鐘文濤 徐 越 王淑好 王芳妹

(1. 國(guó)家農(nóng)副產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，湖南 長(zhǎng)沙 410007；2. 湖南省產(chǎn)商品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，湖南 長(zhǎng)沙 410007)

加拿大動(dòng)物學(xué)家Hebert等[1]于2003年提出“DNA條形碼”的概念，希望用“標(biāo)準(zhǔn)化”的基因片段(如COI基因)作為物種快速識(shí)別的標(biāo)記，建立起物種名稱和生物實(shí)體之間一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。經(jīng)過(guò)10余年的發(fā)展，科研人員將DNA條形碼與基因測(cè)序技術(shù)相結(jié)合，在動(dòng)植物的相似種識(shí)別方面已經(jīng)做了大量工作[2]，在國(guó)際上建立了多個(gè)與DNA條形碼相關(guān)的合作組織和大型數(shù)據(jù)庫(kù)[3]，取得了初步成效。Buddhachat等[4]評(píng)估了條形碼技術(shù)與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定技術(shù)在魚類分類上的差異，認(rèn)為DNA條形碼更為準(zhǔn)確、高效；Xing等[5]使用COI基因?qū)χ袊?guó)市場(chǎng)上銷售的各種動(dòng)物源食品的標(biāo)簽錯(cuò)誤問(wèn)題進(jìn)行了調(diào)查，發(fā)現(xiàn)23%的產(chǎn)品標(biāo)簽存在瑕疵；Liu等[6]為識(shí)別中國(guó)藥典中有毒藥用植物及其摻假物，對(duì)比了4種候選DNA條形碼的識(shí)別效率，發(fā)現(xiàn)ITS2基因可用作通用條形碼。

對(duì)微生物DNA條形碼的研究雖有文獻(xiàn)[7-8]報(bào)道，但相較動(dòng)植物而言則顯得滯后。究其原因是由于微生物具有物種的多樣性和基因的高突變性，找到穩(wěn)定可靠的保守基因片段作為研究目標(biāo)具有一定難度[9]。現(xiàn)有文獻(xiàn)[10-11]報(bào)道發(fā)現(xiàn)適用于原核生物DNA條形碼研究的目標(biāo)基因有16SrRNA、COI和cpn60，其中16SrRNA在各大數(shù)據(jù)庫(kù)中資源最為豐富，因此對(duì)其的研究也相對(duì)集中。

在食品檢驗(yàn)領(lǐng)域，DNA條形碼在肉制品、海產(chǎn)品真實(shí)性鑒定上已有應(yīng)用[12]，但對(duì)食品中病原微生物的相關(guān)研究尚未開展。研究選擇16S rRNA的V3～V6區(qū)域?yàn)槟繕?biāo)基因片段，對(duì)食品中常見病原微生物及其表型類似株的序列進(jìn)行分析，目的是建立一種基于DNA條形碼技術(shù)的快速、準(zhǔn)確的識(shí)別方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

Chelex 100：美國(guó)Bio-Rad公司；

2×PCR Master mix、DNA Marker、Agarose Gel DNA Extraction Kit：寶生物工程(大連)有限公司；

電泳級(jí)瓊脂糖：生工生物工程(上海)股份有限公司；

8種常見病原微生物(見表1)和15種表型類似株(大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、熒光假單胞菌、表皮葡萄球菌)：ATCC、CICC、CMCC菌株庫(kù)和廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀：C1000 Touch型，美國(guó)Bio-Rad公司；

核酸蛋白測(cè)定儀：SmartSpec plus型，美國(guó)Bio-Rad公司；

電泳儀：powerpac universal型，美國(guó)Bio-Rad公司；

凝膠成像系統(tǒng)：GelDoc XR+型，美國(guó)Bio-Rad公司；

高速離心機(jī)：MiniSpin Plus型，德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 菌株純化及核酸提取

菌株活化后用非選擇性培養(yǎng)基劃線分離，挑取單個(gè)菌落接種增菌肉湯，(36±1) ℃培養(yǎng)(24±2) h。將菌懸液振蕩混勻后，取1.5 mL在8 000 r/min下離心5 min，棄上清液，使用適量的無(wú)菌生理鹽水洗菌3次，最后一次離心時(shí)盡量吸干剩余液體。在沉淀物中加入30 μL 5%的Chelex 100溶液并使其重新懸浮，然后在100 ℃沸水中保持10 min，立即置于冰上冷卻1 min，12 000 r/min離心10 min，所得上清液作為擴(kuò)增模板，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物設(shè)計(jì)

16S rRNA包含9個(gè)V區(qū)(可變區(qū)，Variable region)和10個(gè)C區(qū)(保守區(qū)，Conserved region)，且V區(qū)和C區(qū)交替排列[13-14]。設(shè)計(jì)DNA條形碼通用引物時(shí)應(yīng)考慮將上下游引物落在C區(qū)，中間包含一個(gè)或數(shù)個(gè)V區(qū)。在GeneBank中搜索表1中8種病原微生物的16S rRNA基因組編碼序列，選擇盡可能完整的序列，目的是包含所研究的V3～V6區(qū)域(起止位置為433～1 043，共計(jì)610 bp[15])。將序列導(dǎo)入到DNASTAR軟件中，通過(guò)MegAlign功能分析菌種間16SrRNA基因的同源性和變異性，用Primer Premier 6設(shè)計(jì)適合在不同菌種間擴(kuò)增的通用引物。共測(cè)試了兩對(duì)通用引物(表2)，其中通用引物1為項(xiàng)目組自行設(shè)計(jì)，通用引物2為項(xiàng)目組對(duì)文獻(xiàn)[15]中的引物進(jìn)行改良所得。引物序列由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.5 PCR擴(kuò)增

通用引物PCR反應(yīng)在20 μL體系中進(jìn)行：2×PCR Master mix 10 μL、10 μmol/L正反引物各0.5 μL，DNA模板1 μL，無(wú)菌水8 μL。PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸150 s，循環(huán)35次，72 ℃再延伸5 min。取5 μL反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增產(chǎn)物。將瓊脂糖凝膠上的電泳條帶切下，按照瓊脂糖DNA純化試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行提取純化后，送至寶生物工程(大連)有限公司進(jìn)行基因測(cè)序鑒定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

將測(cè)序所得的序列除去首尾各30 bp堿基，選擇合適的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)。GenBank是最為常用的比對(duì)數(shù)據(jù)庫(kù)，序列資源非常豐富，但其質(zhì)量良莠不齊；而RDP是基于細(xì)菌和真菌的核糖體序列信息建立的專業(yè)數(shù)據(jù)庫(kù)，最新版本已包含3 356 809條16S rRNA信息，可提供足夠可靠的比對(duì)信息。采用GenBank的Blastn功能，結(jié)合RDP的Classifier和Sequence Match功能，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

表1 菌種信息及其16S rRNA序列片段編號(hào)

表2 通用引物序列

1.7 干擾菌測(cè)試

按照1.3中描述的試驗(yàn)步驟，對(duì)15種干擾菌進(jìn)行純化并提取核酸。使用表2中的2對(duì)通用引物分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增，后續(xù)PCR擴(kuò)增按照1.5中所述的步驟進(jìn)行，數(shù)據(jù)處理按照1.6中所述執(zhí)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 電泳圖譜

由于所擴(kuò)增的23種測(cè)試菌株分別屬于4個(gè)“目”、6個(gè)“科”及11個(gè)“屬”，為了實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增效率的最大化，在設(shè)計(jì)通用引物時(shí)使用了簡(jiǎn)并堿基。從圖1和圖2可以看出，試驗(yàn)條件下，通用引物1和2對(duì)所有目標(biāo)片段均進(jìn)行了有效的擴(kuò)增，電泳條帶清晰明亮，大小符合預(yù)期，沒(méi)有發(fā)生引物二聚體的現(xiàn)象，說(shuō)明通用引物的適用性較強(qiáng)。

2.2 序列比對(duì)

經(jīng)比對(duì)，在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中，通用引物1擴(kuò)增的序列Percent Identity最低值為97.96%，通用引物2擴(kuò)增的序列Percent Identity最低值為98.91%；經(jīng)RDP數(shù)據(jù)庫(kù)的Classifier檢索，所有序列的“門、綱、目、科、屬”信息匹配率為100%，通用引物1擴(kuò)增的序列在Seqmatch score最低值為0.983，通用引物2擴(kuò)增的序列在Seqmatch score最低值為0.972。

因此，不論是在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)還是在RDP數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，序列的匹配率均符合預(yù)期值，所有菌種的序列均能準(zhǔn)確鑒定到“屬”水平，部分能準(zhǔn)確鑒定到 “種”水平(見表3)。通用引物1和通用引物2的擴(kuò)增產(chǎn)物雖然長(zhǎng)度相差近300 bp，但是對(duì)試驗(yàn)所涉及的目標(biāo)菌的識(shí)別能力基本一致，僅在福氏志賀氏菌的比對(duì)結(jié)果上存在差異。

1～9泳道分別為DNA Marker、鼠傷寒沙門菌、阪崎腸桿菌、福氏志賀氏菌、副溶血性弧菌、銅綠假單胞菌、單核細(xì)胞增生李斯特氏菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌

2.3 菌種識(shí)別

根據(jù)表3所列信息，對(duì)8種常見的病原微生物及相關(guān)15種表型類似菌株按所屬“目”“科”進(jìn)行分類后，統(tǒng)計(jì)DNA條形碼序列在不同分類水平上的菌種識(shí)別能力，如圖3、4所示。可以發(fā)現(xiàn)，16S rRNA的V3～V6區(qū)域能較好地鑒別弧菌目、假單胞菌目和芽孢桿菌目的葡萄球科相關(guān)菌種，可明確區(qū)分其中的致病菌和非致病菌；而對(duì)芽孢桿菌目中的李斯特氏菌科、芽孢桿菌科中的相關(guān)菌種只能鑒別到“屬”水平，還需要借助其他技術(shù)手段才能達(dá)到區(qū)分的目的；對(duì)腸桿菌科目腸桿菌科的菌種識(shí)別中，沙門氏菌屬和志賀氏菌屬不能鑒定到“種”水平，但可以明確區(qū)分腸桿菌科的其他屬，由于食品中分離出的沙門氏菌屬和志賀氏菌屬均屬于致病菌范疇，因此也能達(dá)到病原微生物識(shí)別的目的。

部分菌種僅能識(shí)別到“屬”水平，在“種”水平給出了多個(gè)可能的鑒定結(jié)果，可能由于這些菌種在V3～V6區(qū)域的序列過(guò)于近似，引物設(shè)計(jì)時(shí)可考慮擴(kuò)增其他一個(gè)或幾個(gè)可變區(qū)域。

DNA條形碼結(jié)合基因測(cè)序技術(shù)極大地提高了物種分類學(xué)的準(zhǔn)確性和高效性[16-17]，其最大優(yōu)勢(shì)在于可以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知物種的識(shí)別。目前，基因測(cè)序技術(shù)已經(jīng)發(fā)展到了第三代，每一代技術(shù)各具優(yōu)勢(shì)，應(yīng)用場(chǎng)景也存在差異。例如高通量測(cè)序可快速實(shí)現(xiàn)對(duì)環(huán)境樣品中微生物進(jìn)行宏觀普查，節(jié)約了大量時(shí)間、人力成本，但同時(shí)由于得到的信息量大，干擾數(shù)據(jù)多，因此針對(duì)性不強(qiáng)。而試驗(yàn)建立的方法其成本和技術(shù)門檻較低，試驗(yàn)結(jié)果無(wú)需生物信息學(xué)專業(yè)人士分析，適用于普通實(shí)驗(yàn)室中單一樣品或單一菌落分析。

但是，在DNA條形碼試驗(yàn)設(shè)計(jì)及執(zhí)行過(guò)程中有以下幾點(diǎn)需要引起重視：① 不同物種間通用引物的設(shè)計(jì)需要考慮的因素較多；② 對(duì)純化后的核酸質(zhì)量(如純度、濃度)要求較高，否則會(huì)出現(xiàn)套峰或無(wú)法檢測(cè)的情況；③ 測(cè)序長(zhǎng)度一般控制在400～800 bp的范圍內(nèi)，且首尾20 bp左右的序列由于準(zhǔn)確度較差，需舍去后再進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)；④ 菌種的16S rRNA數(shù)據(jù)庫(kù)信息需進(jìn)一步更新、完善，以增加菌種識(shí)別的范圍和準(zhǔn)確度。

1～16泳道分別為DNA Marker、大腸埃希氏菌、奇異變形桿菌、普通變形桿菌、弗氏檸檬酸桿菌、產(chǎn)氣腸桿菌、斯氏李斯特氏菌、英諾克李斯特氏菌、伊氏李斯特氏菌、枯草芽孢桿菌、蕈狀芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌、溶藻弧菌、霍亂弧菌、熒光假單胞菌、表皮葡萄球菌

表3 序列比對(duì)結(jié)果

圖3 “目”水平的菌種識(shí)別

圖4 “科”水平的菌種識(shí)別

3 結(jié)論

中國(guó)現(xiàn)行食品安全檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)體系中涉及病原微生物的檢測(cè)均為針對(duì)某一指定菌種進(jìn)行分離鑒定，強(qiáng)調(diào)檢驗(yàn)結(jié)果的特異性，而對(duì)產(chǎn)品中可能存在的其他微生物風(fēng)險(xiǎn)無(wú)法全面覆蓋。試驗(yàn)基于細(xì)菌的16S rRNA，對(duì)DNA條形碼在食品生物安全領(lǐng)域的應(yīng)用進(jìn)行了探索。依照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，選擇V3～V6區(qū)域作為目標(biāo)片段，對(duì)變形桿菌綱(腸桿菌目、弧菌目、假單胞菌目)具有足夠的分辨率，能準(zhǔn)確識(shí)別食品中的致病菌和相關(guān)干擾菌，而對(duì)芽孢桿菌綱(芽孢桿菌目)的鑒定將范圍縮小到了“屬”水平，減輕了進(jìn)一步識(shí)別的工作量。在食品病原微生物研究范疇內(nèi)，COI、cpn60或其他基因片段是否能實(shí)現(xiàn)更高的識(shí)別效率，還有待進(jìn)一步驗(yàn)證。DNA條形碼技術(shù)能實(shí)現(xiàn)在較低的技術(shù)平臺(tái)上對(duì)未知微生物的無(wú)靶標(biāo)識(shí)別，極大地方便了企業(yè)查因溯源及監(jiān)管機(jī)構(gòu)開展風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。