楊梓超，王育良，左 晶

0引言

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是由于胰島素代謝異常所引發(fā)的視網(wǎng)膜局部組織缺氧、缺血，導(dǎo)致視網(wǎng)膜病變，是糖尿病最常見的微血管并發(fā)癥之一，可導(dǎo)致視力障礙及致盲[1]。DR的基本病理改變是血-視網(wǎng)膜屏障破壞，導(dǎo)致視網(wǎng)膜新生血管生成[2]。DR的發(fā)生、發(fā)展與多種生長(zhǎng)因子和細(xì)胞因子有關(guān)，其中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)及其受體血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子受體(vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR)是參與DR發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中最重要的因子[3]。血管生成素-1(angiopoietin-1，Ang-1)能與VEGF相互調(diào)節(jié)，維持血管內(nèi)皮細(xì)胞的成熟及穩(wěn)定，并促進(jìn)血管生成[4]。

中藥蒲黃具有活血化瘀、抗炎和抗凝等功效，目前臨床上已廣泛用于治療2型糖尿病[5]。有研究表明，蒲黃總黃酮(pollen typhae total flavone，PTF)可通過(guò)β抑制蛋白2介導(dǎo)的信號(hào)傳導(dǎo)改善胰島素誘導(dǎo)的葡萄糖攝取[6]。然而目前對(duì)于蒲黃提取物應(yīng)用于DR的治療研究較少，因此本研究通過(guò)蒲黃提取物治療DR大鼠并探討其保護(hù)作用，為臨床治療DR提供理論依據(jù)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物選擇SPF級(jí)雄性大鼠55只，8～12wk，體質(zhì)量180～240g，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所，合格證號(hào)：SCXK(滇)K2016-0001。本研究通過(guò)江蘇省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審批。

當(dāng)前，國(guó)內(nèi)外齒圈制造工藝普遍存在能耗大、環(huán)保不達(dá)標(biāo)等諸多弊端，研發(fā)、制造水平均處于較低的水準(zhǔn)。而該工藝方案可降低齒圈加工能耗，節(jié)約勞動(dòng)成本，有著廣闊的推廣應(yīng)用前景。

1.1.2實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器蒲黃提取物(西安賽奧生物技術(shù)有限公司提供)；鏈脲佐菌素(美國(guó)Sigma公司)；DAB顯色試劑盒(碧云天生物科技有限公司)；Trizol(美國(guó)Invitrogen公司)；VEGF、VEGFR2、Ang-1、GAPDHqRT-PCR上下游引物(上海生工公司)；兔抗鼠VEGF多克隆抗體、兔抗鼠VEGFR2多克隆抗體、兔抗鼠Ang-1多克隆抗體(均購(gòu)自北京博奧森生物技術(shù)有限公司)；山羊抗兔二抗(美國(guó)LI-COR公司)；ELISA試劑盒(南京建成生物工程研究所)。ACCU-CHEK? Mobile逸動(dòng)型血糖儀與血糖試紙(上海羅氏制藥有限公司)；ABI 7500型實(shí)時(shí)熒光定量PCR、MultiskanTMFC全自動(dòng)酶標(biāo)儀、iBrightTMCL1500成像系統(tǒng)(中國(guó)賽默飛世爾科技有限公司)；Allegra X-64R高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)Beckman Coulter公司)；DM750顯微鏡(德國(guó)Leica公司)；DW-86L626 -80℃超低溫冰箱(中國(guó)海爾集團(tuán)公司)。

1.2方法

1.2.1建立模型和分組隨機(jī)選取45只大鼠給予高脂飼料灌胃14d，采用一次性尾靜脈注射鏈脲佐菌素(STZ；50mg/kg)建立糖尿病模型。于STZ注射72h后測(cè)定大鼠空腹血糖，選取空腹血糖≥16.7mmol/L的大鼠作為糖尿病大鼠。繼續(xù)飼養(yǎng)1wk后，隨機(jī)選擇5只大鼠進(jìn)行HE染色觀察視網(wǎng)膜病理變化，視網(wǎng)膜發(fā)生病變則表明建模成功。將剩余40只大鼠隨機(jī)分為DR組(給予等量的生理鹽水灌胃)、實(shí)驗(yàn)A組[給予50mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]、實(shí)驗(yàn)B組[給予100mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]和實(shí)驗(yàn)C組[給予200mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃]，治療1wk后麻醉處死，采集各組大鼠視網(wǎng)膜及外周血進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。另選擇10只大鼠作為對(duì)照組(正常飼養(yǎng)，不做任何處理)。

1.2.2各組大鼠空腹血糖測(cè)定各組大鼠處理后，尾靜脈取血，采用血糖儀檢測(cè)各組大鼠血糖。

1.2.3 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜病理學(xué)檢查大鼠麻醉處死后取眼球，去除角膜、晶狀體、玻璃體，取出視網(wǎng)膜組織并用0.9%生理鹽水漂洗、濾紙、吸干，放入4%多聚甲醛中固定48h，然后進(jìn)行脫水、石蠟包埋、切片。病理切片厚度為4μm。將病理切片放置于65℃烘箱2h后，依次放入二甲苯20min、無(wú)水乙醇、95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇、50%乙醇各5min。蘇木素、酒精-伊紅染色。中性樹脂封片，鏡下觀察視網(wǎng)膜病理改變。

1.2.4 ELISA檢測(cè)各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量將大鼠麻醉處死，眼球取血2mL，靜置30min后4℃，4000r/min離心10min，取上清，并按照試劑盒說(shuō)明書分別檢測(cè)各組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量。

1.2.6qRT-PCR法檢測(cè)視網(wǎng)膜組織VEGF和VEGFR2及Ang-1 mRNA表達(dá)水平Trizol法提取視網(wǎng)膜組織總RNA，酶標(biāo)儀檢測(cè)其濃度后將總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，采用SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)VEGF、VEGFR、Ang-1基因的表達(dá)水平。引物由上海生工公司設(shè)計(jì)合成，引物設(shè)計(jì)如下：VEGF上游5’-CCTGGCTTTACTGCTGTACCT-3’，下游5’-GCTGGTAGACGTCCATGAACT-3’；VEGFR2上游5’-GCCGGCATGGTCTTCTGTGAG-3’，下游5’-GGGGCTCAGGACCACATCATAA-3’；Ang-1上游5’-TAAATCAAACATCCCCTCTT-3’，下游5’-AGGTGTCCAGCTCTTCCT-3’；GAPDH上游5’-ATTCCATGGCACCGTCAAGGCTG-3’，下游5’-GTGGTGAAGACGCCAGTGGACT-3’。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸30s，共40個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。每個(gè)樣本重復(fù)檢測(cè)3次。每組VEGF、VEGFR2和Ang-1基因的相對(duì)表達(dá)量按公式(2-△△Ct法)計(jì)算。

2結(jié)果

2.1各組大鼠一般情況及空腹血糖比較在建模過(guò)程中，DR組大鼠不明原因死亡2只，實(shí)驗(yàn)A組和實(shí)驗(yàn)B組各有1只大鼠因血糖未達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)予以剔除，其余大鼠均建模成功。對(duì)照組大鼠皮毛有光澤，精神好，行動(dòng)敏捷；DR組大鼠精神萎靡，皮毛枯黃無(wú)光澤，行動(dòng)遲緩；各實(shí)驗(yàn)組大鼠精神有改善，皮毛略有光澤，行動(dòng)較DR組敏捷。與對(duì)照組空腹血糖(6.20±0.65mmol/L)相比，DR組(24.93±4.62mmol/L)、實(shí)驗(yàn)A組(20.82±2.44mmol/L)、實(shí)驗(yàn)B組(17.48±1.90mmol/L)、實(shí)驗(yàn)C組(16.22±1.17mmol/L)大鼠空腹血糖均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=76.332，P<0.05)；與DR組相比，各實(shí)驗(yàn)組大鼠空腹血糖均有下降，且實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組大鼠空腹血糖顯著降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)A組與DR組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

圖1 HE染色觀察各組大鼠視網(wǎng)膜形態(tài)變化(×100) A：對(duì)照組：正常飼養(yǎng)，不做任何處理；B：DR組：給予等量的生理鹽水灌胃；C：實(shí)驗(yàn)A組：給予50mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃；D：實(shí)驗(yàn)B組：給予100mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃；E：實(shí)驗(yàn)C組：給予200mg/(kg·d)的蒲黃提取物灌胃。

表1 各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比較

2.2各組大鼠HE檢測(cè)視網(wǎng)膜病理變化HE結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層次清晰，細(xì)胞排列緊密；DR組大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞出現(xiàn)水腫、間隙增寬；實(shí)驗(yàn)A組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞稀疏，排列紊亂，細(xì)胞水腫比較明顯；實(shí)驗(yàn)B組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列較整齊，少量細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，可見部分空泡；實(shí)驗(yàn)C組大鼠視網(wǎng)膜各層細(xì)胞排列整齊，細(xì)胞形態(tài)正常，可見少許空泡，見圖1。

2.3各組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量比較與對(duì)照組相比，DR組和各實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(FIL-6=250.230，PIL-6<0.05；FTNF-α=1123.995，PTNF-α<0.05)；與DR組相比，實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組大鼠血清中IL-6、TNF-α含量均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)A組與DR組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表1。

圖2 各組大鼠VEGF mRNA表達(dá)水平 a P<0.05 vs對(duì)照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實(shí)驗(yàn)A組。

2.4各組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF和VEGFR2及Ang-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平比較與對(duì)照組相比，DR組和各實(shí)驗(yàn)組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(蛋白：FVEGF=162.629，PVEGF<0.05；FVEGFR2=197.990，PVEGFR2<0.05；FAng-1=135.654，PAng-1<0.05。mRNA：FVEGF=151.168，PVEGF<0.05；FVEGFR2=425.986，PVEGFR2<0.05；FAng-1=76.676，PAng-1<0.05)；與DR組相比，實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組大鼠視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而實(shí)驗(yàn)A組與DR組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見圖2～5和表2。

圖3 各組大鼠VEGFR2 mRNA表達(dá)水平 a P<0.05 vs對(duì)照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實(shí)驗(yàn)A組。

圖4 各組大鼠Ang-1 mRNA表達(dá)水平 a P<0.05 vs對(duì)照組；c P<0.05 vs DR組；e P<0.05 vs 實(shí)驗(yàn)A組。

圖5 各組大鼠VEGF、VEGFR2和Ang-1蛋白表達(dá)。

表2 各組大鼠VEGF和VEGFR2及Ang-1蛋白表達(dá)

3討論

DR是一種由于長(zhǎng)期高血糖引起的微血管病變，是一種涉及多種細(xì)胞因子的非常復(fù)雜的視網(wǎng)膜病變[7]。高血糖狀態(tài)是DR發(fā)生的始動(dòng)因素，可引起細(xì)胞內(nèi)外代謝發(fā)生紊亂，導(dǎo)致組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，從而導(dǎo)致DR的發(fā)生及發(fā)展。STZ糖尿病模型是用于研究DR病理機(jī)制及防治策略的常用動(dòng)物模型[8]。本研究給予高脂飼料灌胃14d，采用一次性尾靜脈注射STZ(50mg/kg)建立DR模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DR組大鼠精神萎靡，皮毛枯黃無(wú)光澤，行動(dòng)遲緩，且所有大鼠空腹血糖均≥16.7mmol/L，與對(duì)照組相比顯著升高；HE結(jié)果顯示，對(duì)照組大鼠視網(wǎng)膜各層次清晰，細(xì)胞排列緊密；DR組大鼠視網(wǎng)膜光感受器細(xì)胞層結(jié)構(gòu)被明顯破壞，細(xì)胞出現(xiàn)水腫、間隙增寬。提示本研究DR模型大鼠建立成功。DR的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜，炎癥、氧化應(yīng)激等在DR的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。據(jù)報(bào)道，促炎因子TNF-α、一氧化氮(NO)和細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(ICAM-1)的升高表達(dá)導(dǎo)致血視網(wǎng)膜屏障(BRB)功能的破裂；而減少TNF-α，NO和ICAM-1等促炎因子的表達(dá)可削弱BRB功能并減輕視網(wǎng)膜炎癥，緩解DR的發(fā)展[9]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，DR組大鼠血清中IL-6和TNF-α含量均顯著升高，相關(guān)研究表明DR患者房水中炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17A和TNF-α的水平可能與DR的發(fā)病機(jī)制，嚴(yán)重程度和預(yù)后有關(guān)[10]，提示炎癥因子在DR的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用，從炎癥角度可能為DR開發(fā)新的診斷和治療策略提供重要價(jià)值。

VEGF信號(hào)在眼部病理性血管生成中起關(guān)鍵作用，VEGF被認(rèn)為是介導(dǎo)DR病理生理改變的重要因素[11-12]。而Ang-1是形成成熟血管所必需的，其可通過(guò)結(jié)合內(nèi)皮特異性受體酪氨酸激酶2起作用，降低內(nèi)皮細(xì)胞通透性，并調(diào)節(jié)VEGF的效應(yīng)，維持內(nèi)皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13]。有研究顯示，VEGF/VEGFR2在調(diào)節(jié)DR的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，VEGF通過(guò)與VEGFR2的高親和力結(jié)合并誘導(dǎo)VEGFR2的磷酸化而發(fā)揮促血管生成活性；阻斷VEGF-VEGFR2及其下游ERK1/2和p38信號(hào)通路，可以抑制視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞血管生成[14]。Kang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高糖刺激導(dǎo)致糖尿病眼視網(wǎng)膜組織中VEGF、VEGFR2水平及Ang-1、Ang-2等促血管生成蛋白持續(xù)升高，表明高血糖會(huì)損害視網(wǎng)膜血管，這可能會(huì)引起視網(wǎng)膜血管營(yíng)養(yǎng)不良，視網(wǎng)膜細(xì)胞損傷，導(dǎo)致缺血性視網(wǎng)膜病變。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，DR組大鼠血清視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均顯著升高，以上結(jié)果與高糖刺激小鼠視網(wǎng)膜組織中觀察到的結(jié)果一致，提示VEGF、VEGFR2和Ang-1高表達(dá)可導(dǎo)致DR的發(fā)生。

PTF可以降低2型糖尿病大鼠的血糖，并能通過(guò)調(diào)控β-arrestin-2介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能改善胰島素抵抗和血脂紊亂[16]。有研究顯示，PTF能促進(jìn)骨骼肌細(xì)胞和脂肪細(xì)胞葡萄糖攝取和利用，降低2型糖尿病大鼠血漿IL-6和骨骼肌組織SOCS-3水平，改善其胰島素敏感性，具有潛在的抗糖尿病作用[17]。另有研究發(fā)現(xiàn)，蒲黃花粉(TP)可用于治療眼底出血；而蒲黃花粉多糖(TPP)治療可通過(guò)抑制炎癥反應(yīng)和改善血液循環(huán)改善DR[18]。本研究發(fā)現(xiàn)，各實(shí)驗(yàn)組大鼠精神有改善，皮毛略有光澤，行動(dòng)較DR組敏捷。與DR組相比，實(shí)驗(yàn)B組和實(shí)驗(yàn)C組大鼠空腹血糖均有下降，視網(wǎng)膜病理變化均有不同程度的改善；且大鼠血清中IL-6、TNF-α含量、視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的蛋白及mRNA表達(dá)水平均降低，提示中、高劑量蒲黃提取物可有效改善DR大鼠空腹血糖及視網(wǎng)膜病理變化，可能是通過(guò)降低炎性細(xì)胞因子和視網(wǎng)膜組織VEGF、VEGFR2和Ang-1的表達(dá)起到保護(hù)作用。

綜上所述，蒲黃提取物可下調(diào)DR大鼠炎癥水平及VEGF、VEGFR2和Ang-1的表達(dá)，從而改善視網(wǎng)膜組織病變。因此，蒲黃提取物在DR的治療和改善預(yù)后具有重要的臨床意義。