郭小紅，馮靖雯，張小瓊，尤 強，陳鴻平，劉友平*

1.成都中醫(yī)藥大學藥學院，西南特色中藥資源國家重點實驗室，四川 成都 611137

2.重慶市中醫(yī)院，重慶 400021

鬧羊花為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅Rhododendron molle(Blume) G.Don.的干燥花，始載于《神農本草經(jīng)》，有大毒，羊食時躑躅而死，故以此為名[1]。其具有祛風除濕、散瘀定痛的功效，自古廣泛應用于風濕痹癥[2-3]。但與此同時其“毒性”問題也備受關注。鬧羊花毒性劇烈，安全窗較窄，有效劑量接近中毒劑量，導致臨床中毒事件屢有發(fā)生，極大地限制了其臨床應用及深度開發(fā)。因此，在確保臨床藥效前提下，提出有效的減毒策略，成為目前研究的關鍵。

中藥炮制技術可降低鬧羊花毒性。鬧羊花在古代多炮制入藥，最早可追溯到東晉《肘后備急方》[4]：“清酒二斗漬之”“苦酒漬藥一宿”，《本草綱目》[5]也有記載“賊風走皮中淫淫痛……酒蒸為末”“酒拌蒸一炊久”。然而，現(xiàn)今無論是國家標準還是地方標準，均未收錄鬧羊花炮制品。鬧羊花作為《中國藥典》2020年版[2]10 種“大毒”中藥材之一，是唯一一味無炮制規(guī)格的可供內服的“大毒”中藥材，古代炮制方法均未得到較好的傳承和發(fā)展?！吨袊褡逅幣谥平?jīng)驗集成》[6]收錄了鬧羊花酒蒸、炒2種炮制方法，并明確其炮制作用為“生品有毒，蒸、炒可降低毒性”，然而對其炮制“減毒”作用，目前尚缺乏科學依據(jù)，亦未見文獻報道。

現(xiàn)代研究表明，鬧羊花主要成分為二萜類、黃酮類、三萜類、木脂素類，其中二萜類成分為該藥材特征性成分，該類成分具有強烈毒性，同時也是藥效成分，具有雙重生理作用，低劑量表現(xiàn)為抗炎、鎮(zhèn)痛、免疫抑制、降血壓等藥理作用，高劑量表現(xiàn)為對神經(jīng)系統(tǒng)、臟器系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)的毒性[7]。對毒性成分也是藥效成分的鬧羊花而言，炮制減毒技術是降低其毒性的主要目的，但不是唯一目的，在降低毒性的同時保存較高的療效才是最終目標[8]。因此，本研究以古籍記載的炮制方法為依據(jù)“遵古炮制”，采用“外觀性狀-化學成分-毒性-藥效”多角度評價模式，分析鬧羊花炮制前后及不同炮制品的差異，以篩選最佳“減毒存效”的輔料及炮制方法，為后期鬧羊花減毒存效機制、炮制工藝、質量標準等研究奠定理論依據(jù)，以期為臨床提供“低毒高效”的鬧羊花炮制品種，保障臨床用藥安全有效。

1 材料

1.1 儀器

Thermo Ultimate 3000 液相色譜儀、Coron Veo RS 電霧式檢測器（賽默飛世爾科技有限公司）；BN3000 型萬分之一電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；CP2000 型十萬分子一電子天平（德國Sartorius 公司）；HX-200k 型高速粉碎機（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；UPTUO-I-1000TE 優(yōu)普系列超純水機（成都純水科技有限公司）；DHG-9245A型電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）；SG8200HDT 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；Waters C18色譜柱（Sysmmetry ShieldTMRP18，250 mm×4.6 mm，5 μm）；CM-5 型分光測色儀（日本柯尼卡美能達公司）；實驗用鼠耳打孔器（澤雅科教有限公司）。

1.2 試藥

鬧羊花藥材（批號20200103）購自湖北富饒農業(yè)藥用植物繁育基地，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學中藥資源與鑒定系嚴鑄云教授鑒定為杜鵑花科杜鵑屬植物羊躑躅R.molle(Blume) G.Don.的干燥花。甲醇（色譜純，美國MTEDIA 有限公司），甲醇（分析純，成都市科龍化工試劑廠），實驗用水為超純水，醋、黃酒購自永輝超市。鬧羊花毒素 III 對照品（批號11984-201901）、鬧羊花毒素 II 對照品（批號11983-201901）購自中國食品藥品檢定研究院（質量分數(shù)≥98%），鬧羊花毒素V 對照品（批號DS7190922）購自德思特生物有限公司（質量分數(shù)≥98%）。

1.3 動物

SPF 級昆明種小鼠356 只，雌雄各半，4～6 周齡，體質量18～22 g，購自湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，動物許可證號SCXK（湘）2019-0004。動物飼養(yǎng)溫度為（20.0±0.5）℃，濕度（55±5）%。本研究嚴格按照中華人民共和國科技部《動物實驗管理條例》的要求進行。動物實驗規(guī)程經(jīng)重慶市中醫(yī)院動物實驗倫理委員會批準（批準號為2019KY-GXH）。

2 方法與結果

2.1 鬧羊花不同炮制品的制備

根據(jù)古籍記載“遵古炮制”，具體炮制方法見表1。

表1 鬧羊花生品及其炮制品信息Table 1 Information of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.2 鬧羊花生品及不同炮制品顏色比較

2.2.1 肉眼觀察 采用相機（佳能 Canon IXUS285HS）對不同樣品進行拍攝，見圖1。結果可見，鬧羊花生品為灰黃色，經(jīng)炮制后均變?yōu)樽睾稚放c炮制品的顏色差別較大，易區(qū)分，不同炮制品之間的顏色差異不明顯。

圖1 鬧羊花生品及其炮制品肉眼觀察比較Fig.1 Comparison of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos by naked eye observation

2.2.2 顏色的測定 采用分光測色儀對鬧羊花生品及其炮制品的顏色指標進行測量并記錄。測量條件：光源D65；標準觀察角度是10°；照明口徑Ф30 mm；照明系統(tǒng)鏡面反射。L*代表明亮度，L*越大，明亮度越大，反之越小；a*代表紅綠色度，＋a*為紅色方向，反之為綠色方向，＋a*越大，則顏色越紅，反之則顏色越綠；b*代表黃藍色度，＋b*為黃色方向，反之為藍色方向，＋b*越大，則顏色越黃，反之則顏色越藍[6]。

取鬧羊花生品及不同炮制品，粉碎，過2 號篩，取適量粉末放入色差儀粉末測試盒測定，見圖2。結果表明，鬧羊花炮制前后粉末的顏色存在較大差異，以L*（亮度值）變化最大，其次是b*（黃度值）；不同炮制品（S2～S4）之間顏色無明顯差異。

2.3 鬧羊花毒素II、III、V 的含量測定

2.3.1 混合對照品溶液的制備 分別精密稱取鬧羊花毒素II、鬧羊花毒素III、鬧羊花毒素V 對照品適量，加甲醇溶解，制成質量濃度分別為860.09、670.06、310.03 μg/mL 的混合對照品溶液。

圖2 鬧羊花生品及其炮制品顏色測定 (空間法)Fig.2 Determination of color of Rhododendri Mollis Flos raw product and its processed products (spatial method)

2.3.2 供試品溶液的制備 精密稱取鬧羊花藥材粉末（過4 號篩）2.0 g，置于具塞錐形瓶中，精密加入80%甲醇20 mL，浸泡20 min，稱定質量，超聲提取1 h，放冷，再稱定質量，用80%甲醇補足，過0.22 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 色譜條件 Waters C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），甲醇（A）-流動相水（B）梯度洗脫：0～10 min，20%～30% A；10～30 min，30%～40% A；30～50 min，40%～50% A。體積流量0.8 mL/min；柱溫35℃；進樣量20 μL；電噴霧檢測器以氮氣為載氣，霧化溫度35 ℃，功能參數(shù)PF（power function）為1.0，采集頻率10 Hz，過濾常數(shù)3.6。本實驗條件下所測的3種成分與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5 與其他組分分離完全，拖尾因子在0.95～1.05，理論塔板數(shù)大于6000，色譜系統(tǒng)適用性實驗符合含量測定要求?；旌蠈φ掌啡芤?、供試品溶液（S1～S4）的色譜圖見圖3。

圖3 鬧羊花生品及其炮制品的HPLC-CAD 圖譜Fig.3 HPLC-CAD chromatograms of raw product and processed products of Rhododendri Mollis Flos

2.3.4 線性關系考察 精密吸取混合對照品溶液0.5、1.0、2.0、2.5、4.0、5.0 mL 分別置5 mL 量瓶中，用80%甲醇稀釋定容至刻度，搖勻，即得；分別精密吸取上述混合對照品溶液各20 μL 進樣，測定，以進樣質量濃度（μg/mL）為橫坐標（X），以峰面積為縱坐標（Y），繪制標準曲線，結果見表2，r均大于0.999 5，表明3 種被測成分在各自線性范圍內呈良好線性關系。

2.3.5 方法學考察 取同一批鬧羊花的供試品（S1），制備供試品溶液，進樣測定，分別進行精密度試驗、重復性試驗、穩(wěn)定性試驗，計算各色譜峰的相對峰面積與相對保留時間。結果顯示各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的RSD 均小于3%，表明方法精密度及重復性良好，且供試品溶液在24 h 內穩(wěn)定，符合含量測定要求。

2.3.6 樣品測定 精密稱取鬧羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4），按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，分別精密吸取20 μL，按“2.3.3”項下色譜條件測定，計算樣品含量，見表3。結果表明，經(jīng)炮制后3 種成分的含量均有所降低，總量順序為生品（0.340%）＞清蒸（0.181%）＞酒蒸（0.178%）＞醋蒸（0.154%），其中醋蒸品降低了約50%。鬧羊花毒素III 以醋蒸品降低最多，鬧羊花毒素V 以酒蒸品降低最多，鬧羊花毒素II 以醋蒸品降低最多。

表2 線性關系考察Table 2 Linear relationship investigation

表3 指標性成分含量測定結果 (n=3)Table 3 Determination results of index components content (n=3)

2.4 鬧羊花生品及其不同炮制品的急性毒性評價

2.4.1 供試藥的制備 分別取鬧羊花生品（S1）及不同炮制品（S2～S4）各20 g，加25 倍量的60%乙醇，加熱回流提取2 次，每次1 h，濾過，合并濾液，50 ℃減壓濃縮至50 mL，冷藏備用。上述各樣品臨用前用CMC-Na 溶液稀釋成所需濃度。

2.4.2 急性毒性預試驗 參照《中藥、天然藥物急性毒性研究技術指導原則》[7]進行急性毒性實驗，觀察各組藥物的毒性反應，測定致死劑量。采用少量動物探索劑量范圍，取小鼠16 只，體質量23～27 g，雌雄各半，隨機分成鬧羊花生品組、清蒸組、酒蒸組、醋蒸組4 組，相鄰組間劑量比為0.5，ig給藥，每次給藥容量為0.02 mL/g，得出各炮制品的0～100%致死量（Dn～Dm）。

2.4.3 急性毒性正式實驗 根據(jù)Dm（生品為4.0 g/kg，炮制品均為6.0 g/kg）和Dn（生品為1.3 g/kg，炮制品均為1.8 g/kg），每個藥物設置5 個劑量，相鄰組間劑量比為0.75。取200 只小鼠，雌雄各半，隨機分為鬧羊花生品組、清蒸組、酒蒸組、醋蒸組，各組再分為5 個不同劑量組，每組10 只。給藥前小鼠禁食不禁水，次日各組小鼠分別ig 相應劑量藥物，給藥體積為20 μL/g。給藥后觀察每組小鼠的中毒癥狀、生存狀態(tài)，連續(xù)觀察14 d，記錄各組小鼠的毒性反應出現(xiàn)時間、死亡時間、死亡數(shù)量。

2.4.4 急性毒性結果 從ig 后5 min，各組小鼠均出現(xiàn)不同程度的中毒癥狀，表現(xiàn)為出汗、腹瀉、口吐白沫、運動不協(xié)調、呼吸急促、痙攣、僵直、大小便失禁等，抽搐，直至死亡，死亡時間集中在給藥后2 h 內。解剖死亡小鼠可見肺部有不同程度水腫，胃脹、部分腸管充盈，心肌肥大，肝臟發(fā)黑。根據(jù)各組小鼠死亡數(shù)計算出死亡率，見表4。半數(shù)致死量（median lethal dose，LD50）是判斷中藥有無毒性及毒性大小的依據(jù)，毒性與LD50呈負相關，一般認為大毒中藥LD50＜5 g/kg，有毒中藥LD50介于5～15 g/kg，采用Bliss法計算LD50及LD50的95%可信限，見表5。急性毒性結果表明，鬧羊花經(jīng)炮制后急性毒性均有所降低，尤以醋蒸品毒性最低，LD50的大小順序為醋蒸＞酒蒸＞清蒸＞生品。

2.5 鬧羊花生品及其不同炮制品的抗炎作用評價

2.5.1 分組及給藥 取140 只小鼠，體質量28～32 g，雌雄各半，隨機分為14 組，分別為模型組，陽性對照組（雷公藤多苷片120 mg/kg），鬧羊花生品及其炮制品（清蒸、酒蒸、醋蒸）的高、中、低劑量（1200、600、300 mg/kg）組，每組10 只，各劑量設置參考人的臨床給藥量及小鼠的LD50。各組小鼠ig 相應劑量的藥物，模型組小鼠ig 等體積純水，給藥體積均為0.2 mL/10 g，1 次/d，連續(xù)7 d。

2.5.2 小鼠耳腫脹抑制率的測定 末次給藥60 min后，在小鼠單側耳朵（右耳）的前后兩面涂抹30 μL二甲苯致炎，干預30 min 后沿耳廓基線剪下雙耳，用直徑8 mm 的打孔器分別在兩耳片同一部位（沿耳緣）打孔，置于天平精密稱質量。計算小鼠耳腫脹度、耳腫脹抑制率[8]。

腫脹度＝右耳質量－左耳質量

腫脹抑制率＝(模型組腫脹度－給藥組腫脹度)/模型組腫脹度

表4 各組小鼠死亡率比較Table 4 Comparison of mortality rates of mice in each group

表5 LD50 測定及毒性分級Table 5 Determination of LD50 and toxicity classification

2.5.3 抗炎作用結果 鬧羊花炮制前后對二甲苯致炎模型小鼠都有很好的抗炎作用，尤以生品抗炎作用最強，抗炎作用強度為生品高劑量組（73.25%）＞生品中劑量組（58.39%）＞酒蒸高劑量組（49.63%）＞醋蒸高劑量組（42.48%）＞清蒸高劑量組（40.56%），炮制后抗炎藥效均有所降低，但相較模型組，各炮制組高劑量均有明顯抗炎作用（P＜0.05、0.01），起到了很好的炮制“存效”目的。結果見表6。

3 討論

近年來報道多例鬧羊花中毒事件[9-13]，引起社會輿論熱點，當務之急是如何在中醫(yī)藥理論指導下降低用藥風險，減少毒性事件發(fā)生。中藥炮制技術可降低鬧羊花的毒性，經(jīng)課題組前期鬧羊花炮制歷史沿革考證，古代方書中鬧羊花多經(jīng)炮制后入藥，所采用的炮制輔料以酒、醋為主流，故本研究選取酒、醋為輔料。本研究在挖掘古籍的基礎上，采取“遵古炮制”制備鬧羊花的不同炮制品，古籍中關于鬧羊花的輔料用量和潤藥時間的記載不明，只簡單提及“拌勻”“拌令濕潤”[14-15]，即指適量的輔料以拌勻潤透為宜。關于鬧羊花蒸制時間為“一炊久”，如宋代《集驗方》[16]“如炊一斗米許頃”；《普濟方》[17]“酒拌蒸一炊久”，并一直延續(xù)到明代《本草綱目》[5]“酒拌蒸一炊久”。經(jīng)考證，古代“一炊久”就是做一頓晚飯所用時間，大致在0.5～1.0 h。《中國民族藥炮制集成》[6]記載“酒蒸：取鬧羊花用酒噴濕后，拌勻，蒸半個小時，取出，曬干”，可見古今描述基本一致。因此，本研究“遵古炮制”：取鬧羊花100 g，輔料用量45 g 拌勻潤透，置于蒸籠中隔水蒸0.5 h，取出，50 ℃烘干，即得。

表6 各組小鼠耳腫脹抑制率Table 6 Inhibitory rates of ear swelling of mice in each group

據(jù)報道二萜類成分是鬧羊花的毒效物質，鬧羊花毒素II、III、V 是其二萜類代表性成分[18-21]，課題組前期采用HPLC-CAD 法建立了鬧羊花中鬧羊花毒素II、III、V 的含量測定方法。本研究在此基礎上，采用該方法測定鬧羊花生品及其不同炮制品含量差異，結果表明經(jīng)炮制后毒性指標性成分含量明顯降低，但是3 種炮制品的差異不明顯，可見炮制輔料醋、酒對3 種成分影響較小，成分含量降低的原因可能是受加熱過程的影響。參考其他物質基礎為萜類的毒性中藥炮制機制，芫花經(jīng)醋制后毒性成分二萜原酸酯類成分發(fā)生酯鍵水解而含量降低[22]，甘遂經(jīng)醋制后毒性成分巨大戟二醇型二萜類酯鍵水解而含量降低[23]；川楝子中毒性成分三萜類成分炒制加熱過程中發(fā)生醚環(huán)開環(huán)或酯鍵水解反應進一步裂解導致其含量降低[24]。鬧羊花中毒性成分二萜類含量降低也可能發(fā)生了化學成分轉化，但反應機制有待進一步研究。

采取小鼠急性毒性實驗測定致死率和LD50，探討減毒效果，結果發(fā)現(xiàn)鬧羊花炮制后LD50明顯升高，表明臨床使用安全性提高，達到了“減毒”的目的，尤以醋制為優(yōu)，這可能跟輔料醋本身藥效作用有關。醋，性溫，味酸、苦，具有引藥入肝、活血止痛、降低毒性、緩和藥性的作用，毒性中藥大戟、甘遂、芫花等醋制后降低了毒性又緩和了浚泄作用[25]。鬧羊花毒性成分也是主要有效成分，“減毒”的同時更大的“存效”才是炮制的目的，因此進一步采用小鼠耳腫脹實驗評價鬧羊花炮制的“存效”作用，結果表明鬧羊花生品和炮制品均能很好地抑制二甲苯所致小鼠耳腫脹，具有很好的抗炎作用，起到了炮制“存效”目的，尤以酒制為優(yōu)，可能與輔料酒的協(xié)同作用有關。酒，性大熱，能宣通血脈、御寒氣、行藥勢，可治療風濕痹痛，引導藥物作用到達治療部位，用于制藥能起到協(xié)同作用，增強療效，如當歸、川芎、白芍、白花蛇舌草等活血化瘀藥多酒制[26]。

綜上所述，本研究通過綜合分析鬧羊花炮制前后的性狀、指標性成分、毒性、藥效之間的關系，發(fā)現(xiàn)鬧羊花經(jīng)炮制后（清蒸、酒蒸、醋蒸）均能達到“減毒存效”的目的，“減毒”效果以醋制為優(yōu)，“存效（抗炎）”效果以酒制為優(yōu)，為臨床用藥炮制品的選擇提供了科學依據(jù)。同時，本研究構建了以“外觀性狀-化學成分-毒性-藥效”多角度聯(lián)合評價，為毒性中藥飲片新型質量評價模式提供研究思路。本研究仍存在一些不足，毒性成分變化僅選取了3個代表性成分進行定量測定，炮制前后全面化學信息有待進一步分析，炮制“減毒存效”機制尚不明確。因此，課題組已展開了鬧羊花炮制的物質基礎及作用機制的系統(tǒng)研究，以闡釋其“炮制減毒”的科學內涵。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突