周 瑞,陳舜勝

(上海海洋大學(xué)食品學(xué)院,上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心,上海201306)

膠原蛋白又稱(chēng)膠原(Collagen),是很多動(dòng)物體內(nèi)含量最豐富、分布最廣的一種糖蛋白[1],約占體內(nèi)蛋白質(zhì)總量的25%—30%,作為一種緊密有序的細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix,ECM)[2],它是由三個(gè)多肽鏈扭曲在一起形成三螺旋結(jié)構(gòu)[3](圖1)。目前,已知的膠原蛋白類(lèi)型達(dá)到了29 種[4],其中Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型是最主要類(lèi)型[5]。Ⅰ型主要在骨骼、真皮、肌腱、韌帶、角膜中,占全部膠原蛋白含量的90%左右,在日常生活中最為常見(jiàn)[6];II 型主要在軟骨組織中;III 型在肺、肝、脾臟中,目前在水產(chǎn)品中尚未發(fā)現(xiàn)。

豬、牛皮骨中提取的膠原蛋白因?yàn)榀偱２?BSE)、口蹄疫(FMD)等牲畜疾病的暴發(fā),引起了人們對(duì)膠原蛋白來(lái)源的擔(dān)憂(yōu),從魚(yú)皮、魚(yú)鱗等水產(chǎn)品副產(chǎn)物提取的膠原蛋白成為一個(gè)很好的代替來(lái)源[7]。研究魚(yú)皮膠原蛋白并加工利用,可以提高魚(yú)類(lèi)加工的附加值,同時(shí)達(dá)到保護(hù)環(huán)境的效果。

圖1 膠原蛋白的三螺旋結(jié)構(gòu)[3]Fig.1 Triple-helical structure of collagen[3]

1 魚(yú)皮膠原蛋白的制備

魚(yú)皮膠原蛋白的制備過(guò)程包括除雜、除脂、除雜蛋白,膠原蛋白析出、純化等。

1.1 魚(yú)皮的預(yù)處理

魚(yú)皮中的其他物質(zhì)會(huì)影響膠原提取率和膠原純度,需對(duì)魚(yú)皮進(jìn)行預(yù)處理。步驟一般為:去除雜質(zhì)、蒸餾水沖洗→將魚(yú)皮剪成一定規(guī)格→加入0.1 mol∕L NaOH 或NaCl 溶液攪拌浸泡24 h(除去魚(yú)皮的色素、肌原纖維等非膠原蛋白,同時(shí)使魚(yú)皮軟化)→加入10%有機(jī)試劑攪拌浸泡24 h(除去脂肪)[1]。使用NaOH浸泡還可達(dá)到殺菌除酶,精制膠原蛋白的效果[8]。

1.2 魚(yú)皮膠原蛋白的提取

提取膠原蛋白的原理是把膠原蛋白從其他成分中分離出來(lái)。通常是依據(jù)膠原蛋白的特性,采用物理-機(jī)械方法或加入某種化學(xué)試劑來(lái)改變魚(yú)皮膠原蛋白的存在環(huán)境,使膠原蛋白與其他成分分離并進(jìn)行提純達(dá)到提取效果。根據(jù)提取介質(zhì)的不同分為以下幾種。

1.2.1 熱水提取法

熱水提取法可提取水溶性膠原蛋白(Hot water-soluble collagen,HEC)。魚(yú)皮預(yù)處理后,用熱水直接提取膠原蛋白,溫度過(guò)高時(shí)膠原蛋白沒(méi)有明顯的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)、發(fā)生變性和交聯(lián);溫度過(guò)低則提取速率慢[9],常使用的溫度有100 ℃、60—70 ℃、40—42 ℃、45 ℃,熱水法得到的膠原蛋白被稱(chēng)為明膠(Gelatin)[10]。明膠不具備膠原蛋白初始功能,分子量遍布范圍廣,雜亂難確定,在食品領(lǐng)域制作膠凍食品價(jià)值較高。

郝淑賢等[11]用3 種提取方法提取羅非魚(yú)皮膠原蛋白,并比較不同方法提取的膠原蛋白理化特性,研究發(fā)現(xiàn)熱水提取法得到膠原凝膠強(qiáng)度較大。因此,可以根據(jù)需要,選用熱水法提取,使用試劑少,且凝膠強(qiáng)度大,為制作膠凍食品提供參考;Supatra 等[12]研究了不同提取溫度(45—75 ℃)對(duì)明膠的特性和凝膠性能的影響,發(fā)現(xiàn)55 ℃時(shí)提取的明膠凝膠強(qiáng)度最大,同時(shí)還發(fā)現(xiàn)溫度升高時(shí),明膠的顏色逐漸變淡,不同溫度得到的產(chǎn)物在掃描電子顯微鏡下顯示有所不同。溫度對(duì)于提取膠原蛋白的影響,通常是破壞膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu),進(jìn)而影響性質(zhì)。

1.2.2 酸提取法

酸提取法是提取酸溶性膠原蛋白(Acid-soluble collagen,ASC),利用低濃度酸溶液破壞Schiff 鍵和離子鍵,使沒(méi)有交聯(lián)的膠原蛋白和含有醛胺類(lèi)交聯(lián)鍵的膠原蛋白溶出。該方法對(duì)膠原蛋白的交聯(lián)鍵破壞程度小,保持膠原蛋白的結(jié)構(gòu)的完整,因此膠原蛋白中的β 和γ 大分子鏈較多,交聯(lián)程度高的成分較多。酸提取中使用的酸有甲酸、乙酸、乳酸和檸檬酸等,其中最常使用的為乙酸[13]。

劉焱等[14]用4 種方法從魚(yú)皮中提取膠原蛋白,提取率為酸法＞酶法＞堿法＞水法,其中傅里葉紅外光譜顯示除了堿法提取的膠原外均符合膠原特征吸收峰。陳麗麗等[15]用乙酸、乳酸、檸檬酸研究鮰魚(yú)皮膠原的提取工藝,顯示膠原蛋白提取率影響程度依次為乙酸＞乳酸＞檸檬酸,乙酸提取鮰魚(yú)皮膠原提取率達(dá)38.44%。Tan 等[16]用三種酸法提取膠原蛋白,顯示酸法提取和均質(zhì)化輔助酸法提取的凝膠性高于酸輔酶提取,均質(zhì)化輔助酸法提取可以應(yīng)用于工業(yè)上提高膠原蛋白得率。淑英等[17]以鱈魚(yú)魚(yú)皮作為研究材料,考察不同酸類(lèi)型、酸濃度、提取時(shí)間及料液比對(duì)膠原蛋白提取率的影響,應(yīng)用響應(yīng)面法得到優(yōu)化提取工藝?？偟膩?lái)說(shuō),酸的濃度、種類(lèi)、提取時(shí)間和料液比均是提取過(guò)程中影響提取率的因素。

1.2.3 堿提取法

堿提取法是利用強(qiáng)堿或強(qiáng)堿鹽將膠原蛋白肽鍵水解,最終得到膠原蛋白。膠原蛋白三股螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,酰胺鍵水解斷裂,會(huì)徹底破壞含硫和含羥基的半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸,甚至?xí)a(chǎn)生有致癌、致畸和致突變作用的D 型氨基酸。

Yoshimura 等[18]提取堿溶性膠原蛋白,用含有10% NaCl 的0.5 mol∕L NaOH 在4 ℃下提取20—30 d,提取的膠原大部分由α1 和α2 鏈組成。顧楊娟[19]提取魚(yú)膠原蛋白,采用酸法、堿法、酶法3 種方法,得出采用酶法提取出的膠原蛋白提取率最高,而堿法提取膠原蛋白的提取率低、凍力小。

1.2.4 酶提取法

酶提法從魚(yú)皮中提取酶溶性膠原蛋白(Pepsin-solubilized collagen,PSC),是利用蛋白酶選擇性的切除非螺旋的肽端而不影響三螺旋結(jié)構(gòu)的情況下分離出膠原蛋白,常用的酶有胃蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、無(wú)花果蛋白酶、堿性蛋白酶和復(fù)合蛋白酶等[13]。

Liu 等[20]、Kaewdang 等[21]證明用蛋白酶提取的膠原蛋白三螺旋結(jié)構(gòu)是完整的;Woo 等[22]對(duì)黃鰭金槍魚(yú)背皮提取膠原的條件進(jìn)行優(yōu)化,確定了最佳酶解條件為加入0.98%(W∕V)胃蛋白酶浸提23.5 h;Tao等[23]用響應(yīng)面法優(yōu)化金槍魚(yú)皮膠原蛋白提取,提取條件影響程度依次為料液比＞酶量＞提取時(shí)間;張培等[24]研究了從金槍魚(yú)內(nèi)臟中提取的酶提取羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白的提取率小于使用胃蛋白酶的提取率,表明影響提取率的因素還包括酶的種類(lèi)。廖偉等[25]采用酶法提取尖吻鱸魚(yú)鱗和魚(yú)皮的膠原蛋白,每100 g魚(yú)皮和魚(yú)鱗的膠原蛋白提取量分別為47.3 g、2.3 g,結(jié)果顯示魚(yú)皮相對(duì)魚(yú)鱗是更好的膠原蛋白來(lái)源。酶的作用受溫度影響,當(dāng)溫度過(guò)低時(shí)提取速率慢,過(guò)高時(shí)酶失活或膠原變性[8],有研究顯示多種酶的使用也會(huì)提高提取效果?？偟膩?lái)說(shuō),影響提取效果的因素不僅與膠原蛋白來(lái)源有關(guān),也與所使酶的種類(lèi)、料液比、酶量、提取時(shí)間有關(guān)。

1.2.5 復(fù)合提取法

許多學(xué)者在實(shí)際提取膠原蛋白時(shí),為了提高膠原蛋白提取率、提高提取速度或者保留膠原的某種特性同時(shí)簡(jiǎn)化提取過(guò)程等,采用多種方法復(fù)合提取,如酸酶復(fù)合法、酶與熱水復(fù)合法、酶酶復(fù)合法等,也會(huì)加入超聲波輔助提取(Ultrasonic-assisted extraction,UAE)、均質(zhì)化輔助提取(Homogenization)、擠壓等處理方法(表1)。

表1 魚(yú)皮膠原蛋白常用的復(fù)合提取技術(shù)Table 1 Commonly used composite extraction technology for fish skin collagen

1.2.6 常規(guī)提取方法的比較

表2 對(duì)比分析了魚(yú)皮膠原蛋白4 種常規(guī)提取方法的優(yōu)缺點(diǎn)。在膠原蛋白的提取中,酶提是比較有效的提取方法。在實(shí)際應(yīng)用過(guò)程中,根據(jù)所需產(chǎn)物特性要求,也會(huì)選擇相應(yīng)的提取方法,例如即食食品,更青睞熱水提取。

表2 魚(yú)皮膠原蛋白不同提取方法的比較Table 2 Comparison of different extraction methods of fish skin collagen

1.3 魚(yú)皮膠原蛋白的分離純化

膠原蛋白屬于大分子蛋白,主要使用鹽析、透析、離心、電泳、色譜法和離子交換層析等方法達(dá)到分離純化目的[31]。鹽析是最簡(jiǎn)單、最常用的一種分離手段,鹽一般使用NaCl 或(NH4)2SO4,主要包括三種方式,即:加入NaCl 固體、加入高濃度的鹽溶液、用高濃度鹽溶液透析,通常在不同的等電點(diǎn)和不同的鹽濃度下膠原蛋白的溶解度不同,鹽析法可以實(shí)現(xiàn)不同類(lèi)型膠原蛋白的分離。因?yàn)辂}析得到的膠原蛋白純度不高和膠原蛋白的復(fù)雜性,一般一種方法達(dá)不到分離純化的效果,試驗(yàn)過(guò)程中需要進(jìn)一步采用離子交換、高效液相等色譜技術(shù)幾種方法聯(lián)合使用和達(dá)到分離純化,獲得精制膠原蛋白的目的[32]。根據(jù)所需產(chǎn)物的特性性質(zhì),選用特定的純化方法或者利用粗提取液制作產(chǎn)品。

1.4 魚(yú)皮膠原蛋白的脫腥

從豬、牛皮骨等中提取的陸生性膠原蛋白通常無(wú)異味,從魚(yú)皮、魚(yú)鱗中提取的膠原蛋白,因?yàn)轸~(yú)皮中攜帶的魚(yú)腥味以及提取過(guò)程(特別是酶解過(guò)程)較難控制,通常使提取液具有不良風(fēng)味,嚴(yán)重制約魚(yú)皮膠原蛋白在功能性食品方面的開(kāi)發(fā)及應(yīng)用[33],故在制備膠原蛋白提取液時(shí)需考慮脫腥,尤其是直接利用粗提液時(shí)。常用的脫腥方法包括物理、化學(xué)和生物三種方法[34],物理方法包括通過(guò)添加呈味物質(zhì)的掩蓋法、利用環(huán)糊精分子的環(huán)狀結(jié)構(gòu)的包埋法、利用活性炭等吸附劑的吸附法、微膠囊法和減壓蒸餾法等[35-36];化學(xué)方法包括酸堿處理法、有機(jī)溶劑處理、抗氧化劑法、臭氧處理法,利用乙醇、碳酸氫鈉、檸檬酸、茶葉中的茶多酚[37]等對(duì)原材料進(jìn)行浸泡去腥后提取,也有研究應(yīng)用美拉德反應(yīng)脫除酶解液腥味[38];生物方法是通過(guò)利用微生物本身新陳代謝產(chǎn)物的掩蓋作用或者使腥味物質(zhì)和微生物產(chǎn)生反應(yīng)生成無(wú)腥味物質(zhì)來(lái)達(dá)到脫腥效果[39]。經(jīng)過(guò)脫腥效果得到酶提液、酸提液、水提液等粗提液。根據(jù)所需產(chǎn)物特性進(jìn)行相應(yīng)處理,尤其在利用魚(yú)皮副產(chǎn)物提取膠原蛋白制作魚(yú)凍等可食用食品時(shí),采用無(wú)害快速有效的去腥方法是值得研究的一個(gè)問(wèn)題。

2 膠原蛋白在食品中的應(yīng)用

在食品領(lǐng)域,膠原蛋白具有低免疫原性、成膜性好、良好生物相容性等,使膠原蛋白在保健食品、食品添加劑、食品包裝中得到很好的應(yīng)用。

2.1 膠原蛋白在保健食品中的應(yīng)用

補(bǔ)鈣,增強(qiáng)鈣吸收能力。膠原蛋白中含有賴(lài)氨酸、苯丙氨酸、異亮氨酸和組氨酸等必需的氨基酸,其中膠原蛋白特征氨基酸羥脯氨酸有將血漿中的鈣運(yùn)輸?shù)焦羌?xì)胞的作用,羥脯氨酸越多,鈣的補(bǔ)充速度越快。Mizuno 等[40]研究發(fā)現(xiàn),骨髓細(xì)胞是多能細(xì)胞,骨髓細(xì)胞在I 型膠原蛋白凝膠培養(yǎng)時(shí),顯示出較高的活性,說(shuō)明I 型膠原蛋白能誘導(dǎo)骨髓細(xì)胞成骨細(xì)胞分化。Yuan 等[41]研究了用酶水解得到膠原蛋白之后,發(fā)現(xiàn)膠原蛋白具有高的鈣結(jié)合性,主要是因?yàn)榘被牡汪然难跏荂a2+的主要結(jié)合位點(diǎn)。

預(yù)防疾病,增強(qiáng)免疫力。王毅虎等[42]給小鼠喂食膠原粉30 d 后對(duì)其進(jìn)行測(cè)試,結(jié)果表明,所用的膠原粉能顯著提高小鼠的免疫力。耿黎明等[43]把高膽固醇患者分成2 組,每組60 人,分別口服膠原蛋白和辛伐他汀,結(jié)果表明,膠原蛋白能輔助提高藥物降血脂的作用。并可補(bǔ)充體內(nèi)某些缺乏的必需微量元素,從而使其維持在一個(gè)相對(duì)正常的范圍內(nèi),是一種理想的減肥降血脂食品[44]。此外,Rafat[45]開(kāi)發(fā)了膠原蛋白-殼聚糖復(fù)合水凝膠作為角膜植入,研究顯示膠原蛋白能夠提高角膜上皮細(xì)胞的修復(fù)能力和加速細(xì)胞生長(zhǎng)。膠原蛋白還有加速血紅蛋白和紅細(xì)胞生成的功能,改善循環(huán),有利于防治冠心病、缺血性腦病[44]。

在其他特殊保健方面。尹利端等[46]研究表明,膠原蛋白有很強(qiáng)的皮膚鎖水功能,且對(duì)人體健康無(wú)害;膠原蛋白還具有抑制胃酸和胃原酶的分泌,減輕由胃酸分泌過(guò)多帶來(lái)的不適[47],減輕胃潰瘍患者的疼痛感,促進(jìn)胃潰瘍愈合[48]。據(jù)報(bào)道,膠原蛋白可協(xié)助機(jī)體排出鋁元素,減少鋁在體內(nèi)的聚積,從而降低某些疾病(如老年癡呆癥)的發(fā)生概率[49]。

2.2 膠原蛋白在食品添加劑中的應(yīng)用

膠原蛋白作為食品添加劑,既能提高食品的品質(zhì),又能補(bǔ)充部分氨基酸(表3)。除了添加少量膠原蛋白,還可使用膠原蛋白提取液制作食品。如李江明等[50]將羅非魚(yú)魚(yú)鱗膠原蛋白提取液與菠蘿果汁混合,得到了一種營(yíng)養(yǎng)豐富的膠原蛋白果味飲料。易翠平等[51]以鳡魚(yú)副產(chǎn)物為原料,采用提取、調(diào)味、成型等工藝開(kāi)發(fā)出營(yíng)養(yǎng)與風(fēng)味俱佳的魚(yú)凍產(chǎn)品。

表3 膠原蛋白在食品添加劑中的應(yīng)用Table 3 Application of collagen in food additives

2.3 膠原蛋白在食品包裝中的應(yīng)用

膠原蛋白材料具有很強(qiáng)的韌性和優(yōu)良的成膜能力,用做香腸、肉類(lèi)、魚(yú)類(lèi)等的包裝材料。明膠制成的生物降解膜(可食包裝膜)擁有很好的性能,可以用于保鮮、食品包裝或直接食用,典型的可食膜是人工腸衣[58],膠原腸衣和肉制品收縮率一致且能固定化酶用于改善食品風(fēng)味和質(zhì)量。Fadini 等[59]用水解膠原蛋白和可可油在蔗糖塑化條件下制備的可食包裝膜,高濃度的水解膠原蛋白產(chǎn)生的薄膜使得更加均勻,起良好的包裝作用。樊世芳等[60]混合明膠、殼聚糖、蛋白肽后制成膜涂在鯽魚(yú)魚(yú)片表面,顯示這種涂膜劑能延長(zhǎng)魚(yú)片在4 ℃環(huán)境下冷藏的貨架期,因?yàn)槟z原包裝時(shí)很好的阻氣、阻油、阻濕等良好特性,減少氧化反應(yīng)的產(chǎn)生和抑制美拉德反應(yīng)。

3 結(jié)論與展望

制備膠原蛋白過(guò)程中,不同提取方法具有不同提取效果,得到的膠原蛋白也存在特性差異。熱水提取法所得膠原凝膠特性最好;酶法提取效果最佳,采用此法提取膠原蛋白成為近幾年的研究熱點(diǎn),不過(guò)酶切位點(diǎn)的不確定性是研究的難點(diǎn)。在研究中也不斷涌現(xiàn)新型提取工藝,多種常規(guī)方法復(fù)合、超聲波輔助等。另外,膠原蛋白因其特性應(yīng)用十分廣泛,有很高的研究?jī)r(jià)值,但在市場(chǎng)上有不少商家夸大膠原蛋白功效借機(jī)謀取暴利。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn),從魚(yú)皮中提取的膠原蛋白應(yīng)用在食品中有腥味,對(duì)熱敏感,加熱時(shí)易發(fā)生熱變性,三螺旋結(jié)構(gòu)被破壞,其特性隨之改變。

因此,膠原蛋白的未來(lái)研究可著眼于以下6個(gè)方面:(1)提高膠原蛋白的應(yīng)用潛力,明確膠原蛋白對(duì)人體的功效及產(chǎn)生功效的機(jī)理,從人體細(xì)胞學(xué)、代謝組學(xué)和預(yù)防醫(yī)學(xué)的角度入手,致力于研發(fā)出魚(yú)皮等副產(chǎn)物的高性?xún)r(jià)比產(chǎn)品;(2)目前,膠原蛋白的稱(chēng)謂界定不明確,同時(shí)膠原蛋白的提取過(guò)程、提取率計(jì)算有待標(biāo)準(zhǔn)化,從參考文獻(xiàn)看出,不同計(jì)算方法下的提取率不具備可比性;(3)提高魚(yú)皮膠原蛋白提取分離純化技術(shù)和減短提取時(shí)間,增加產(chǎn)量,深入研究膠原蛋白肽,基于水產(chǎn)品膠原蛋白熱穩(wěn)定差的研究基礎(chǔ)上,如何增加保護(hù)機(jī)制,減少溫度的限制;(5)在提取魚(yú)皮膠原蛋白過(guò)程中,建立對(duì)提取液有效脫腥的方法;(6)完善膠原蛋白結(jié)構(gòu)指紋圖譜,為膠原蛋白生產(chǎn)提供有效依據(jù)。