韓忠耀 ，張 濤 ，李 燕，胡志平，陸廷祥，王傳明，王玉明，王應(yīng)肅

（1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校，貴州都勻 558000；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193）

大接骨丹來(lái)源于山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var. intermedia（Harms）Hu 的根皮，別名水冬瓜根皮、水五加等［1］。當(dāng)前，針對(duì)大接骨丹的研究，主要集中在有效成分的分離與鑒定［2-5］、抗炎鎮(zhèn)痛藥效［6］、免疫抑制活性［7-8］、病蟲(chóng)害種類(lèi)及野生資源破壞情況調(diào)查［9］、提取工藝優(yōu)化［10］以及質(zhì)量控制［11-14］等，尚未見(jiàn)對(duì)黔產(chǎn)不同采收期大接骨丹HPLC 指紋圖譜的研究。本實(shí)驗(yàn)首次針對(duì)黔產(chǎn)不同采收期大接骨丹建立HPLC 指紋圖譜，并結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）等化學(xué)計(jì)量學(xué)統(tǒng)計(jì)分析軟件，對(duì)不同采收期大接骨丹進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，以期為從整體上控制其質(zhì)量提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1260 型高效液相色譜儀（DAD 檢測(cè)器，美國(guó)Agilent 公司）；FA1004B 型電子天平（溫州瑞昕?jī)x器有限公司）；101-3AB 型烘箱（天津市泰斯特儀器有限公司）；HH-S8 雙列八孔水浴鍋（常州邁科諾儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 紫丁香苷對(duì)照品（北京盛世康普化工技術(shù)研究院，批號(hào)161214）；乙腈（色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)20160504）；磷酸［分析純，重慶川東化工（集團(tuán)）有限公司，批號(hào)20140201］；水為娃哈哈純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司，批號(hào)20180407）；其他試劑均為分析純。大接骨丹藥材自采于貴州省都勻市杉木湖溝渠（生長(zhǎng)環(huán)境為露天向陽(yáng)山坡、溝渠，周?chē)窳鲃?dòng)溪水，黃壤土，伴生植物主要有芭茅、囊吾、腎蕨、及己、三葉鬼針草等），經(jīng)黔南民族醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校藥學(xué)系王傳明副教授鑒定為山茱萸科植物有齒鞘柄木Toricellia Angulata Oliv.var.intermedia（Harms）Hu 的根皮，信息見(jiàn)表1。

表1 樣品信息

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Agela Promosil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.5% 磷酸水（B），梯度洗脫（0～10 min，9% A；10～20 min，9%～14.4% A；20～25 min，14.4%～18%A；25～45 min，18%～21.5%A；45～60 min，21.5%～70% A；60～60.1 min，70%～9% A；60.1～70 min，9%A）；體積流量1.0 mL／min；柱溫35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm；進(jìn)樣量5 μL，保留時(shí)間為70 min。

2.2 溶液制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 取紫丁香苷對(duì)照品，精密稱(chēng)定，置于量瓶中甲醇溶解，搖勻，得0.172 0 mg／mL 的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 自采的鮮藥材50 ℃下烘干，粉碎后過(guò)4 號(hào)篩，裝入自封袋，貼標(biāo)簽后備用。分別稱(chēng)取各采收期內(nèi)藥材粉末，每份約0.5 g，精密稱(chēng)定，置250 mL 圓底燒瓶中，精密加入用甲醇50 mL，回流提取1 h 后，放冷，濾過(guò)，用甲醇補(bǔ)足每份濾液為50 mL，搖勻。各濾液分別經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 精密度試驗(yàn) 取同一批（G6）供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6 次，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2.15%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于1.09%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批（G6）供試品6 份，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1.31%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2.63%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批（G6）供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下，分別于0、4、8、12、24、36、48 h進(jìn)樣，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.97%，各共有峰相對(duì)峰面積RSD 均小于2.44%，表明供試品溶液在48 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 指紋圖譜建立 取11 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，將AIA 格式圖譜導(dǎo)入中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版本），以G6 為參照?qǐng)D譜，以“中位數(shù)”生成對(duì)照?qǐng)D譜，時(shí)間寬度為0.1，得到11 批樣品HPLC 指紋圖譜，見(jiàn)圖1～2。以共有峰2（S）紫丁香苷為參照峰S，計(jì)算14 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，見(jiàn)表2～3。14 個(gè)共有峰的相對(duì)保留時(shí)間的RSD 均＜3.00%，而共有峰的相對(duì)峰面積的RSD 值波動(dòng)較大，除參照峰2（S）外，在37.22%～134.07%，表明不同采收期內(nèi)大接骨丹二次代謝產(chǎn)物積累呈顯著性差異。

圖1 不同采收期大接骨丹對(duì)照品圖譜

圖2 11 批不同采收期樣品HPLC 指紋圖譜

表2 11 批不同采收期樣品共有峰相對(duì)保留時(shí)間

表3 11 批不同采收期樣品共有峰相對(duì)峰面積

2.5 化學(xué)模式識(shí)別

2.5.1 相似度評(píng)價(jià) 利用中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2012.130723 版本），全峰匹配模式，以中位數(shù)生成對(duì)照指紋圖譜后，利用該軟件計(jì)算其相似度，結(jié)果表明，不同采收期大接骨丹與對(duì)照?qǐng)D譜相似度在0.911～0.997，見(jiàn)表4。

表4 11 批不同采收期樣品相似度

2.5.2 聚類(lèi)分析 以14 個(gè)共有峰相對(duì)峰面積導(dǎo)入SPSS 18.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用組間均聯(lián)法，以歐式平方距離為分類(lèi)依據(jù)，進(jìn)行系統(tǒng)聚類(lèi)，不同采收期大接骨丹聚類(lèi)分析結(jié)果見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，當(dāng)分類(lèi)距離為25 時(shí)，聚類(lèi)分析將11批不同采收期大接骨丹藥材分為2 類(lèi)，其中G8 單獨(dú)聚為第一類(lèi)，其他批聚為第二類(lèi)。當(dāng)分類(lèi)距離＜3 時(shí)，G1～G11 分別對(duì)應(yīng)樣本采集月份，發(fā)現(xiàn)G4、G5、G6、G7 為一小類(lèi)，G1、G3 為一小類(lèi)，G9、G10、G11、G2 為一小類(lèi)，G8 單獨(dú)為一類(lèi)，從聚類(lèi)分析可以看出，雖然不同采收期內(nèi)相對(duì)峰面積RSD 差異性較大，但是不同采收期大接骨丹質(zhì)量相對(duì)穩(wěn)定、可控，這與相似度結(jié)果基本一致。

圖3 11 批不同采收期樣品聚類(lèi)分析樹(shù)狀圖

2.5.3 主成分分析和正交偏最小二乘法-判別分析 參考文獻(xiàn)［15-16］，將14 個(gè)共有峰相對(duì)峰面積作為變量，導(dǎo)入SIMCA-P+12.0 在軟件自動(dòng)擬合求解后，進(jìn)行主成分分析和OPLS-DA 分析，結(jié)果見(jiàn)圖4～5。主成分分析結(jié)果顯示，G8 樣品主成分分析得分較高且G8 偏離圖4 中心點(diǎn)最遠(yuǎn)，與其他批呈顯著性差異，該結(jié)果與聚類(lèi)分析結(jié)果基本保持一致。OPLS-DA 分散點(diǎn)圖驗(yàn)證了主成分分析與聚類(lèi)分析結(jié)果，1 組與2 組區(qū)分結(jié)果較好。同時(shí)，14 個(gè)共有峰相對(duì)峰面積的VIP 值順序依次為峰3、13、4、7、11、9、12、8、7、6、14，結(jié)果顯示峰3、13、4、7、11、9、12、8 共8 個(gè)共有峰的VIP 值大于1，峰5、10、1、7、6 共有峰VIP 值均大于0.7，峰14 VIP 值均大于0.4。VIP 結(jié)果表明峰3、13、4、7、11、9、12、8 對(duì)不同采收期樣品的分類(lèi)具有顯著性影響，為其主要化學(xué)成分質(zhì)量標(biāo)志物，可用于其質(zhì)量控制的關(guān)鍵性二次代謝產(chǎn)物指標(biāo)性化學(xué)成分。

3 討論

圖4 11 批不同采收期樣品主成分分析得分散點(diǎn)圖

圖5 11 批不同采收期樣品OPLS-DA 得分散點(diǎn)圖

本實(shí)驗(yàn)在預(yù)實(shí)驗(yàn)時(shí)，考察了不同提取溶劑、提取方法、色譜柱、流動(dòng)相等條件，發(fā)現(xiàn)流動(dòng)相0.5%-磷酸水顯著優(yōu)于0.5%-醋酸水。不同采收期大接骨丹在230 nm 時(shí)，樣品吸收峰較多，且分離度較佳，最終確定了“2.1”項(xiàng)下條件。

采集樣品時(shí)，根據(jù)采集年份不同采收期大接骨丹地上部分生長(zhǎng)趨勢(shì)，采取單月的月中采集1 次或單月的10 日、20 日采集2 次。相似度評(píng)價(jià)時(shí)，與4 至12 月份樣本相比，發(fā)現(xiàn)1 至3 月份相似度較低，可能與當(dāng)年當(dāng)?shù)貧夂蚧蜻^(guò)冬氣候節(jié)令有關(guān)。采集樣品當(dāng)年，大接骨丹較往年3 月份地上部分開(kāi)始萌芽推遲近1 個(gè)月，4 月初地上部分開(kāi)始萌發(fā)新芽。結(jié)合生產(chǎn)與用藥實(shí)際，建立了適應(yīng)譜相對(duì)較寬的4至12 月樣品HPLC 指紋圖譜，有利于藥材的質(zhì)量控制。氣候等外部環(huán)境對(duì)大接骨丹二次代謝產(chǎn)物積累規(guī)律，有待進(jìn)一步深入研究。

本研究利用HPLC 技術(shù)與指紋圖譜質(zhì)量控制技術(shù)，建立不同采收期內(nèi)黔產(chǎn)大接骨丹HPLC 指紋圖譜，同時(shí)，利用相似度評(píng)價(jià)、聚類(lèi)分析、主成分分析、正交偏最小二乘法-判別分析等化學(xué)計(jì)量學(xué)技術(shù)，對(duì)黔產(chǎn)不同采收期大接骨丹的質(zhì)量進(jìn)行客觀(guān)性評(píng)價(jià)，以期為該藥的質(zhì)量控制、資源開(kāi)發(fā)、少數(shù)民族聚集地民間用藥及民族醫(yī)療機(jī)構(gòu)或中醫(yī)院臨床用藥提供參考。