王文杰,葛 雷,張樹山,吳彩風,戴建軍,張德福

(上海市農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所,上海農(nóng)業(yè)遺傳育種重點實驗室動物遺傳工程研究室,上海201106)

自玻璃化冷凍保存技術(shù)在小鼠8 細胞期胚胎成功應(yīng)用以來[1],因其方便、快捷和高效,得到了飛速發(fā)展,使哺乳動物種質(zhì)資源保存成為現(xiàn)實。該技術(shù)在牛羊等家畜的胚胎冷凍中應(yīng)用成熟,并在實際生產(chǎn)中得到了商業(yè)化應(yīng)用[2]。由于豬的胚胎對低溫非常敏感,容易受到低溫損傷,導致其冷凍保存研究進展仍比較緩慢。我國直到2005年才成功獲得豬胚胎超低溫冷凍保存后代[3],但相關(guān)技術(shù)離實際生產(chǎn)應(yīng)用仍有一定差距,需進一步對冷凍保護劑和冷凍方法進行優(yōu)化。凍后氧化應(yīng)激和細胞凋亡被認為是影響胚胎進一步發(fā)育的主要因素[4-5]。線粒體是細胞內(nèi)極其重要的細胞器,是ATP 的主要供給來源。研究表明,冷凍可破壞卵母細胞或胚胎內(nèi)的線粒體結(jié)構(gòu),造成線粒體功能障礙,直接影響其體外發(fā)育能力[6-8]。MitoQ是一種新型線粒體靶向抗氧化劑,可降低線粒體受到的氧化損傷。在人類精子冷凍保存中,劉麗等[9]發(fā)現(xiàn)MitoQ 能夠明顯降低精子氧化損傷,并顯著提高其抗凍能力。本試驗在豬卵母細胞體外成熟、胚胎培養(yǎng)及玻璃化冷凍與解凍過程中全程添加200 nmol∕L MitoQ,通過檢測其線粒體膜電位、氧化應(yīng)激水平、凋亡狀態(tài)、發(fā)育能力和相關(guān)基因表達水平,探究MitoQ 對豬孤雌激活囊胚冷凍保存的影響。

1 材料與方法

1.1 化學試劑

本研究所用常規(guī)生化試劑除特殊說明外均購自美國Sigma 公司,培養(yǎng)液購自美國Gibco 公司,培養(yǎng)所用耗材購于丹麥Nunc 公司。

1.2 卵母細胞的采集和體外成熟

從上海嘉定五豐屠宰場采集豬新鮮卵巢,保存于含200 IU∕mL 雙抗的37 ℃生理鹽水中,2 h 內(nèi)運回實驗室。抽取卵巢表面直徑為2—6 mm 的卵泡液,靜置15 min 后于顯微鏡下挑選結(jié)構(gòu)完整、胞質(zhì)均勻的卵母細胞復合體(Cumulus-oocyte complexes,COCs),用TCM-199 清洗3 次,每60 枚COCs 置于500 μL 體外成熟培養(yǎng)液中培養(yǎng)44 h。體外成熟培養(yǎng)液由TCM-199 加10%豬卵泡液(實驗室自制)、10 IU∕mL孕馬血清促性腺激素(寧波第三激素制品有限公司)、10%胎牛血清、10 IU∕mL 雙抗、0.1 mg∕mL 的L-半胱氨酸和10 ng∕mL 表皮生長因子組成。培養(yǎng)條件為38.5 ℃、5% CO2及飽和濕度。試驗組成熟過程中添加MitoQ,其終濃度為200 nmol∕L,對照組不添加MitoQ。

1.3 卵母細胞孤雌激活及體外培養(yǎng)

成熟培養(yǎng)44 h 后的COCs 用0.1%透明質(zhì)酸酶消化以去除顆粒細胞,TCM-199 洗滌3 次后,選擇形態(tài)均一且排出第一極體的成熟卵母細胞進行孤雌激活。使用電激活液(50 μmol∕L CaCl2、0.3 mol∕L 甘露醇和0.1 mmol∕L MgCl2)洗滌卵母細胞3 次,移入電激活槽,電激活參數(shù)為1.2 kV∕cm、30 μs、1 次激活。激活后的卵母細胞經(jīng)PZM-3 清洗3 次后置于38.5 ℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)7 d。試驗組培養(yǎng)液(PZM-3)中添加終濃度為200 nmol∕L 的MitoQ,對照組不添加MitoQ。

1.4 囊胚玻璃化冷凍解凍

囊胚的冷凍與解凍均在38.5 ℃熱臺上進行,將培養(yǎng)所得囊胚在冷凍平衡液(PZM-3 含7.5% EG、7.5% DMSO、20% FBS)中處理3—5 min,轉(zhuǎn)移至冷凍保護液(PZM-3 含15% EG、15% DMSO、20% FBS、0.4 mol∕L 蔗糖)中處理15 s,之后用OPS 管裝載,迅速投入液氮中保存。解凍時,將OPS 管從液氮中取出,迅速置于解凍I 液(含0.5 mmol∕L 蔗糖的培養(yǎng)液)中,吹出囊胚,處理3—5 min 后轉(zhuǎn)移至解凍II 液(含0.25 mmol∕L 蔗糖的培養(yǎng)液)中繼續(xù)作用3—5 min,之后囊胚用PZM-3 洗滌3 次,并在PZM-3 中培養(yǎng)24 h備用。MitoQ 處理組解凍囊胚在含有200 nmol∕L MitoQ 的PZM-3 中培養(yǎng),對照組培養(yǎng)液中不含MitoQ。

1.5 線粒體膜電位檢測

線粒體膜電位ΔΨm用JC-1 試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行檢測。囊胚在JC-1 染液(含800 μL TCM-199 和200 μL 5×染色液緩沖液)中38.5 ℃條件下避光孵育20 min,4 ℃染色緩沖液洗3 次,置于共聚焦顯微鏡(LSCM,Nikon,日本)下觀察拍照。使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分別記錄綠色和紅色熒光信號強度,每個囊胚紅色(RITC)和綠色(FITC)熒光強度的比值即為ΔΨm。每組重復3 次,每次約20 枚囊胚。

1.6 Pan-Caspase 染色

Pan-Caspase 原位熒光染色采用美國Promega 公司試劑盒進行染色。將FITC-VAD-FMK 用TCM-199按照1∶500 稀釋配成染色液,處理好的囊胚置于染色液中孵育20 min,PZM-3 洗3 次,熒光顯微鏡下觀察拍照。用Image-Pro Plus 6.0 軟件統(tǒng)計分析熒光強度值。每組重復3 次,每次約20 枚囊胚。

1.7 TUNEL 凋亡染色

用一步法TUNEL 檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行細胞凋亡檢測。解凍好的囊胚在4%多聚甲醛中固定1 h,在含有0.1% Triton X-100 的PBS 中冰浴2 min,之后移入50 μL TUNEL 檢測液(2 μL TdT 酶+ 48 μL 熒光標記液)中37 ℃避光孵育1 h。在5 μg∕mL 的Hoechst 33342 染色液中避光孵育10 min進行細胞核染色,PBS 洗3 次后置于載玻片上壓片,顯微鏡下觀察。記錄囊胚細胞數(shù)和凋亡細胞數(shù)。每組重復3 次,每次約20 枚囊胚。

1.8 活性氧檢測

用活性氧檢測試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)檢測活性氧水平。處理好的囊胚移入含有10 μmol∕L DCFH-DA 的TCM-199 中,37 ℃作用20 min。清洗3 次后于熒光顯微鏡下觀察拍照,Image-Pro Plus 6.0 分析熒光強度。每組重復3 次,每次約20 枚囊胚。

1.9 脂質(zhì)氧化檢測

脂質(zhì)氧化(MDA)水平采用試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)進行檢測。處理好的囊胚加入150 μL 細胞裂解液,待裂解后,1600g離心10 min,取100 μL 上清,加入200 μL MDA 檢測工作液,混勻,沸水浴15 min,冷卻至室溫,1000g離心10 min。取200 μL 上清于96 孔板中,532 nm 下測定吸光度。MDA 濃度值以nmol∕mg 表示。每組重復3 次,每次約60 枚囊胚。

1.10 凋亡相關(guān)基因表達

用一步法cDNA 提取試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)提取試驗組和對照組囊胚(各120 枚)cDNA。引物信息參見表1,用SYBR GreenⅠ進行熒光定量Real-time PCR。PCR 體系為:1 μL cDNA 模板,0.4 μL Forward Primer(10 μmol∕L),0.4 μL Reverse Primer(10 μmol∕L),10 μL 2 × TransStart Top Green qPCR SuperMix,8.2 μL ddH2O;PCR 程序為:94 ℃30 s;94 ℃5 s,60 ℃(參照各引物最佳退火溫度而定)30 s,45個循環(huán);95 ℃10 s,65 ℃60 s,97 ℃15 s;37 ℃5 min。所有樣品均3 次重復。相對表達量采用2-ΔΔCt法計算比較。

表1 qRT-PCR 所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR

1.11 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS 13.0 軟件進行Student’st-test 處理。結(jié)果以“平均數(shù)±標準誤”表示,以P＜0.05 為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MitoQ 添加對豬卵母細胞孤雌激活囊胚線粒體膜電位和凋亡水平的影響

紅色熒光與綠色熒光比值為線粒體膜電位,橙色熒光強度越高表明線粒體膜電位越高。由圖1 可知,MitoQ 處理組線粒體膜電位(0.83)相比對照組(0.52)顯著升高。

熒光強度越高表示Pan-Caspase 活性越高。MitoQ 組凍后囊胚總Caspase 凋亡蛋白熒光強度值(20.65)相比對照組(42.47)顯著下降(圖2)。TUNEL 凋亡檢測結(jié)果顯示,MitoQ 組囊胚中細胞的凋亡比例(22.36%)顯著低于對照組(36.42%)。

圖1 囊胚線粒體膜電位Fig.1 Mitochondrial membrane potential of vitrified blastocysts

2.2 MitoQ 添加對豬卵母細胞孤雌激活囊胚氧化應(yīng)激水平的影響

ROS 含量越高,綠色熒光強度越強。如圖3 所示,添加MitoQ 處理囊胚的ROS 水平(26.32)相比對照組(35.70)顯著下降。凍后MitoQ 處理囊胚MDA 含量(37.64 nmol∕L)與對照組(49.83 nmol∕L)相比亦顯著降低。

圖2 囊胚總Caspase 活性Fig.2 Pan-Caspase activities of vitrified blastocysts

圖3 囊胚活性氧水平Fig.3 Effect of ROS level of vitrified blastocysts

2.3 線粒體功能和凋亡相關(guān)基因表達

如圖4 所示,凍后添加MitoQ 處理的卵母細胞與對照組卵母細胞相比,線粒體氧化應(yīng)激相關(guān)基因CuZnSOD相對表達量顯著提升;線粒體功能相關(guān)基因(DNM1、MFN2)相對表達量也顯著提升;凋亡相關(guān)基因TNF-α、Bax相對表達量顯著下降,Bcl-2 相對表達量顯著升高。

圖4 MitoQ 對豬孤雌激活囊胚冷凍后相關(guān)基因表達的影響Fig.4 Effect of MitoQ related gene expression in vitrified blastocysts

3 討論

氧化應(yīng)激和細胞凋亡是影響凍后細胞損傷的重要因素。細胞內(nèi)ROS 水平增加可使細胞產(chǎn)生氧化應(yīng)激,造成線粒體功能損傷,激活細胞凋亡[10-11]。本試驗表明,200 nmol∕L MitoQ 處理孤雌激活囊胚,解凍后顯著降低了胚胎的ROS 水平,提高了線粒體膜電位值,說明MitoQ 能降低冷凍對細胞的氧化應(yīng)激,改善線粒體功能。這與陳亞寧等[12]將白藜蘆醇作為抗氧化劑在豬孤雌激活囊胚抗凍研究中結(jié)果一致,也與明少鵬等[13]用MitoQ 在大鼠海馬神經(jīng)元中改善線粒體功能的研究結(jié)果相符。

細胞受到冷凍損傷后會引起細胞內(nèi)ROS 含量升高,誘發(fā)氧化應(yīng)激[14],而氧化應(yīng)激會使細胞產(chǎn)生過量的脂質(zhì)過氧化物MDA,破壞細胞的生物膜活性,誘導大分子氧化變性,抑制蛋白質(zhì)功能,誘發(fā)細胞凋亡[15]。本試驗表明,冷凍豬孤雌激活囊胚后添加200 nmol∕L MitoQ 能夠明顯降低囊胚的MDA 水平,并減少凍后囊胚中的細胞凋亡比例。該結(jié)果與Mitchell 等[16]用MitoQ 在腎臟低溫保存中降低細胞氧化應(yīng)激結(jié)果類似,說明MitoQ 能夠緩解豬孤雌激活囊胚冷凍后的氧化損傷,并通過降低MDA 水平減少細胞凋亡的發(fā)生比例,從而提高其抗凍能力。

哺乳動物卵母細胞和早期胚胎在發(fā)育中最重要的凋亡途徑為線粒體介導的凋亡途徑和死亡受體介導的細胞凋亡途徑[17]。TNF-α參與了死亡受體介導的細胞凋亡途徑[18],MFN2、DNM1、Bcl-2、CuZnSOD和Bax則參與了線粒體介導的凋亡途徑[19]。本試驗中,添加200 nmol∕L MitoQ 的凍后豬孤雌激活囊胚與對照組相比,促凋亡相關(guān)基因Bax、TNF-α表達水平顯著降低,抑制凋亡相關(guān)基因Bcl-2、CuZnSOD顯著升高,表明MitoQ 能夠降低細胞凍后凋亡水平,這與Niu 等[20]在豬卵母細胞冷凍研究中的結(jié)果相符。MitoQ添加后TNF-α表達水平降低,表明死亡受體介導的細胞凋亡途徑可能參與了MitoQ 對孤雌激活囊胚抗凍能力的調(diào)節(jié);CuZnSOD表達水平的提高表明MitoQ 可引起囊胚內(nèi)源性抗氧化物質(zhì)的增加,從而提高MFN2、DNM1 的表達水平,改善凍后胚胎的線粒體功能,有效降低線粒體介導的細胞凋亡水平。該結(jié)果與霍甜甜等[23]用線粒體靶向抗氧化肽SS31 在小鼠神經(jīng)研究中的結(jié)果相符。本研究結(jié)果初步表明了MitoQ能同時通過改善囊胚細胞內(nèi)死亡受體介導的和線粒體介導的凋亡水平,提高胚胎的抗凍能力。

綜上所述,200 nmol∕L MitoQ 處理豬孤雌激活囊胚,冷凍后能緩解其細胞氧化損傷,提高其線粒體功能,從而達到降低細胞凋亡水平、提高胚胎抗凍能力的效果。