李元鵬，張柳青，江 威，石 玉，郭燕妮，周 蕾,4，周永強(qiáng),4*，張運(yùn)林,4

1. 中國科學(xué)院南京地理與湖泊研究所，湖泊與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210008 2. 聊城大學(xué)環(huán)境與規(guī)劃學(xué)院，山東 聊城 252059 3. 淳安縣環(huán)境保護(hù)監(jiān)測站，浙江 淳安 311700 4. 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049

引 言

天然水生生態(tài)系統(tǒng)廣泛存在的溶解性有機(jī)物(dissolved organic matter,DOM)是全球最大的有機(jī)碳庫之一。有色可溶性有機(jī)物(chromophoric dissolved organic matter,CDOM)是DOM中能夠強(qiáng)烈吸收紫外輻射及藍(lán)光波段的那部分有機(jī)物，其組成結(jié)構(gòu)十分復(fù)雜[1-2]。目前國際上常用在254或350 nm處的吸收系數(shù)，亦即a254或a350來表征CDOM濃度； CDOM吸收光譜斜率S275-295及比紫外吸收SUVA254等值被廣泛用以表征CDOM芳香程度的高低，其中CDOM陸源芳香信號(hào)隨S275-295升高而降低，隨SUVA254升高而增強(qiáng)[2-4]。借助三維熒光光譜技術(shù)可獲得一系列有機(jī)物的熒光峰。平行因子分析法(parallel factor analysis,PARAFAC)可從重疊錯(cuò)交、種類繁多的熒光峰中提取出具有單一發(fā)射波長的若干個(gè)不同的熒光組分，用于探究CDOM來源及遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律[5]。微生物降解廣泛存在，在以往光降解的研究中很難徹底去除微生物降解的影響，加之DOM的生物可利用性與水體中重金屬、有機(jī)污染物等的遷移轉(zhuǎn)化息息相關(guān)，因此微生物降解對(duì)CDOM濃度和結(jié)構(gòu)的改變方式及其程度值得深入探究[6-7]。在一定時(shí)間內(nèi)(通常為28 d)能被微生物降解利用的那部分DOM被稱為生物可降解溶解性有機(jī)物(BDOM)。作為CDOM循環(huán)中的最活躍的參與部分，BDOM遷移轉(zhuǎn)化過程對(duì)碳循環(huán)過程及氣候變化的影響也具有一定的指示意義[8]。CDOM各熒光組分在微生物降解過程中的歸宿往往與湖泊的光學(xué)性質(zhì)、初級(jí)生產(chǎn)力高低、有機(jī)物結(jié)構(gòu)特征等多因素相關(guān)[9-10]。千島湖位于浙江省淳安縣(圖1)，是典型的深水型人工湖泊。該湖有機(jī)物來源相對(duì)簡單，同時(shí)，具有水下光化學(xué)條件較好、初級(jí)生產(chǎn)力較低的自身特點(diǎn)，探究該湖CDOM生物可利用性特征對(duì)掌握水源型湖泊有機(jī)物遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律具有一定指示意義[1-2]。

圖1 千島湖采樣點(diǎn)位置Fig.1 Location of sampling sites in Lake Qiandao

通過對(duì)比分析微生物培養(yǎng)前后CDOM光譜特征，試圖揭示該湖CDOM生物可利用性特征并指出對(duì)水源型湖泊有機(jī)物遷移轉(zhuǎn)化規(guī)律的指示意義； 同時(shí)，探究微生物活動(dòng)對(duì)熒光光譜在有機(jī)物估算及點(diǎn)源污染識(shí)別應(yīng)用中的影響。本研究對(duì)掌握清潔湖泊CDOM歸趨，以及微生物活動(dòng)對(duì)千島湖水質(zhì)監(jiān)測的影響具有重要的實(shí)際指導(dǎo)意義。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 樣品采集與微生物降解培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)

1.2 Chla和SDD的測定

葉綠素(chlorophyll-a,Chla)采用分光光度法予以測定，使用90%的熱乙醇提取葉綠素并使用島津公司生產(chǎn)的UV-2550(UV-Vis)的分光光度計(jì)測定665及775 nm處吸光度再經(jīng)換算得到Chla濃度，透明度(secchi disk depth,SDD)使用30 cm塞氏盤測定。

1.3 CDOM參數(shù)測定

1.3.1 樣品預(yù)處理及CDOM吸收光譜的測定

微生物降解培養(yǎng)前后的樣品在測量前均先使用0.22 μm孔徑Millipore濾膜過濾，再將濾后水置入儀器進(jìn)行檢測，獲得每個(gè)樣品培養(yǎng)前后CDOM的吸收光譜和熒光光譜。

CDOM的吸收光譜采用島津UV-2550 UV-Vis分光光度計(jì)測定，使用5 cm比色皿，以Milli-Q水為空白對(duì)照，在200～800 nm范圍內(nèi)每間隔1 nm測量CDOM的吸光度。為消除潛在散射效應(yīng)，扣除700 nm處吸光度，然后根據(jù)式(1)計(jì)算對(duì)應(yīng)波長的吸收系數(shù)

a(λ)=2.303D(λ)/r

(1)

式(1)中，a(λ)為CDOM在波長λ處對(duì)應(yīng)的吸收系數(shù)(m-1)；D(λ)為扣除700 nm處吸光度后在波長λ處的吸光度；r為光程路徑(m)。S275-295是由275～295nm波長范圍內(nèi)擬合得到的指數(shù)函數(shù)的光譜斜率。

1.3.2 三維熒光光譜測定及平行因子分析

采用F-7000型熒光光度計(jì)進(jìn)行樣品測定。拉曼散射校正，瑞利散射校正，內(nèi)濾波效應(yīng)方法參見文獻(xiàn)[1-2]。HIX的計(jì)算方法參見文獻(xiàn)[4]； 該指數(shù)越大CDOM腐殖化程度越高。采用MATLAB 2015b的drEEM工具箱(ver.0.2.0)進(jìn)行平行因子分析，共選取120個(gè)(培養(yǎng)前后各60個(gè))EEMs矩陣進(jìn)行運(yùn)算，最終確定3個(gè)組分模型能很好地通過對(duì)半檢驗(yàn)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS 23.0軟件計(jì)算平均值、標(biāo)準(zhǔn)差以及獨(dú)立樣本差異性顯著水平t檢驗(yàn)，使用ArcGIS 10.2進(jìn)行空間插值分析，其他統(tǒng)計(jì)圖使用Origin 20196進(jìn)行繪制。

2 結(jié)果與討論

2.1 平行因子分析所得熒光組分

經(jīng)平行因子分析獲得3種熒光組分，分別是C1(Ex: 255 nm，Em: 420 nm)為陸源類腐殖酸對(duì)應(yīng)于A峰； C2(Ex: 275 nm，Em: 340 nm)和C3(Ex: 230(295) nm，Em: 340 nm)為類色氨酸對(duì)應(yīng)T峰[2,5](圖2)。

2.2 水質(zhì)參數(shù)、CDOM各指標(biāo)培養(yǎng)前后平均值及其顯著性差異

千島湖Chla濃度平均值及標(biāo)準(zhǔn)差(4.53±0.18) μg·L-1，SDD平均值及標(biāo)準(zhǔn)差(4.7±1.2) m，該湖Chla濃度較低而透明度較高。經(jīng)微生物降解培養(yǎng)后，千島湖a254平均值顯著減小(t-test，p<0.01，剔除3個(gè)異常值)，由培養(yǎng)前(4.4±0.8) m-1降低至(3.8±0.9) m-1，以a254表征CDOM濃度，微生物降解的CDOM占比為14.3%±4.8%(范圍4.3%～23.6%)。微生物降解致使HIX顯著增大而S275-295值顯著減小(t-test，p<0.001)，說明微生物降解培養(yǎng)致使千島湖CDOM濃度降低芳香性升高； 三種熒光組分熒光強(qiáng)度平均值均顯著減小(t-test，p<0.001)，說明三種熒光組分均發(fā)生降解(表1)。

圖2 平行因子分析所得3個(gè)熒光組分光譜特征Fig.2 Spectral shape of the three fluorescent components identified using PARAFAC

表1 微生物降解培養(yǎng)前后各水質(zhì)參數(shù)、各組分熒光強(qiáng)度平均值及差異顯著性水平t檢驗(yàn)

2.3 CDOM光學(xué)參數(shù)的空間分布

結(jié)果表明微生物降解培養(yǎng)前a254及陸源類腐殖酸C1高值均主要集中在上游西北湖區(qū)。而類色氨酸C2高值主要集中在湖心區(qū)及東南湖區(qū)，類色氨酸C3主要集中在湖心區(qū)及西北湖區(qū)。Δa254為培養(yǎng)前后吸收系數(shù)差值，用以表征經(jīng)28 d微生物培養(yǎng)的CDOM生物可利用性高低。Δa254高值主要集中在東南湖區(qū)，說明東南湖區(qū)CDOM生物可利用性最高。用*a254表示經(jīng)28 d微生物降解培養(yǎng)后CDOM濃度，*C1，*C2和*C3表示培養(yǎng)后對(duì)應(yīng)的各熒光組分。*a254及陸源類腐殖酸*C1高值依然集中在西北湖區(qū)； 兩種類色氨酸組分C2和C3分布特征發(fā)生改變，湖心區(qū)C2和C3高值均消失，東南湖區(qū)C2高值亦消失； 經(jīng)生物培養(yǎng)后*C2和*C3分布特征與a254和*a254、陸源類腐殖酸C1和*C1均具有一致性，即高值主要分布在西北湖區(qū)(圖3)。

圖3 千島湖CDOM光學(xué)參數(shù)生物培養(yǎng)前后的空間分布Fig.3 Spatial distribution of optical parameters of CDOM in Lake Qiandao

2.4 微生物降解培養(yǎng)前后熒光光譜變化及各組分生物可利用性

結(jié)果表明微生物降解培養(yǎng)致使千島湖CDOM熒光信號(hào)發(fā)生明顯變化，培養(yǎng)前類色氨酸C2為主要的熒光信號(hào)，其次是陸源類腐殖酸C1，再次為類色氨酸C3[圖4(a)]； 培養(yǎng)后陸源類腐殖酸C1變?yōu)橹饕獰晒庑盘?hào)，其次為C2再次為C3[圖4(b)]。%ΔC1，%ΔC2和%ΔC3為各組分培養(yǎng)前后熒光強(qiáng)度差值占培養(yǎng)前各組分熒光強(qiáng)度比重，用以表示28 d生物降解培養(yǎng)后各熒光組分生物可利用性。微生物主要利用類色氨酸C2(%ΔC2平均值為54.1%±18.2%)和C3(%ΔC3平均值為53.2%±14.3%)，%ΔC2和%ΔC3平均值不存在顯著差異(t-test,p>0.05)，陸源類腐殖酸C1生物可利用性最低(%ΔC1平均值及標(biāo)準(zhǔn)差為28.2%±9.1%)[圖4(c)]。大部分站點(diǎn)三種熒光組分生物可利用性大于0，極少站點(diǎn)生物可利用性小于0，說明千島湖CDOM三種熒光組分均以降解為主，極少累積[圖4(c)]。

圖4 各熒光組分生物可利用性及生物培養(yǎng)后熒光強(qiáng)度變化Fig.4 Biologically lability of each fluorescent component after 28 days of biodegradation

2.5 微生物降解培養(yǎng)前后各熒光組分與a254相關(guān)性分析

微生物降解培養(yǎng)前陸源類腐殖酸C1(r2=0.91,p<0.01)和類色氨酸C3(r2=0.55,p<0.01)與a254均為顯著正相關(guān)，類色氨酸C2與a254無顯著相關(guān)性(p>0.05)。培養(yǎng)后陸源類腐殖酸*C1(r2=0.91,p<0.01)、類色氨酸*C2(r2=0.46,p<0.01)和類色氨酸*C3(r2=0.88,p<0.01)與*a254均為顯著正相關(guān)(圖5)。

圖5 28 d生物培養(yǎng)前后各組分熒光強(qiáng)度與a254相關(guān)性分析紅色圓形及綠色三角形分別表示生物培養(yǎng)前后各組分與a254相關(guān)性Fig.5 Relationships between the three PARAFAC-derived components and a254 pre- and post-28 days biodegradation

2.6 千島湖CDOM生物可利用性特征

本次研究表明類色氨酸C2和C3是千島湖BDOM主要的貢獻(xiàn)者。首先，C2和C3的生物可利用性平均值可達(dá)50%以上； 其次，a254能很好的評(píng)估湖泊的營養(yǎng)水平，基于光學(xué)原理獲取的CDOM光譜比較穩(wěn)定，a254能較好的表征水體中有機(jī)物濃度[12]； Δa254高值主要集中在東南湖區(qū)以及西北湖區(qū)，與類色氨酸C2及C3的空間分布具有一定相似性(圖3)。以往研究表明上游新安江是千島湖有機(jī)物的主要來源，湖心區(qū)及東南湖區(qū)類色氨酸大量賦存可能與淳安縣生活污水的點(diǎn)源排放有關(guān)； 此外，陸源類腐殖酸是千島湖主要的有機(jī)物組分，因而盡管C1生物可利用性相對(duì)低(28.2%±9.1%)，但陸源類腐殖酸C1對(duì)該湖BDOM的也具有較大貢獻(xiàn)[1,13]。部分研究指出類腐殖酸生物活性一般比較低，在生物降解過程中容易累積，尤其在營養(yǎng)程度較高，初級(jí)生產(chǎn)力較高的水體中類腐殖酸累積比較常見[8,14]。千島湖陸源類腐殖酸具有一定的生物活性； 這可能與其透明度高，受到光輻射影響顯著有關(guān)。以往研究表明光輻射可提高CDOM的生物可利用性，經(jīng)過光照預(yù)處理后CDOM的生物利用度提高且微生物產(chǎn)量提高[10]。光照可致使類腐殖酸分解為類蛋白等物質(zhì)[6]； 而微生物往往可快速地利用脂肪族，糖類、有機(jī)酸等[7,15]，這在一定程度上解釋了光照致使CDOM生物利用度提高的原因，然而光照能否直接提高類腐殖酸的生物利用性卻在很大程度上未知。Gan等發(fā)現(xiàn)中國東海長江口附近水域陸源類腐殖酸生物活性較高，并將該現(xiàn)象歸因于光輻射的影響[8]。馬瓊琳等的研究表明部分較難被生物利用的DOM經(jīng)光輻照后其生物活性提高[16]。由于各種組分的生物活性存在差異，微生物降解培養(yǎng)致使千島湖熒光光譜發(fā)生明顯的改變，主要表現(xiàn)為削弱類色氨酸C2(T峰)，保留類腐殖酸C1(A峰)。類色氨酸C2是千島湖主要的熒光信號(hào)，其生物可利用性較高，經(jīng)過生物培養(yǎng)后類色氨酸C2被大幅降解，陸源類腐殖酸C1的生物可利用性相對(duì)較低，因而得以保留(圖4)。以往的研究也表明類蛋白熒光組分可被微生物快速的降解，類腐殖酸對(duì)生物降解具有一定的抵抗性，降解相對(duì)緩慢[7,15]。生物培養(yǎng)致使A峰替代T峰成為主要的熒光信號(hào)，這從本質(zhì)上解釋了以往研究中生物降解致使HIX值增大，S275-295值減小的原因[17]。

本次研究結(jié)果表明在生物降解過程中很可能存在類蛋白組分的新生。首先，經(jīng)生物培養(yǎng)后類色氨酸C2和C3的高值區(qū)發(fā)生改變，生物培養(yǎng)前C2分布具有高度的空間異質(zhì)性主要集中在東南湖區(qū)及湖心區(qū)，C3高值主要分布在湖心區(qū)及西北湖區(qū)(圖3)。然而，經(jīng)過生物培養(yǎng)后C2和C3湖心區(qū)及東南湖區(qū)高值消失，高值主要集中在西北湖區(qū)，表現(xiàn)出與a254及C1相似的分布特征，這在微生物降解培養(yǎng)后類色氨酸C2和C3與a254具有很好的相關(guān)性得以進(jìn)一步驗(yàn)證(圖3和圖5)。這說明微生物在降解CDOM過程中可能會(huì)產(chǎn)生類色氨酸C2和C3，類色氨酸可能是類腐殖酸C1經(jīng)微生物降解的產(chǎn)物，也可能來自微生物的分泌。一般而言類蛋白往往能在較短的時(shí)間內(nèi)被微生物降解[7,15]； 然而，Kothawala等在3.5年黑暗環(huán)境中的長期生物培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)類腐殖酸發(fā)生一定程度的降解，而類蛋白類物質(zhì)卻未發(fā)生變化[18]。這一現(xiàn)象也在一定程度上說明微生物活動(dòng)過程中伴隨類腐殖酸的降解，可能會(huì)產(chǎn)生類色氨酸等蛋白質(zhì)。以往研究表明類色氨酸在生物培養(yǎng)過程中消耗和生產(chǎn)同時(shí)發(fā)生，類蛋白峰存在先升高后降低的趨勢[9]。千島湖東南湖區(qū)CDOM濃度較低，主要聚集類色氨酸C2，在培養(yǎng)過程中該部分有機(jī)物被迅速消耗，而西北湖區(qū)有機(jī)物濃度較高，陸源類腐殖酸降解速率較慢，因此，可能存在微生物在消耗C1過程中產(chǎn)生C2和C3，進(jìn)而使得C2和C3分布特征與C1相似。

2.7 CDOM微生物降解特征的環(huán)境指示意義

天然水體中的CDOM主要受光化學(xué)降解和微生物降解兩方面作用。以往研究發(fā)現(xiàn)從千島湖上游入湖口至下游大壩方向類腐殖酸占比降低而類蛋白占比升高，在該方向腐質(zhì)化程度逐步降低，這在一定程度上歸因于光化學(xué)降解的影響[13]。本次研究發(fā)現(xiàn)微生物活動(dòng)可大幅度降解類蛋白組分，使腐殖化程度升高亦即芳香信號(hào)增強(qiáng)。避光培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)可去除光化學(xué)降解的影響，Zhang等的研究表明9 d的自然光降解致使a254降低22%～34%，本次28 d微生物降解致使a254降低14.3%±4.8%，這說明在CDOM降解過程中光化學(xué)降解可能占據(jù)主導(dǎo)地位[6]。

水生生態(tài)系統(tǒng)的生物泵作用對(duì)碳循環(huán)的影響是近年來的熱點(diǎn)問題。CDOM的生物可利用性對(duì)揭示碳循環(huán)過程具有一定的指示意義。以往研究表明湖泊通常扮演著碳匯的角色[19]。本次研究可在一定程度上說明相比于富營養(yǎng)化湖泊，清潔湖泊的碳匯功能可能會(huì)被削弱。首先，研究表明初級(jí)生產(chǎn)力在碳的固定及礦化過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8,14]； 本次研究中千島湖Chla濃度較低，以往研究也發(fā)現(xiàn)在夏季藻類對(duì)該湖有機(jī)物的貢獻(xiàn)依然比較有限[2]，這說明清潔湖泊往往受營養(yǎng)鹽限制初級(jí)生產(chǎn)力較低，因而藻類所固定的碳相對(duì)較少。其次，較高的透明度使得大分子有機(jī)物發(fā)生降解，或直接使其生物活性提高，進(jìn)而提高微生物對(duì)有機(jī)物的利用量。再次，結(jié)果表明在水質(zhì)清潔的千島湖類色氨酸具有較高的生物可利用性，類腐殖酸也具有一定生物活性，且在生物培養(yǎng)過程中很少出現(xiàn)類腐殖酸的累積。以上微生物降解有機(jī)物過程中往往存在大量溫室氣體的釋放[19]。然而，值得指出的是千島湖作為深水湖泊，其蓄水量較大，換水周期較長； 上游新安江不斷輸入高濃度的有機(jī)物，因而該湖可能依然具有較強(qiáng)的碳匯作用[1,13]。

2.8 微生物降解對(duì)有機(jī)物估算的影響

以往研究表明，河流往往是內(nèi)陸湖泊有機(jī)物的主要來源，陸源類腐殖酸更適于有機(jī)物的估算[1,13]?；谇u湖CDOM特殊的生物可利用性，本次研究發(fā)現(xiàn)微生物降解對(duì)于陸源類腐殖酸組分估算CDOM的影響較小。首先，盡管陸源類腐殖酸可在一定程度上被微生物降解，然而經(jīng)培養(yǎng)后C1依然與a254具有很好的相關(guān)性(圖5)； 其次，微生物降解培養(yǎng)后對(duì)C2削弱，對(duì)C1保留，這也進(jìn)一步表明C1對(duì)有機(jī)物的估算能力受微生物降解的影響較小。Zhou等指出類色氨酸組分適于千島湖點(diǎn)源污染的識(shí)別[2]，本次研究發(fā)現(xiàn)微生物活動(dòng)可大量降解類色氨酸，微生物降解培養(yǎng)后類色氨酸C2與C1具有相似的分布特征(圖3)。因而，若在水滯留時(shí)間較長的枯水期，微生物降解可能會(huì)影響到類色氨酸對(duì)點(diǎn)源污染的識(shí)別能力。

3 結(jié) 論

(1) 千島湖CDOM各熒光組分微生物降解培養(yǎng)過程中以降解為主，很少出現(xiàn)累積。類色氨酸和類腐殖酸均具有比較高的生物活性，類色氨酸的生物可利用性高于類腐殖酸。

(2) 千島湖CDOM在東南出湖區(qū)域較其他湖區(qū)降解更明顯，類色氨酸組分C2是BDOM的主要貢獻(xiàn)者。

(3) 微生物活動(dòng)致使千島湖CDOM熒光光譜發(fā)生明顯變化，表現(xiàn)為削弱T峰保留A峰。

(4) 微生物活動(dòng)對(duì)陸源類腐殖酸估算有機(jī)物的影響很小，而對(duì)類色氨酸熒光峰識(shí)別點(diǎn)源污染具有一定影響。

致謝： 感謝張成英、史鵬程、季鵬飛、葉小銳等在野外采樣及室內(nèi)實(shí)驗(yàn)中提供的幫助。