高 耀，王 鵬，許 騰，武文澤，向 歡，韓雨梅，田俊生*，秦雪梅*

1.山西大學(xué) 中醫(yī)藥現(xiàn)代研究中心，山西 太原 030006

2.山西大學(xué)體育學(xué)院，山西 太原 030006

逍遙散源于宋代《太平惠民和劑局方》，由柴胡、當(dāng)歸、茯苓、白芍、炒白術(shù)、炙甘草、薄荷、生姜組成，具有疏肝解郁、養(yǎng)血健脾的功效。在治療抑郁癥方面，逍遙散因其符合整體調(diào)節(jié)、辨證論治、個(gè)體化診療等特點(diǎn)，顯示了獨(dú)特的理論優(yōu)勢(shì)和豐富的科學(xué)內(nèi)涵優(yōu)越性[1-3]。逍遙散能夠通過調(diào)節(jié)抑郁癥患者和抑郁動(dòng)物模型機(jī)體異常代謝物水平，從而發(fā)揮抗抑郁作用[4-22]。課題組前期基于慢性不可預(yù)知溫和刺激（chronic unpredicted mild stress，CUMS）抑郁大鼠模型的內(nèi)源性代謝物變化探討了抑郁癥的發(fā)病機(jī)制，從神經(jīng)遞質(zhì)、神經(jīng)營養(yǎng)素、下丘腦-垂體-腎上腺軸、氨基酸、脂質(zhì)和能量代謝、炎癥因子等方面對(duì)逍遙散抗抑郁的作用機(jī)制進(jìn)行分析，歸納總結(jié)了逍遙散抗抑郁的代謝網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制[23-26]。隨著代謝組學(xué)技術(shù)不斷發(fā)展，不同生物樣本的逍遙散抗抑郁作用代謝物數(shù)據(jù)得到充分的積累。因此，借助“大數(shù)據(jù)”理念對(duì)已有的特征代謝物進(jìn)行綜合分析，對(duì)深入挖掘和闡釋逍遙散抗抑郁的作用機(jī)制有重要意義。

本研究從CUMS 動(dòng)物的血液、尿液、海馬、肝臟、盲腸、糞便和臨床患者的血漿、尿液等生物樣本中逍遙散具有顯著調(diào)節(jié)作用的差異代謝物進(jìn)行代謝特征綜合分析，并歸納總結(jié)逍遙散在不同生物樣本中調(diào)節(jié)的關(guān)鍵差異代謝物和代謝通路，以期為深入闡釋逍遙散抗抑郁在代謝層次的作用機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑

血清素（serotonin）購自日本TCI 有限公司；γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid）購自阿拉丁公司；L-谷氨酸（L-glutamic acid）購自生工生物工程股份有限公司公司；去甲腎上腺素（norepinephrine）購自中國食品藥品檢定研究院；多巴胺（dopamine）、5-羥基吲哚乙酸（5-hydroxyindoleacetic acid）購自博飛美科公司。

1.2 儀器

1290Ⅱ超高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；3200 QTRAP 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國AB Sciex 公司）；Acquity UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美國Waters 公司）；Neofuge 13R 高速冷凍離心機(jī)（力康生物醫(yī)療科技控股有限公司）。

2 方法

2.1 逍遙散代謝組學(xué)的信息收集與歸納分析

采用“抑郁”“抑郁癥”“長期突觸性抑郁”“逍遙”“逍遙散”關(guān)鍵詞組合對(duì)PubMed、Cochrane Library、Embase、Web of Science、PsycINFO、中國知網(wǎng)、萬方等數(shù)據(jù)庫進(jìn)行搜索查詢，時(shí)間截止為2020年1月1日。同時(shí)通過抑郁癥代謝數(shù)據(jù)庫進(jìn)行查詢和補(bǔ)充[27]，通過反復(fù)核對(duì)，整理逍遙散抗抑郁的代謝組學(xué)文獻(xiàn)共19 篇，如表1所示。梳理不同生物樣本在多個(gè)不同平臺(tái)的代謝組學(xué)數(shù)據(jù)，為后續(xù)逍遙散回調(diào)差異代謝物的分析和代謝通路的富集提供數(shù)據(jù)支撐。

表1 逍遙散抗抑郁代謝組學(xué)文獻(xiàn)信息Table 1 Information on antidepressant metabonomics of Xiaoyao San

2.2 逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析

逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析是指在逍遙散抗抑郁的代謝組學(xué)文獻(xiàn)整理的基礎(chǔ)上，對(duì)逍遙散回調(diào)差異代謝物和代謝通路進(jìn)行分析，具體包括差異代謝物數(shù)量的比較分析、差異代謝物變化趨勢(shì)的統(tǒng)計(jì)分析、差異代謝物的驗(yàn)證分析和差異代謝物的功能分析。其中，差異代謝物變化趨勢(shì)的統(tǒng)計(jì)分析采用vote-counting 方法確定上調(diào)或下調(diào)的差異代謝物，并對(duì)原始文獻(xiàn)中上調(diào)和下調(diào)的差異代謝物進(jìn)行計(jì)數(shù)[27]。對(duì)逍遙散回調(diào)差異代謝物進(jìn)行驗(yàn)證分析，差異代謝物的功能分析采用Omicsolution 軟件進(jìn)行代謝物途徑的分析，并篩選符合標(biāo)準(zhǔn)（P＜0.05）的通路。

2.3 逍遙散抗抑郁差異代謝物的驗(yàn)證分析

采用課題組前期建立的測(cè)定大鼠血清中神經(jīng)遞質(zhì)水平的方法[28]，通過超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UHPLC-MS/MS）測(cè)定CUMS 大鼠血清樣品。

2.4 統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間比較采用單因素方差分析，采用Graphpad prism 5 軟件繪圖。

3 結(jié)果

3.1 差異代謝物數(shù)量的比較分析

如圖1-A 所示，逍遙散對(duì)中樞和外周不同生物樣本回調(diào)的部分差異代謝物相同。如表2所示，逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠血液和尿液共有的差異代謝物有4 個(gè)，分別是棕櫚酸（palmitic acid）、甘氨酸（glycine）、N-乙酰糖蛋白（N-acetyl glycoprotein）和丙酮酸（pyruvic acid）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠血液和肝臟組織共有的差異代謝物有4 個(gè)，分別是L-異亮氨酸（L-isoleucine）、肌酸（creatine）、β-D-葡萄糖（β-D-glucose）、和L-纈氨酸（L-valine）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠尿液和肝臟組織共有的差異代謝物有2 個(gè)，分別是檸檬酸（citric acid）和酮戊二酸（oxoglutaric acid）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠海馬和肝組織共有的差異代謝物有1 個(gè)，為L-賴氨酸（L-lysine）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠尿液和海馬組織共有的差異代謝物有1 個(gè)，為?；撬幔╰aurine）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠血液、尿液和肝臟組織共有的差異代謝物有 2 個(gè)，分別為L-色氨酸（L-tryptophan）和L-酪氨酸（L-tyrosine）；逍遙散回調(diào)CUMS 大鼠血液、海馬組織和肝臟組織共有的差異代謝物有3 個(gè)，分別為L-谷氨酸（L-glutamic acid）、L-乳酸（L-lactic acid）和L-谷氨酰胺（L-glutamine）。表明逍遙散可調(diào)節(jié)動(dòng)物不同生物樣本的相同差異代謝物發(fā)揮抗抑郁作用。

如圖1-B 所示，逍遙散對(duì)抑郁癥患者和CUMS動(dòng)物血液和尿液回調(diào)的部分差異代謝物相同。如表2所示，逍遙散對(duì)抑郁癥患者和CUMS 動(dòng)物血液回調(diào)的共有差異代謝物有7 個(gè)，分別是β-D-葡萄糖、膽堿（choline）、氧化三甲胺（trimethylamineN-oxide）、L-亮氨酸（L-leucine）、L-乳酸、L-丙氨酸（L-alanine）和甘氨酸；逍遙散對(duì)抑郁癥患者和CUMS 動(dòng)物尿液回調(diào)的共有差異代謝物7 個(gè)，分別是檸檬酸、L-苯丙氨酸（L-phenylalanine）、馬尿酸（hippuric acid）、?；撬?、酮戊二酸、肌酐（creatinine）和L-酪氨酸。逍遙散可能通過分別調(diào)節(jié)抑郁癥患者和CUMS 動(dòng)物血漿的7 個(gè)差異代謝物和尿液的7 個(gè)差異代謝物發(fā)揮抗抑郁作用。

圖1 逍遙散回調(diào)動(dòng)物中樞和外周中差異代謝物的韋恩圖 (A) 以及逍遙散回調(diào)患者、動(dòng)物血液和尿液中差異代謝物的韋恩圖 (B)Fig.1 Venn diagram of Xiaoyao San callback differential metabolites in central and peripheral of animals (A),Venn diagram of Xiaoyao San callback differential metabolites of blood and urine in patients and animals (B)

表2 逍遙散回調(diào)共有差異代謝物信息Table 2 Information of Xiaoyao San callback shared differential metabolites

3.2 差異代謝物變化趨勢(shì)的統(tǒng)計(jì)分析

通過對(duì)逍遙散回調(diào)差異代謝物進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在不同生物樣本中，逍遙散調(diào)節(jié)相同的差異代謝物。進(jìn)一步對(duì)回調(diào)差異代謝物進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)逍遙散調(diào)節(jié)34 個(gè)相同差異代謝物，如圖2所示，差異代謝物按頻數(shù)排序依次為乳酸（頻數(shù)＝7）、谷氨酸（頻數(shù)＝7）、丙氨酸（頻數(shù)＝6）、檸檬酸（頻數(shù)＝6）、酪氨酸（頻數(shù)＝6）、苯丙氨酸（頻數(shù)＝5）、膽堿（頻數(shù)＝5）、氧化三甲胺（頻數(shù)＝5）、谷氨酰胺（頻數(shù)＝5）、棕櫚酸（頻數(shù)＝5）。

圖2 逍遙散回調(diào)差異代謝物的矩陣氣泡圖Fig.2 Matrix bubble diagram of Xiaoyao San callback different metabolites

乳酸是報(bào)道次數(shù)最多的逍遙散回調(diào)差異代謝物，動(dòng)物ip 乳酸鈉（2 μg/kg）后，動(dòng)物活動(dòng)異常且活動(dòng)減少[29]。乳酸鈉可以急劇增加血液中的乳酸，同時(shí)增加大腦中的細(xì)胞外葡萄糖，葡萄糖是重要的能量代謝供應(yīng)物質(zhì)，逍遙散對(duì)CUMS 模型大鼠的能量代謝異常均有明顯的治療效果[30]。由此可見，這些調(diào)節(jié)的差異代謝物在逍遙散抗抑郁作用中發(fā)揮重要作用，可以為逍遙散抗抑郁療效標(biāo)志物的篩選和驗(yàn)證提供依據(jù)。

由于樣本來源、備樣方法、測(cè)試條件和數(shù)據(jù)采集等不同，不同類型的差異代謝物的變化趨勢(shì)也不完全相同。進(jìn)一步對(duì)不同差異代謝物的趨勢(shì)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)在34 個(gè)差異代謝物中，有11 個(gè)差異代謝物的變化趨勢(shì)一致。如圖3-A 所示，逍遙散上調(diào)的差異代謝物有7 個(gè)，分別為L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-纈氨酸、L-脯氨酸（L-proline）、L-異亮氨酸、吲哚乙酸（indoleacetic acid）和酮戊二酸；逍遙散下調(diào)的差異代謝物有4 個(gè)，分別為β-D-葡萄糖、α-D-葡萄糖（α-D-glucose）、高密度脂蛋白（high-density lipoprotein，HDL）和D-果糖（D-fructose）。其中，酮戊二酸和果糖為變化趨勢(shì)一致且報(bào)道次數(shù)最多的差異代謝物。此外，在34 個(gè)差異代謝物中，有23個(gè)差異代謝物的變化不完全一致，如圖3-B 所示，逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調(diào)數(shù)＞上調(diào)數(shù)）有10 個(gè)，分別為L-乳酸、L-丙氨酸、D-葡萄糖、甘氨酸、肌酸（creatine）、L-谷氨酰胺、膽堿、?；撬帷ⅠR尿酸和N-乙酰糖蛋白；逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調(diào)數(shù)＝上調(diào)數(shù)）有5 個(gè)，分別為L-酪氨酸、檸檬酸、L-絲氨酸（L-serine）、草酸（oxalic acid）和3-羥基丁酸（3-hydroxybutyric acid）；逍遙散在不同生物樣本中差異代謝物（下調(diào)數(shù)＜上調(diào)數(shù)）有8 個(gè)，分別為L-苯丙氨酸和琥珀酸（succinic acid）、丙酮酸、L-色氨酸和肌酐、L-谷氨酸、棕櫚酸和氧化三甲胺。

圖3 逍遙散回調(diào)差異代謝物的變化趨勢(shì)Fig.3 Histogram of Xiaoyao San callback different metabolites

3.3 差異代謝物的驗(yàn)證分析

如圖4所示，CUMS 造模28 d 后，與對(duì)照組比較，模型組大鼠血清中血清素、去甲腎上腺素和γ-氨基丁酸水平顯著降低（P＜0.001），5-羥基吲哚乙酸和L-谷氨酸水平顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，逍遙散組大鼠血清中血清素、去甲腎上腺素和γ-氨基丁酸水平顯著升高（P＜0.01、0.001），5-羥基吲哚乙酸和L-谷氨酸水平顯著降低（P＜0.001）。表明逍遙散能夠逆轉(zhuǎn)CUMS 引起的大鼠神經(jīng)遞質(zhì)的變化。

3.4 差異代謝物的功能分析

通過對(duì)差異代謝物通路進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)逍遙散調(diào)節(jié)通路有47 條，如圖5所示，分為能量代謝、神經(jīng)系統(tǒng)、氨基酸代謝、其他氨基酸代謝、物質(zhì)依賴性、輔助因子和維生素代謝、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等通路。其中能量代謝包含的通路有檸檬酸循環(huán)、丙酸代謝、半乳糖代謝、抗壞血酸和醛酸鹽代謝、戊糖磷酸途徑、硫代謝和氮代謝；神經(jīng)系統(tǒng)包含的通路有逆行內(nèi)源性大麻素信號(hào)、突觸小泡周期、谷氨酸能突觸、長期抑郁和膽堿能突觸。

4 討論

圖4 逍遙散對(duì)CUMS 大鼠血清中去甲腎上腺素 (A)、血清素 (B)、5-羥基吲哚乙酸 (C)、多巴胺 (D)、L-谷氨酸 (E) 和γ-氨基丁酸 (F) 水平的影響 (x s,n=8)Fig.4 Effect of Xiaoyao San on levels of norepinephrine (A),serotonin (B),5-hydroxyindoleacetic acid (C),dopamine (D),L-glutamic acid (E),and γ-aminobutyric acid (F) in serum of CUMS rats (x s,n=8)

圖5 逍遙散富集通路類點(diǎn)圖Fig.5 Dot plot diagram of Xiaoyao San enrichment pathway category

本研究對(duì)動(dòng)物的血液、尿液、海馬、肝臟、盲腸、糞便和臨床患者的血漿、尿液等生物樣本中逍遙散具有顯著調(diào)節(jié)作用的差異代謝物進(jìn)行代謝特征綜合分析，發(fā)現(xiàn)檸檬酸循環(huán)是逍遙散抗抑郁的重要通路之一。能量代謝障礙是抑郁癥病因之一，研究發(fā)現(xiàn)，脾虛及能量代謝障礙是抑郁癥發(fā)病的關(guān)鍵病機(jī)[31]；線粒體能量代謝障礙在抑郁癥發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮關(guān)鍵作用[32]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)逍遙散能夠治療抑郁癥核心癥狀即情緒低落，還能明顯改善患者疲勞癥狀[33]；逍遙散中多個(gè)成分可通過鈉鉀ATP酶α1 及ATP 合酶α、β、γ 亞基等靶點(diǎn)，調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)通路，從而發(fā)揮抗抑郁作用[34]。逍遙散能夠減少抑郁癥患者或CUMS 模型動(dòng)物耗能，調(diào)節(jié)三羧酸循環(huán)功能，從而全面使機(jī)體的能量代謝趨于正常狀態(tài)。

神經(jīng)遞質(zhì)通路是研發(fā)抗抑郁藥物的重要通路。CUMS 抑郁模型動(dòng)物中海馬組織中血清素水平顯著降低，以逍遙散干預(yù)后，血清素水平顯著升高[35]。逍遙散低極性分離組分對(duì)大鼠腦突觸體攝取血清素有明顯抑制作用[36]。去甲腎上腺素水平在CUMS抑郁大鼠腦組織和體液中顯著降低，逍遙散能夠顯著升高CUMS 抑郁大鼠腦組織和體液中去甲腎上腺素水平[35,37]，表明逍遙散可能通過抑制腦突觸體對(duì)去甲腎上腺素的重?cái)z取發(fā)揮抗抑郁作用。CUMS抑郁模型大鼠腦中谷氨酸水平顯著升高，N-甲基-D-天冬氨酸（N-methyl-D-aspartate，NMDA）受體表達(dá)水平顯著降低，NMDA 受體的過度激活，導(dǎo)致Ca2＋內(nèi)流引起神經(jīng)元凋亡；以逍遙散進(jìn)行干預(yù)后，NMDA 受體表達(dá)水平恢復(fù)至正常水平[38-39]。結(jié)果表明逍遙散可以通過調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)通路發(fā)揮抗抑郁作用。

目前許多研究中無法獲得原始數(shù)據(jù)代謝數(shù)據(jù)集或平均代謝物濃度[40]，本研究采用vote-counting方法對(duì)逍遙散調(diào)節(jié)差異代謝物進(jìn)行梳理[41-42]。傳統(tǒng)的代謝組學(xué)關(guān)注少量的差異代謝物，而抑郁癥是病因復(fù)雜的精神系統(tǒng)疾病，生物學(xué)功能的整合分析尤為重要，能夠通過整合來自多個(gè)來源的數(shù)據(jù)在同一個(gè)生物背景下進(jìn)行系統(tǒng)性分析，闡明逍遙散治療抑郁癥的機(jī)制[43-44]。因此，本研究采用多個(gè)差異代謝物相關(guān)的數(shù)據(jù)進(jìn)行富集。

逍遙散抗抑郁代謝特征綜合分析為逍遙散后續(xù)實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)提供系統(tǒng)分析，一些重要的差異代謝物及富集的代謝通路為深入研究逍遙散抗抑郁提供了方向。課題組后續(xù)將對(duì)本研究中發(fā)現(xiàn)的差異代謝物和代謝通路進(jìn)行驗(yàn)證，包括靶標(biāo)代謝組學(xué)驗(yàn)證，即以標(biāo)準(zhǔn)品為參照，對(duì)特定的差異代謝物群進(jìn)行有針對(duì)性地、特異性地檢測(cè)與定量分析；示蹤代謝組學(xué)驗(yàn)證，即以13C 或15N 等原子標(biāo)記的穩(wěn)定同位素示蹤輔助代謝組學(xué)技術(shù)研究抑郁癥的特有代謝通路以及逍遙散的回調(diào)機(jī)制[45-46]；功能代謝組學(xué)驗(yàn)證，采用分子生物學(xué)包括基因沉默或基因過表達(dá)等技術(shù)驗(yàn)證關(guān)鍵靶點(diǎn)[47-48]。抑郁癥的生物學(xué)過程不僅僅通過代謝水平變化闡明[49]。因此，課題組后續(xù)將整合蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)，進(jìn)行多組學(xué)技術(shù)的關(guān)聯(lián)分析，通過生物網(wǎng)絡(luò)與網(wǎng)絡(luò)藥理技術(shù)，采用網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵傩院湍K分析差異代謝物相關(guān)的一系列重要的“成分-靶點(diǎn)-代謝物-生物途徑”，闡明逍遙散與抑郁癥多成分、多靶點(diǎn)的科學(xué)內(nèi)涵。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)能量代謝和神經(jīng)遞質(zhì)通路是逍遙散發(fā)揮抗抑郁作用的主要通路，為系統(tǒng)挖掘逍遙散抗抑郁代謝機(jī)制提供依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突