吳 梅 ，張 潔，張國云，譚桂芳，張 美，李 莉?

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南昆明 650500；2.屏邊國云種植有限公司，云南屏邊 661200）

野蠶豆根，又名化血丹、小紅藥、金貓頭（廣西）、靈芝草（云南），原植物來源于玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth.，主要分布于云南、貴州、廣西等?。?］?！度珖胁菟巺R編》 記載，其味酸、稍麻，性溫。止血止痛、消腫化瘀，用于治療咯血、吐血、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、跌打內(nèi)傷瘀血；外用適量，鮮品或生品搗爛外敷［2］?！对颇现胁菟帯?記載，其味苦，性涼?；钛{(diào)經(jīng)、清熱解毒，用于治療跌打損傷、小兒高熱、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后流血、產(chǎn)后腹痛、不孕癥等［3］?，F(xiàn)代藥理研究表明，野蠶豆根用藥安全，無明顯不良反應(yīng)，對(duì)心血管疾病和大鼠急性缺血模型所致心肌損傷有保護(hù)作用［4-5］，此外，還有抗凝血及抗炎活性［6-7］。

目前已從野蠶豆根中分離、鑒定出多個(gè)化合物［4-8，11］，其中環(huán)烯醚萜苷類是其主要成分，該類成分符合玄參科植物化學(xué)分類上的特征，且具有抗炎、抗腫瘤、保肝、降糖、神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)作用等廣泛的藥理活性［9-10］。桃葉珊瑚苷是野蠶豆根中含量最高的環(huán)烯醚萜苷類［11-12］，具有抗氧化、抗炎、保護(hù)心血管、促進(jìn)傷口愈合等多種藥理作用［13］。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)野蠶豆根的生藥學(xué)研究，全面闡述其性狀及顯微鑒別特征，并建立紫外-可見分光光度法測(cè)定其總環(huán)烯醚萜苷的含量，以期為該藥材真?zhèn)舞b別及品質(zhì)評(píng)價(jià)提供理論依據(jù)。

1 材料

Eclipse 80i 型生物數(shù)碼攝影顯微鏡（日本Nikon 公司）；CUT5062 型輪轉(zhuǎn)式石蠟切片機(jī)（德國SLEE 公司）；SYD-PK 漂烘烤片機(jī)（沈陽譽(yù)德公司）；UV-2450 型紫外-可見分光光度計(jì)（日本島津公司）；FA2004 型電子天平（萬分之一，上海恒平科學(xué)儀器有限公司）；DFY-C 型萬能高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）；DZKW-D-4 型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器）。Epstahl 試劑（對(duì)二甲氨基苯甲醛0.25 g、冰醋酸50 g、35% 磷酸5 g、水20 mL 混合）（廣東光華科技股份有限公司）；叔丁醇、正丁醇、氯仿、甲醇（分析純，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；95%乙醇、鹽酸等（分析純，汕滇藥業(yè)有限公司）。桃葉珊瑚苷對(duì)照品（批號(hào)111761-200601，中國食品藥品檢定研究院）；水為去離子重蒸水。

野蠶豆根采自云南省紅河州屏邊縣國云種植有限公司，經(jīng)云南中醫(yī)藥大學(xué)李海寧老師鑒定為玄參科胡麻草屬植物大花胡麻草Centranthera grandiflora Benth.的根及根莖。

2 方法

2.1 性狀鑒別 通過眼觀、鼻聞、舌嘗、測(cè)量等方法［14］，研究野蠶豆根藥材的性狀特征。

2.2 顯微鑒別 取浸泡在F.A.A.固定液中的材料，切取長(zhǎng)約0.5 cm 根，叔丁醇-乙醇系統(tǒng)脫水，按常規(guī)方法浸蠟、包埋、切片、染色，最后封片，制成永久石蠟切片，在顯微鏡下觀察其組織結(jié)構(gòu)特征；將干燥藥材粉碎，過60目篩，制粉末片，在顯微鏡下觀察其細(xì)胞、后含物等粉末特征。

2.3 總環(huán)烯醚萜苷含量測(cè)定 參考文獻(xiàn)［15-16］，采用紫外-可見光分光光度法測(cè)定野蠶豆根總環(huán)烯醚萜苷的含量。

2.3.1 對(duì)照品溶液制備 取桃葉珊瑚苷10.0 mg 置于100 mL棕色量瓶中，精密稱定，加甲醇定容，搖勻，即得（每1 mL 含桃葉珊瑚苷0.100 2 mg）。

2.3.2 供試品溶液制備 將野蠶豆根藥材粉碎，過60 目篩。取粉末2.0 g，精密稱定，加入氯仿30 mL，超聲30 min，抽濾。取藥渣加60%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲提取40 min，用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 顯色條件 取0.2～1.0 mL 待測(cè)液于10 mL 量瓶中，分別加入E-試劑1.7 mL、20%鹽酸0.5 mL 及乙醇2.5 mL，用蒸餾水定容，在75 ℃水浴加熱22 min，冷卻10 min 后，于596 nm 處用分光光度計(jì)測(cè)定溶液的吸光度。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒別 根莖呈不規(guī)則塊狀，長(zhǎng)0.2～0.6 cm，直徑0.3～0.7 cm，棕褐色，上端有莖痕或殘留莖基，周圍及下端著生多數(shù)細(xì)根。圖1 顯示其根呈細(xì)長(zhǎng)圓柱形，長(zhǎng)5～18 cm，直徑約1 mm，表面棕紅色，具縱皺紋，有須根及須根痕，有的可見皮部橫向斷離露出木部。質(zhì)脆，易折斷。斷面略平坦，皮部橙紅色或橙黃色，木部灰棕色至灰黑色。氣微，味微苦。

圖1 野蠶豆根性狀圖

3.2 顯微鑒別

3.2.1 根橫切面 表皮為1 列長(zhǎng)方形或類方形細(xì)胞，有的細(xì)胞由縱向壁分隔成2 個(gè)或數(shù)個(gè)子細(xì)胞，外被黑紅色色素；下皮由1～2 列類長(zhǎng)方形或類方形細(xì)胞組成；皮層寬廣，內(nèi)皮層明顯，可見凱氏點(diǎn)；外韌型維管束，中柱鞘部位1～3列薄壁細(xì)胞，韌皮部窄，外側(cè)分布少量纖維，形成層隱約可見，木質(zhì)部導(dǎo)管木化，略呈徑向排列，髓部不明顯。下皮、皮層、內(nèi)皮層及木質(zhì)部薄壁細(xì)胞有的由縱向壁或橫向壁分隔成2 個(gè)子細(xì)胞；色素在下皮、皮層、維管柱均有分布；薄壁細(xì)胞含淀粉粒。見圖2。

3.2.2 顯微粉末特征 粉末黃棕色。表皮細(xì)胞側(cè)面觀長(zhǎng)方形或類方形，有的由縱向壁分隔成2 個(gè)或數(shù)個(gè)子細(xì)胞，外被色素黑紅色；表面觀類長(zhǎng)方形或多角形，垂周壁平直或微波狀，細(xì)胞被縱向壁分隔為數(shù)個(gè)子細(xì)胞，有的子細(xì)胞又被橫向壁分隔為2 個(gè)小細(xì)胞。含棕紅色或棕黃色色素的細(xì)胞常數(shù)個(gè)相連，色素顆粒狀，沿細(xì)胞壁分布成條帶狀。導(dǎo)管多為具緣紋孔、螺紋，少見網(wǎng)紋導(dǎo)管，直徑7～45 μm，有的導(dǎo)管亦含色素。纖維多成束，直徑8～35 μm，木化，胞腔大，具斜紋孔。淀粉粒多，單粒橢圓形、圓形、卵形或不規(guī)則形狀，直徑3～30 μm，臍點(diǎn)呈點(diǎn)狀，短縫狀或人字形，復(fù)粒極少，多為2 分粒。見圖3。

圖2 野蠶豆根（根）橫切面圖

圖3 野蠶豆根粉末特征圖

3.3 總環(huán)烯醚萜苷含量測(cè)定

3.3.1 吸收波長(zhǎng)選擇 取對(duì)照品和供試品溶液各0.5 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法顯色，400～800 nm 間進(jìn)行掃描，結(jié)果表明對(duì)照品和供試品溶液在596 nm 處都有最大吸收，圖譜形狀基本一致。

3.3.2 線性關(guān)系考察 分別取桃葉珊瑚苷對(duì)照品溶液（0.100 2 mg／mL）0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5 mL于10 mL 量瓶中，按“2.3.3”項(xiàng)下方法顯色，在596 nm 處測(cè)定其吸光度。以吸光度為縱坐標(biāo)（Y），對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），進(jìn)行回歸，方程為Y＝16.569 X +0.012 1（r＝0.999 1），表明桃葉珊瑚苷對(duì)照品在0～35.07 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

3.3.3 精密度試驗(yàn) 精密量取桃葉珊瑚苷對(duì)照品溶液1、2 mL，按“2.3.3”項(xiàng)下方法顯色，每組重復(fù)操作6 次。測(cè)定結(jié)果RSD 分別為0.59%（n ＝6）、0.31%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密量取1 mL 供試品溶液于10 mL具塞試管中，按“2.3.3”項(xiàng)下方法顯色，分別于0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120 min 測(cè)定吸光度。測(cè)定結(jié)果RSD 為2.18%（n ＝13），表明供試品溶液顯色后120 min 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱定藥材粉末2.0 g，6 份，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液。精密量取1.0 mL供試品溶液置10 mL 具塞試管中，按“2.3.3”項(xiàng)下顯色方法操作，測(cè)定其吸光度。測(cè)定結(jié)果RSD 為1.53%（n ＝6），表明該方法重復(fù)性良好。

3.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量的藥材共9份，精密加入桃葉珊瑚苷對(duì)照品，按“2.3.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.3.3”項(xiàng)顯色方法操作，測(cè)定其吸光度，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 野蠶豆根中總環(huán)烯醚萜苷回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.3.7 樣品含量測(cè)定 按“3.3”項(xiàng)下方法對(duì)所采集樣品進(jìn)行含量測(cè)定。結(jié)果表明2 年生野蠶豆根及根莖中，總環(huán)烯醚萜苷的含量達(dá)到4.52%，而生長(zhǎng)1 年的僅為1.52%，1.5 年生略有增加。2 年生野蠶豆根的總環(huán)烯醚萜苷含量顯著高于1 年生，野蠶豆根的地上莖葉中總環(huán)烯醚萜苷的含量較低。結(jié)果見表2。

表2 野蠶豆根中總環(huán)烯醚萜苷含量測(cè)定結(jié)果（%，n＝3）

4 討論

野蠶豆根藥材為根莖上著生多數(shù)細(xì)根，根表面棕紅色，斷面皮部橙紅色或橙黃色，木部灰棕色至灰黑色；顯微組織結(jié)構(gòu)以初生構(gòu)造為主，表皮細(xì)胞有的由縱向壁分隔成2個(gè)或數(shù)個(gè)子細(xì)胞，外被色素，維管束外韌型，中柱鞘部位分布少量纖維束；主要粉末特征為表皮細(xì)胞及色素，其中色素呈棕紅色或棕黃色，顆粒狀，沿細(xì)胞壁分布成條帶狀。

野蠶豆根主要成分為環(huán)烯醚萜苷類，其中含量最高的是桃葉珊瑚苷［8］。以桃葉珊瑚苷作為對(duì)照品，采用對(duì)二甲氨基苯甲醛顯色的紫外-可見分光光度法測(cè)定野蠶豆根中總環(huán)烯醚萜苷的含量，該方法測(cè)得含量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性好，可用于野蠶豆根的質(zhì)量控制，同時(shí)也為其他藥材測(cè)定總環(huán)烯醚萜苷類成分提供參考。

野蠶豆根在云南紅河州一帶資源豐富，是苗族等少數(shù)民族的常用草藥，對(duì)心血管疾病的防治有較好的療效。由于3 年生野蠶豆根多發(fā)生根的腐敗而導(dǎo)致產(chǎn)量降低，故一般采收1～2 年生藥材。本研究以總環(huán)烯醚萜苷類成分的含量為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以期為野蠶豆根藥材2 年采收的合理性提供理論依據(jù)。