楊少杰，樊良帥，晉小軍，李欣苗，李 艷，祁正梅

(1.甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅潤楓源農(nóng)牧生態(tài)科技有限公司，甘肅 永登 730324)

黃芪是豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.var.mongholicus(Bge.)Hsiao)或膜莢黃芪(Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge.)的干燥根。黃芪具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養(yǎng)血的功效[1]。黃芪是常用的大宗藥材之一，藥用歷史悠久，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品[2]。蒙古黃芪指標性成分為黃芪甲苷(Astragaloside IV)和毛蕊異黃酮葡萄糖苷(Calycosin7-O-β-D- Glucopyranoside)，具有提高人體免疫力、增強機體抗病能力[3-5]等多種功效。

蒙古黃芪原產(chǎn)于山西、內(nèi)蒙古、陜西、甘肅等省區(qū)，屬多年生藥用植物，野生資源貧乏，需求量大，引種后根型變化不明顯，現(xiàn)大多以人工栽培為主[6-8]。由于黃芪為多基原、多產(chǎn)地植物藥，在生長過程中受種植方式、生長年限、種質(zhì)、環(huán)境因素等多種條件的影響，其藥材中的生物活性成分含量往往具有不同的特點。孫思邈在《備急千金要方》中說明：“早則藥勢未成，晚則盛勢已歇”，這強調(diào)生長年限對黃芪藥性的影響較大。藥材過早使用則活性成分積累不夠，不能達到理想藥性；過長會錯過最佳的活性成分配比，藥性也不佳[9-11]。黃芪作為多產(chǎn)地來源、在各產(chǎn)地釆收年限不完全一致、且多數(shù)為移栽種植的藥材[12]，其質(zhì)量的穩(wěn)定可控是其臨床療效的重要保證。黃芪中的活性成分大多屬于次生代謝產(chǎn)物，生成需要一系列的復雜過程，生長年限對于其積累具有重要的影響，確定合理的采收年限對保證藥材質(zhì)量的穩(wěn)定具有重大意義。因此，研究生長年限對蒙古黃芪質(zhì)量的影響，進一步規(guī)范其栽培技術(shù)，成為黃芪可持續(xù)發(fā)展的重大任務(wù)之一。

目前國內(nèi)有關(guān)蒙古黃芪生長年限的報道并不是很多，如：儲成儉等[13]對不同生長年限黃芪藥材中黃酮類成分做了研究；辛博等[14]對不同生長年限黃芪藥材中總多糖和總黃酮含量做了研究。本研究通過測定不同生長年限蒙古黃芪的外觀質(zhì)量和內(nèi)在品質(zhì)，來確定最佳采收年限，從而達到對藥材質(zhì)量的控制和經(jīng)濟效益最大化，以滿足市場需求，旨在為黃芪規(guī)范化種植及開發(fā)利用提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

儀器：JA5003電子天平，F(xiàn)W100高速萬能粉碎機、101-2AB電熱鼓風干燥箱、SX-4-10箱式電阻爐、DK-98-IIA電熱恒溫水浴鍋、DK-98-11電子萬用爐，UPH-I-10T超純水機，ECLassical3100高效液相色譜儀，Chromachem蒸發(fā)光散射檢測器，UV3100紫外-可見檢測器。

試劑：乙腈、甲醇、正丁醇、氨試液、無水乙醇(分析純)、0.2%甲酸溶液、黃芪甲苷對照品(批號：110781-201717；含量以96.9%計；中國食品藥品檢定研究院)、毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品(批號：111920-201606；含量以97.6%計；中國食品藥品檢定研究院)。

供試樣品：不同年限(1～5年生)蒙古黃芪藥材于2019年03月中旬采自甘肅省永登縣潤楓源農(nóng)牧科技有限責任公司試驗田，經(jīng)甘肅農(nóng)業(yè)大學中草藥栽培與鑒定系晉小軍研究員鑒定均為豆科植物蒙古黃芪(Astragalusmembranaceusvar.mongholicus)的干燥根。

1.2 測定指標與方法

1.2.1 生長指標的測定

不同生長年限蒙古黃芪藥材分別在每個試驗大田(1 hm2)按照五點取樣法采樣，每個樣地(5 m×5 m)按照隨機取樣12株，共采收300個樣品，并重復3次，所采的樣品去除蘆頭殘莖，洗凈泥土及殘枝，并分別測量主根長、側(cè)根數(shù)、蘆頭直徑、根鮮重、根干重，分析不同年限蒙古黃芪根的外觀性狀，得出生長年限對蒙古黃芪根生長指標的影響。

1.2.2 折干率測定

折干率是衡量藥材產(chǎn)量和品質(zhì)的重要指標之一，折干率越大，藥材得率越高。分別稱量每個取樣點黃芪鮮品總重量(精確到0.01 g)；后置于55℃的烘箱中24 h 使全部干燥(表面褶皺、兩次稱量重量無差異)，待樣品溫度降至室溫后取出樣品，分別稱量每個取樣點黃芪干燥品的總重量(精確到0.01 g)，計算其折干率。

1.2.3 根的等級

蒙古黃芪根的等級所占比是衡量黃芪根莖產(chǎn)量品質(zhì)的指標，也是制定蒙古黃芪商品規(guī)格的重要參數(shù)之一。采用SPSS 23.0軟件進行K-均值聚類分析，經(jīng)系統(tǒng)聚類將300根蒙古黃芪樣品分為4個等級，其中Ⅰ至Ⅳ分別為特等貨、一等貨、二等貨、小貨[15-16]。

1.2.4 總灰分含量的測定

按照2015版《中國藥典》四部通則2302總灰分測定法測定。

1.2.5 水溶性浸出物含量的測定

按照2015版《中國藥典》四部通則2201水溶性浸出物測定法中的冷浸法測定。

1.2.6 黃芪甲苷含量的測定

按照2015版《中國藥典》四部通則0512高效液相色譜法測定。

采用的色譜柱為SinoPak C18 5 μm×4.6 mm×150 mm，以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以乙腈-水(32：68)為流動相；流速：1.0 mL/min；柱溫：30℃；供試品進樣量為20 μL；用蒸發(fā)光散射檢測器檢測。

1.2.7 黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量的測定

按照2015版《中國藥典》四部通則0512高效液相色譜法測定。

采用的色譜柱為SinoPak C18 5 μm×4.6 mm×150 mm；流動相以乙腈為流動相A，以0.2%甲酸溶液為流動相B；流速：1.0 mL/min；波長：260 nm柱溫：30℃；進樣量為10 μL；用UV3100紫外-可見檢測器檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計，SPSS 23.0 軟件進行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生長年限對蒙古黃芪生長標準影響

從表1可以看出，生長年限對蒙古黃芪外觀質(zhì)量的影響差異顯著，隨著年限的增長，其生長標準逐漸增大。其中主根長的年平均增長率為9.94%、11.08%、1.47%、2.80%，前3年蒙古黃芪主根年平均生長變化差異顯著，從第4年開始年平均生長變化趨勢放緩；側(cè)根數(shù)的年平均增長率為15.94%、21.50%、8.49%、7.16%，其變化差異不顯著；蘆頭直徑的年平均增長率為65.97%、79.65%、6.82%、4.49%，前3年蒙古黃芪蘆頭直徑年平均生長變化差異顯著，從第4年開始年平均生長變化趨勢放緩。結(jié)果表明，蒙古黃芪前3年生長快，從第4年開始生長放緩。

表1 生長年限對蒙古黃芪生長標準影響

2.2 生長年限對蒙古黃芪根重及折干率的影響

從表2可以看出，生長年限對蒙古黃芪根重和折干率的影響差異顯著，其中根的鮮重、干重及折干率在第3年生時達到最大，分別為73.79 g/株、32.75 g/株和44.38%；根的鮮重、干重及折干率的年均增長率在第2年生時達到最大，分別為311.64% 、383.17%和12.64%；前2年蒙古黃芪根的鮮重、干重及折干率年平均變化差異顯著。結(jié)果表明，蒙古黃芪根的鮮重、干重及折干率在第3年生時達到最大，但根的鮮重、干重及折干率的年均增長率在第2年生時達到最大。

表2 生長年限對蒙古黃芪根重和折干率的影響Table 2 The influence of growing years on root weight and drying rate of A.membranaceus var.mongholicus

2.3 不同生長年限黃芪根的等級劃分及所占比例

采用SPSS 23.0 軟件對不同生長年限蒙古黃芪主根長、蘆頭直徑和根鮮重等3項指標進行K-均值聚類分析，以主根長和根鮮重作為分級的主要指標，蘆頭直徑作為分級的參考指標，以聚類中心值作為分級的參考值，對根進行等級劃分。

從表3可以看出，第1年生的蒙古黃芪中二等貨數(shù)量最多，占比為33.33%；第2年生的蒙古黃芪中一等貨數(shù)量最多，占比為40.00%；第3年生的蒙古黃芪中一等貨數(shù)量最多，占比為46.67%；第4年生的蒙古黃芪中特等貨和二等貨數(shù)量最多，占比為33.33%和40.00%；第5年生的蒙古黃芪中小貨數(shù)量最多，占比為60.00%。結(jié)果表明，蒙古黃芪根的特等貨以第3和第4年生的所占比例最大，一等貨以第3年生的所占比例最大。(注：因試驗地有鼠害，生長年限長的黃芪，在采挖過程中有少部分的斷根和空心。該分級供參考)

表3 不同生長年限黃芪根等級及所占比例(%)Table 3 The proportion of A.membranaceus var.mongholicus in various grades with different growing years

2.4 生長年限對黃芪總灰分的影響

2015版《中國藥典》規(guī)定黃芪總灰分含量不得超過5.0%。從表4可以看出，1年生至5年生蒙古黃芪總灰分含量都達到2015版《中國藥典》的規(guī)定，前4年蒙古黃芪總灰分年均增長率分別為15.00%、6.45%、23.03%，從第5年開始總灰分含量有所下降，不同生長年限蒙古黃芪總灰分含量變化差異不顯著。結(jié)果表明，蒙古黃芪前4年總灰分含量逐漸增長，從第5年開始總灰分含量有所下降。藥典規(guī)定黃芪甲苷總灰分以低為優(yōu)，應(yīng)選擇生長年限短的蒙古黃芪。

2.5 生長年限對蒙古黃芪水溶性浸出物的影響

2015版《中國藥典》規(guī)定黃芪水溶性浸出物含量不得少于17.0 %。從表4可以看出，1年生至5年生蒙古黃芪水溶性浸出物含量都達到2015版《中國藥典》的規(guī)定，前4年蒙古黃芪水溶性浸出物含量年均增長率分別為1.77%、11.11%、14.43%，從第5年開始水溶性浸出物含量有所下降，4年生黃芪水溶性浸出物含量與其他年限的含量變化差異顯著。結(jié)果表明，蒙古黃芪前4年水溶性浸出物含量逐漸增長，從第5年開始水溶性浸出物含量有所下降。

2.6 生長年限對蒙古黃芪甲苷的影響

2015版《中國藥典》規(guī)定黃芪甲苷(C41H68O14)的含量不得少于0.040%。從表4可以看出，1年生至5年生蒙古黃芪甲苷含量都達到2015版《中國藥典》的規(guī)定，前4年黃芪甲苷年均增長率分別為72.86%、28.67%、26.18%，從第5年開始甲苷含量開始下降，前4年蒙古黃芪甲苷含量變化差異顯著，從第5年開始年甲苷含量變化差異不顯著。結(jié)果表明，蒙古黃芪前4年甲苷含量增加變化快，從第5年開始甲苷含量有所下降，甲苷含量在蒙古黃芪4年生時達到最大。該研究與閆晉晉等[17]用HPLC 測定不同生長年限蒙古黃芪中黃芪甲苷含量的測定結(jié)果一致，發(fā)現(xiàn)4年生的蒙古黃芪甲苷含量最高。

2.7 生長年限對蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷的影響

2015版《中國藥典》規(guī)定黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷(C22H22O10)不得少于0.020%。從表4可以看出，1年生至5年生蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量都達到2015版《中國藥典》的規(guī)定，前3年黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷年均增長率分別為10.22%、18.83%，從第4年開始毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量開始下降，2年生和3年生的年蒙古黃芪毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量變化與1年生、4年生和5年生的差異顯著，從第5年開始年甲苷含量變化差異不顯著。結(jié)果表明，蒙古黃芪前3年毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量增加變化快，從第4年開始毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量有所下降，所以，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量在蒙古黃芪3年生時達到最大。該含量研究與薛利新等[18]在甘肅不同產(chǎn)地黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量基本一致。

表4 生長年限對蒙古黃芪內(nèi)在品質(zhì)的影響Table 4 The influence of growing years on inner quality of A.membranaceus var.mongholicus

3 結(jié)論與討論

從試驗結(jié)果可以看出，生長年限對蒙古黃芪質(zhì)量的影響變化顯著，其外觀質(zhì)量指標(主根長、側(cè)根數(shù)、蘆頭直徑)前3年生長快，從第4年開始生長放緩，應(yīng)選擇3年生的蒙古黃芪；其根的鮮重、干重及折干率在3年生時達到最大；其根的特等貨以3年生和4年生的所占比例最大，一等貨以3年生的所占比例最大；其總灰分含量前4年增長，從第5年開始含量有所下降，應(yīng)選擇生長年限短的蒙古黃芪；其水溶性浸出物含量和黃芪甲苷含量前4年增加變化快，從第5年開始變化含量有所下降，應(yīng)選擇4年生的蒙古黃芪；其毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量在3年生時達到最大，應(yīng)選擇3年生的蒙古黃芪。結(jié)果表明，在一定生長年限內(nèi)，蒙古黃芪隨著外觀質(zhì)量(主根長、蘆頭直徑)的增長，其內(nèi)在品質(zhì)(水溶性浸出物、黃芪甲苷、毛蕊異黃酮葡萄糖苷)的含量值也逐漸增大。

生長年限對蒙古黃芪外觀質(zhì)量及內(nèi)在品質(zhì)的影響差異性較大，應(yīng)根據(jù)不同需求選擇合適的生長年限。綜合各項指標，應(yīng)選擇3年生的蒙古黃芪，但以黃芪甲苷為標準，應(yīng)選擇4年生的蒙古黃芪。

綜合表明，藥用植物中的活性成分大多屬于次生代謝產(chǎn)物，其在植物體內(nèi)的轉(zhuǎn)化和生成需要一定的過程[19]，張瑞等[20]通過研究黃芪藥材外觀性狀及5種黃酮類成分的定量分析，發(fā)現(xiàn)生長年限是影響黃芪藥材內(nèi)外在質(zhì)量的關(guān)鍵因素；儲成儉等[21]研究發(fā)現(xiàn)不同生長年限的黃芪樣品中4種黃酮總量以及其中的毛蕊異黃酮苷、毛蕊異黃酮和芒柄花素含量隨著生長年限增加而升高。因此，生長年限是影響蒙古黃芪外觀質(zhì)量及內(nèi)在品質(zhì)的重要因子，對調(diào)控蒙古黃芪產(chǎn)量及質(zhì)量起關(guān)鍵作用[22-23]。