(huán)素的檢測(cè)。結(jié)果顯示，該方法對(duì)四環(huán)素具有靈敏度高、選擇性強(qiáng)的檢測(cè)能力，檢測(cè)限為0.01 μmol/L。與其他方法相比，該檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)：① 這種新型傳感器無需共軛或標(biāo)記過程，所有的反應(yīng)過程都在10 min內(nèi)室溫避光下完成；② 對(duì)四環(huán)素類抗生素具有較高的特異性。此外該方法可用于牛奶、雞肉等實(shí)際樣品中四環(huán)素的測(cè)定，因此作為一種無標(biāo)記、快速、高選擇性、高靈敏度的四環(huán)素類的檢測(cè)平臺(tái)，在食品分析等領(lǐng)域的小分子檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。