豆康寧 董 彬

(1. 漯河醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校河南省休閑食品工程技術(shù)研究中心，河南 漯河 462002；2. 河南科凝生物科技有限公司，河南 鄭州 450000)

甘草為多年生草本植物，屬豆科，是一種藥食兩用的食品資源[1]。在GB 2760—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中，甘草提取物(粉)、甘草酸銨、甘草酸一鉀及三鉀均為功能甜味劑，能在餅干、蜜餞涼果、調(diào)味品、糖果、肉罐頭類等食品中，按生產(chǎn)需要使用。

甘草富含粗脂肪、粗蛋白、氨基酸和礦物質(zhì)，甘草的根莖和籽粒中均含有油脂。甘草油具有很高的營養(yǎng)價值，據(jù)報道[2]，甘草油脂肪酸組成中主要含有4種脂肪酸，分別是棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中必需脂肪亞油酸含量約60%、亞麻酸含量約12%。甘草油具有醫(yī)療保健作用，對濕疹、皮炎、潰瘍等皮膚病具有一定的保健和治療作用[3-4]。白雪[5]研究表明，甘草油對失禁相關(guān)性皮炎具有良好的療效。解昱等[6]研究表明，甘草油對糜爛型扁平苔蘚具有良好的療效。張小桐[7]研究表明，甘草油可有效維護(hù)患者口腔健康，降低口腔感染、異味發(fā)生率，改善患者牙周健康狀況。因此，甘草油不僅含有豐富的必需脂肪酸，營養(yǎng)價值較高，而且具有很高的保健價值。

目前，甘草油的成分已有較多研究，但其毒理學(xué)研究鮮有報道，這為甘草油在食品中的應(yīng)用帶來一定不確定性。試驗擬依照GB 15193.1—2014《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品安全性毒理學(xué)評價程序》，研究甘草油的毒理學(xué)作用，探討甘草油的食用安全性，為甘草油在食品工業(yè)中的應(yīng)用提供安全性參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘草：烏拉爾甘草，水分含量7.3%，產(chǎn)地寧夏鹽池；

正己烷：分析純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；

小白鼠(BALB/C)、大白鼠(SD)：SPF級，在25 ℃的恒溫動物房中飼養(yǎng)，湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司；

環(huán)磷酰胺：分析純，蘇瑞醫(yī)藥化工有限公司；

食用油：大豆色拉油，益海嘉里集團(tuán)。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動生化分析儀：BT3000-plus型，意大利Biotecnlca Instruments公司；

全自動血液分析儀：KX-21型，日本Sysmex東亞公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52 A型，上海亞榮生化儀器廠。

1.3 試驗方法

1.3.1 甘草油提取 根據(jù)文獻(xiàn)[2]修改如下：將甘草粉碎成30目的粉末，稱量10.0 g甘草粉放入索氏抽提器中，加入200 mL正己烷，恒溫水浴鍋加熱溫度為70 ℃，提取時間為5 h。將提取液冷卻后轉(zhuǎn)移到旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，負(fù)壓蒸餾回收正己烷溶劑，加熱溫度為60 ℃，壓強為0.08 MPa，蒸發(fā)濃縮提取液后得到甘草油脂。

按式(1)計算甘草油脂提取率。

(1)

式中：

Y——甘草油脂提取率，%；

M1——甘草油脂質(zhì)量，g；

M0——甘草粉質(zhì)量，g；

W——水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)，%。

1.3.2 小白鼠急性毒性試驗 根據(jù)文獻(xiàn)[8]修改如下：選體重18～20 g健康小白鼠40只，雌雄各半，其中雌雄各分為2組，共4組。小白鼠禁食16 h后，按15.0 g/kg·BW的劑量經(jīng)口1次給甘草油，以食用油為對照組。觀察2周，記錄小白鼠中毒、死亡等情況。

1.3.3 小白鼠的精子畸形試驗 根據(jù)文獻(xiàn)[9]修改如下：選雄性性成熟小白鼠30只，體重18～20 g，按體重隨機(jī)分為5組，設(shè)低、中、高3個甘草油劑量組，劑量值順次為1.25，2.50，5.00 g/kg·BW，陰性對照組食用油為5.00 g/kg·BW，陽性對照組環(huán)磷酰胺為0.04 g/kg·BW。每天經(jīng)口灌胃甘草油2次，連續(xù)灌胃5 d，再繼續(xù)喂養(yǎng)2周，然后處死動物。取小白鼠兩側(cè)附睪制備精子標(biāo)本。再用伊紅染色小白鼠的精子標(biāo)本，最后在高倍鏡下檢查小白鼠的精子標(biāo)本。檢查小白鼠精子標(biāo)本數(shù)量為1 000個，同時記錄小白鼠精子突變數(shù)量及類型。

1.3.4 大白鼠30 d喂養(yǎng)試驗 根據(jù)文獻(xiàn)[10]修改如下：選體重180～200 g健康大白鼠40只，雌雄各半，分為8組，即雌雄各4組。設(shè)低、中、高3個甘草油劑量組，劑量值順次為1.25，2.50，5.00 g/(kg·BW·d)，陰性對照組食用油為5.00 g/(kg·BW·d)。大白鼠經(jīng)連續(xù)30 d口灌胃甘草油，再測定血液學(xué)指標(biāo)、血清生化學(xué)指標(biāo)、臟器質(zhì)量和臟體比。

1.3.5 統(tǒng)計學(xué)分析 數(shù)據(jù)分析采用SPSS軟件統(tǒng)計分析處理。采用t檢驗分析試驗組與對照組的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 甘草油提取率

用正己烷溶劑提取甘草油脂，在提取條件為溫度70 ℃、液料比(V正已烷∶m甘草)20∶1 (mL/g)、提取時間5 h 下，甘草油脂提取率達(dá)4.49%。而甘草中粗脂肪含量為5.38%[2]，以甘草中粗脂肪含量作為參照，則甘草油脂有效提取率達(dá)到83.5%。

2.2 小白鼠急性毒性試驗

試驗按照一次最大限量法經(jīng)灌胃15.0 g/kg·BW的甘草油，其結(jié)果見表1。

表1 甘草油對小白鼠的經(jīng)口急性毒性試驗結(jié)果

由表1可知，在2周觀察期內(nèi)，對照組和試驗組全部活動正常，包括活動、進(jìn)食、行為等未見異常，小白鼠死亡率為0%。說明甘草油對小白鼠沒有造成毒性影響。按急性毒性分級標(biāo)準(zhǔn)，判定該受試物甘草油為實際無毒物，甘草油的半數(shù)致死劑量LD50>15.0 g/kg·BW[11]。

2.3 小白鼠精子畸形試驗

由表2可知，甘草油各劑量組的小白鼠精子畸形率隨劑量的升高略微上升，而且高于陰性對照組(食用油)。但統(tǒng)計分析結(jié)果顯示，陰性對照組(食用油)與各甘草油劑量組之間均無顯著差異(P>0.1)。經(jīng)各劑量甘草油灌胃處理后，小白鼠的精子畸形率數(shù)值均在正常范圍(0.8%～3.4%)[12]內(nèi)，即小白鼠精子的畸形率與甘草油的劑量無相關(guān)性，說明甘草油在所設(shè)劑量范圍內(nèi)不引起小白鼠精子畸形率增高。

2.4 大白鼠30 d喂養(yǎng)試驗

2.4.1 大白鼠體重變化 在30 d喂養(yǎng)期間，大白鼠毛色保持正常，無異常行為且未發(fā)生死亡。由表3可知，與陰性對照組大白鼠的體重增加量相比，甘草油各劑量組雌、雄大白鼠體重的增加量有一定大小變化，但與甘草油劑量變化相關(guān)性不顯著(P>0.05)，與陰性對照組差異也不顯著(P>0.05)。甘草油各劑量組雌、雄大白鼠體重的增加量隨劑量遞增而增加。說明甘草油營養(yǎng)豐富，能夠滿足大白鼠機(jī)體正常的生長需要。

2.4.2 血液學(xué)檢查 由表4可知，甘草油各劑量組雌雄大白鼠的血紅蛋白、紅細(xì)胞、白細(xì)胞的指標(biāo)含量，與食用油陰性對照組差異均不顯著(P>0.05)，而且，甘草油各劑量組大白鼠的常規(guī)血液學(xué)指標(biāo)，與甘草油的劑量變化無顯著相關(guān)性(P>0.05)。說明大白鼠經(jīng)30 d口服甘草油，對其常規(guī)血液學(xué)指標(biāo)無顯著影響。

表2 甘草油對小白鼠精子的畸形率影響?

表3 甘草油對大白鼠體重的影響

2.4.3 血液生化學(xué)檢查 由表5可知，不同劑量甘草油喂養(yǎng)雌雄大白鼠30 d后，甘草油各組雌雄大白鼠的血清白蛋白、總蛋白、谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、肌酐、血清尿素氮、總膽固醇、甘油三酯、血糖的生化指標(biāo)含量，與食用油陰性對照組差異均不顯著(P>0.05)，而且，甘草油各劑量組血液生化指標(biāo)與甘草油的劑量變化無顯著相關(guān)性(P>0.05)。說明大白鼠經(jīng)30 d口服甘草油，對其血液生化學(xué)指標(biāo)無顯著的影響。

表4 甘草油對大白鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

2.4.4 對臟器質(zhì)量以及臟體比的影響 由表6可知，各甘草油劑量組的心質(zhì)量、腎質(zhì)量、肝質(zhì)量、肺質(zhì)量、脾質(zhì)量、心體質(zhì)量比、腎體質(zhì)量比、肝體質(zhì)量比、肺體質(zhì)量比、脾體質(zhì)量比，與食用油陰性對照組比較差異均不顯著(P>0.05)，且甘草油各劑量組間的臟器質(zhì)量及臟體比差異不顯著(P>0.05)。說明大白鼠經(jīng)30 d口服甘草油，對臟器質(zhì)量和臟體比無顯著的影響。

在大白鼠30 d喂養(yǎng)試驗中未見動物健康狀況、生化、血液學(xué)指標(biāo)和器官組織形態(tài)的異常變化，據(jù)此可以初步估計該產(chǎn)品的最大無作用劑量>5.0 g/kg·BW。

3 結(jié)論

經(jīng)過甘草油毒理學(xué)試驗研究表明，甘草油的半數(shù)致死劑量LD50>15.0 g/kg·BW，判屬甘草油為無毒類物質(zhì)。甘草油的最大無作用劑量>5.0 g/kg·BW，為人體推薦攝入量的150倍，因此，甘草油無急性毒性、亞急性毒性和遺傳毒性，具有較高的食用安全性。

表5 甘草油對大白鼠血液生化學(xué)指標(biāo)的影響

表6 甘草油對大白鼠臟器質(zhì)量和臟體比的影響

甘草油中的脂肪酸主要是棕櫚酸、油酸、亞油酸、亞麻酸，其中必需脂肪亞油酸含量高居首位[2]，因此，對甘草油與低油酸油脂進(jìn)行合理調(diào)配，開發(fā)高營養(yǎng)價值的調(diào)和油，具有廣闊的應(yīng)用前景。