瑪 青，舒艦輝，方津津，吳尚林，楊哲誠，張浩聰，陸 胤

（浙江樹人大學(xué)生物與環(huán)境工程學(xué)院，浙江杭州 310015）

分子標(biāo)記在種質(zhì)資源多樣性研究中有著廣泛的應(yīng)用。DNA 水平的多態(tài)性主要表現(xiàn)核苷酸序列的差異，對于任何類型的核苷酸序列的差異都可用分子標(biāo)記技術(shù)對其進(jìn)行檢測。其中簡單重復(fù)序列（SSR）又稱微衛(wèi)星序列［1］，是由1～6 個核苷酸的串聯(lián)重復(fù)單元組成的一類DNA 序列。2005年以來，第2 代高通量測序技術(shù)的發(fā)展為規(guī)?；z傳變異檢測和標(biāo)記位點開發(fā)帶來了新機(jī)遇。SSR 可從表達(dá)序列標(biāo)簽庫（EST）或轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中挖掘，稱之為ESTSSR［2］。與基因組SSR 相比，EST-SSR 開發(fā)相對較易，但其多態(tài)性相對較低。篩選高多態(tài)性的EST-SSR 分子標(biāo)記對于遺傳研究與種質(zhì)資源評價均具有重要的價值。目前，基于轉(zhuǎn)錄組信息進(jìn)行SSR 標(biāo)記引物開發(fā)在忍冬Lonicera japonica、丹參Salvia miltiorrhiza、紅豆杉Taxus cuspidata、三七Panax notoginseng、紫蘇Perilla frutescens 和杜仲Eucommia ulmoides 等藥用植物上得到有效應(yīng)用［3］。

大籽獼猴桃Actinidia macrosperma 為抗癌中藥貓人參的基源植物［4］，較對萼獼猴桃有更高的藥用價值，主產(chǎn)于浙江臨安、富陽等地［5］，江西、安徽、江蘇等地區(qū)亦產(chǎn)，是浙江地區(qū)的習(xí)用中藥，其根具有清熱解毒、消腫癤等功效，臨床用于治療骨髓炎、肺癌深部膿腫、消化系統(tǒng)腫瘤、肝硬化黃疸腹水等，是華東地區(qū)常用大宗藥材［3］。近年來由于人為因素，并且藥用部位為根部，加之大籽獼猴桃自身生長繁殖速度較慢，使得大籽獼猴桃已瀕臨滅絕，市售的貓人參商品良莠不齊，更有不良商家將同屬的近緣種作為貓人參混入其中，如對萼獼猴桃A.valvata、黑蕊獼猴桃A.melanandra、中華獼猴桃A.chinensis、小葉獼猴桃A.lanceolata、毛花獼猴桃A.eriantha 等，甚至其他不同科植物被混充作貓人參流入市場［5］。為解決該問題，很多學(xué)者對其基源植物進(jìn)行多方面的鑒定研究，主要集中在形態(tài)、顯微、化學(xué)成分鑒別等方面［6］。利用EST-SSR 分子標(biāo)記構(gòu)建大籽獼猴桃核心種質(zhì)尚屬空白。相比于隨機(jī)擴(kuò)增的多態(tài)性DNA（RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（AFLP）以及內(nèi)部簡單序列重復(fù)（ISSR）這一類顯性分子標(biāo)記而言，EST-SSR 作為共顯性分子標(biāo)記，能夠與植物物種某些表達(dá)不同的功能基因相聯(lián)系，因此可以更加明確物種種間和種內(nèi)的遺傳差異。開發(fā)新的EST-SSR 引物，對于構(gòu)建高密度遺傳圖譜和品種指紋圖譜具有重要意義，對于大籽獼猴桃的分子鑒定工作將有現(xiàn)實的指導(dǎo)及實踐意義。

1 材料與方法

1.1 生藥學(xué) 通過對標(biāo)本實例與野外樣本的觀察、總結(jié)，并在一定程度上結(jié)合專業(yè)檢索書籍的內(nèi)容，形成大籽獼猴桃及其常見混淆品野生植株的鑒別要點和相應(yīng)檢索表。并先后對浙江、安徽、江西等省的藥材市場進(jìn)行貓人參藥源的調(diào)查和收集，發(fā)現(xiàn)目前市售商品多取材于藥材的莖干（多年生）；通過對藥材橫切和藥材粉末的觀察、總結(jié)，形成大籽獼猴桃及其常見混淆品的性狀鑒別要點和相應(yīng)檢索表。

1.2 生境調(diào)查 通過實地調(diào)查采集及對國內(nèi)幾個專業(yè)植物標(biāo)本館的查閱，結(jié)合已經(jīng)公開的文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，明確大籽獼猴桃的資源分布。

1.2.1 地理及氣候條件 根據(jù)地理環(huán)境的表觀數(shù)據(jù)及地理國情監(jiān)測云平臺信息，確定不同生境大籽獼猴桃的地理及氣候條件。

1.2.2 土壤理化性質(zhì)分析 分別取樣品采集地30～50 cm深度的土壤，對水分含有量、pH、有機(jī)質(zhì)含量、氮含量、磷含量、鉀含量等參數(shù)進(jìn)行測定［7］。

1.3 EST-SSR 分子標(biāo)記篩選

1.3.1 基因組DNA 提取 采用PlantZol 試劑盒法提取DNA 基因組［8］。即采取大籽獼猴桃幼嫩葉片，將葉片初步夾碎后，至于2 mL 離心管中，加入小磁珠和少量聚乙烯吡咯烷酮（PVP），用磨樣儀研磨2 次。每管加1 mL 洗滌液，震蕩儀混勻，4 ℃12 000 r／min 離心5 min 進(jìn)行DNA 清洗，棄上清，取沉淀。而后每管加植物基因組DNA 快速提取試劑1 mL 和β-巰基乙醇混合液2 μL，震蕩儀混勻；65 ℃水浴60 min，每15 min 輕輕顛倒10 次。將水浴后的樣品移入圓底離心管，每管加氯仿異戊醇（24 ∶1）750 μL，混勻后，于4 ℃12 000 r／min 離心5 min，取上清并加異丙醇630 μL 混勻，置于-20 ℃靜置30 min 以上，離心（4 ℃，12 000 r／min，10 min）取DNA 沉淀。而后每管加入75%乙醇1 mL，清洗數(shù)次；揮干乙醇后，加30 μL 雙蒸水于4 ℃溶解DNA 4 h 以上，最后保存于-20 ℃冰箱中。為評價DNA 質(zhì)量，將提取到的基因組DNA 采用紫外分光光度計檢測，選擇OD260／OD280比值介于1.8～2.0 之間的優(yōu)良DNA。

1.3.2 EST-SSR 引物設(shè)計與合成 通過RNA-Seq 得到大籽獼猴桃EST 序列并開發(fā)EST-SSR 引物［9］。引物設(shè)計時選用SSR 重復(fù)次數(shù)較高的EST，從而增大引物在不同材料間的多態(tài)性擴(kuò)增率，提高EST-SSR 標(biāo)記在資源分析中的效率［10］。引物設(shè)計的具體條件為PCR 產(chǎn)物長度控制在125～300 bp；引物長度18～24 bp；避免出現(xiàn)引物二聚體。GC 含量40%～70%，最適合為50%；Tm值控制在58 ℃左右。

1.3.3 多態(tài)性引物篩選 用抽提的大籽獼猴桃葉片DNA為模板，用以下設(shè)計的引物進(jìn)行擴(kuò)增［11］。

1.3.3.1 PCR 反應(yīng)體系 在20 μL 反應(yīng)體系含2.0 mmol／L Mg2+，0.25 mmol／L dNTP，0.3 μmol／L 引物，60 ng DNA，Taq DNA polymerase 1U。

1.3.3.2 PCR 擴(kuò)增 利用Eppendorf Mastercycler PCR 儀擴(kuò)增。反應(yīng)程序為94 ℃預(yù)變性3 min，然后94 ℃（30 s）～60 ℃（30 s）～72 ℃（45 s）循環(huán)35 次；之后72 ℃延伸15 min。

1.3.3.3 電泳檢測 取5 μL PCR 產(chǎn)物用8%丙烯酰胺凝膠電泳檢測，硝酸銀染色顯影，并掃描圖像記錄結(jié)果。

1.3.3.4 STR 片段長度分析 將上述電泳檢測中條帶長度在合理范圍內(nèi)的PCR 產(chǎn)物進(jìn)行STR 片段長度分析，得到不同產(chǎn)地大籽獼猴桃的SSR 位點的具體長度，收集多態(tài)性信息。

1.3.3.5 EST-SSR 多態(tài)性分析 信息含量PIC 通過公式［12］PIC＝1 -Pi為第i 個等位基因的頻率，k 為等位基因的數(shù)量。PIC≥0.10 為多態(tài)性SSR，PIC≥0.70 為高多態(tài)性SSR。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣本收集 用踏查和線路調(diào)查相結(jié)合的方式，完成資源調(diào)查和群體取樣（主要集中在華東地區(qū)），見圖1。共采集到大籽獼猴桃野生群體8 個及對萼獼猴桃群體1 個、黑蕊獼猴桃群體1 個、小葉獼猴桃群體1 個，見表1。

2.2 生藥學(xué)研究

圖1 大籽獼猴桃及其混淆品的野生植株實物圖

表1 野生大籽獼猴桃及外類群采樣策略

2.2.1 野生植株的鑒別要點 通過對標(biāo)本實例與野外樣本的葉片、葉脈、葉柄、莖干髓部等特征的觀察、歸納及總結(jié)，形成大籽獼猴桃及其常見混淆品野生植株的鑒別要點。大籽獼猴桃，莖枝髓實心或基本實心，葉背面脈腋有髯毛、中脈或葉柄具短小軟刺，種子長4～5 mm；對萼獼猴桃，莖枝髓實心或基本實心，葉背面脈腋無髯毛、中脈或葉柄無短小軟刺，種子長1～3 mm；黑蕊獼猴桃，莖枝髓片狀，幼時小枝、果實無毛無斑點，葉片無毛或僅背面脈腋有簇聚毛；小葉獼猴桃，莖枝髓片狀，幼時小枝、果實有毛及斑點，葉片背密布毛，葉片卵狀橢圓形或近披針形，寬2～4 cm，果實直徑0.5～1 cm。

2.2.2 藥材性狀鑒別要點 通過對藥材橫切和藥材粉末的觀察和總結(jié)，獲得大籽獼猴桃及其常見混淆品的藥材性狀的鑒別要點，見表2?？偟膩碚f，這幾種植物在外表皮、髓部、粉碎物及橫切面上的導(dǎo)管等方面各有特點。如橫切面上導(dǎo)管一般較明顯，在許多種類中孔徑較大的導(dǎo)管往往排列成同心環(huán)狀；4 種獼猴桃莖干粉碎物的顏色基本為黃褐色，深淺略有差異；粉碎物形態(tài)基本以粉末和碎屑為主，但纖維化程度有較大差異，以黑蕊獼猴桃粉碎物纖維化程度最高。

2.3 生境調(diào)查

2.3.1 地理分布及生長環(huán)境 大籽獼猴桃多生長在海拔800 m 以下的丘陵或低海拔山坡、山麓雜木林內(nèi)及林緣水溝旁、路邊曠地上，為常綠、落葉闊葉混交林帶。選取樣品選自浙江（東經(jīng)120°、北緯30°，海拔34～820 m）、安徽（東經(jīng)117°、北緯32°，海拔168～620 m）、江西（東經(jīng)115°、北緯28°，海拔594 m）等地的大籽獼猴桃野生居群及部分外類群，均處于亞熱帶季風(fēng)性氣候區(qū)，見表1。大籽獼猴桃生長帶地形復(fù)雜、山坡平緩、森林茂密，土壤主要為黃色森林土，間或有黃壤分布。表土層枯枝落葉層厚，腐殖質(zhì)豐富；氣候溫暖、涼爽、濕潤，是蕨類植物種類最豐富，群聚度較高的地段。

表2 大籽獼猴桃及其常見混淆品性狀鑒別要點

2.3.2 氣候條件 浙江地區(qū)（富陽、臨安、磐安、寧波）大籽獼猴桃生長地年平均氣溫在15.66～18.03 ℃，年均降水量在約1 565 mm；安徽地區(qū)（歙縣、黃山、休寧）大籽獼猴桃生長地年平均氣溫在7.7～19.2 ℃，年均降水量在995 mm；江西地區(qū)（武陵巖）大籽獼猴桃生長地年平均氣溫在18.0～20.6 ℃，年均降水量在1 635 mm；三地氣候特點均為雨熱同期。

2.3.3 土壤理化性質(zhì)分析 不同地區(qū)的大籽獼猴桃生長地的土壤理化狀況差別較大，見表3，江西地區(qū)土壤含水量大于安徽地區(qū)含水量；pH 差異不大，浙江與江西大籽獼猴桃生長地酸度較低；有機(jī)含量差異較大，尤其是安徽大籽獼猴桃生長地的有機(jī)含量最為豐富；氮、磷、鉀等無機(jī)元素在各個大籽獼猴桃生長地的數(shù)據(jù)差異明顯，安徽大籽獼猴桃種植地的全氮含量極高，是其他3 個地區(qū)的1～5 倍，表明該生長地土壤供氮水平較高，而浙江大籽獼猴桃生長地的供氮水平較低；另外，江西的土壤全磷含量較高，表明其富集磷的能力較強(qiáng)，相較而言浙江生長地的全磷含量較低，富集磷能力較弱；最后，全鉀含量浙江地區(qū)的土壤含量最高，與其余的幾個地區(qū)差異較大，其余地區(qū)全鉀含量維持在相對高的水平。

表3 大籽獼猴桃生長地土壤理化狀況（）

表3 大籽獼猴桃生長地土壤理化狀況（）

綜合各個地區(qū)測得的數(shù)據(jù)，認(rèn)為大籽獼猴桃生長地總體情況為土壤偏酸性、有機(jī)質(zhì)含量較高、土壤較潮濕，但土壤沙質(zhì)，又位于坡地，因此排水良好，對于土壤環(huán)境的要求不是特別高，土壤理化指標(biāo)范圍較大，適應(yīng)性相對較強(qiáng)，表明大籽獼猴桃的移栽、生長情況調(diào)控較容易。

2.4 EST-SSR 分子標(biāo)記篩選

2.4.1 EST-SSR 引物設(shè)計與合成 通過RNA-Seq 共開發(fā)了16 對大籽獼猴桃EST-SSR 引物。其中，二核苷酸重復(fù)聚首（5 個），占全部SSR 的31.3%；三核苷酸則為11 個，占68.8%?？梢娫诖笞勋J猴桃EST-SSR 中，三核苷酸占主導(dǎo)地位。同時，TC／CT 是二核苷酸重復(fù)中的優(yōu)勢基元，占二核苷酸重復(fù)基元的60%；三核苷酸中出現(xiàn)頻率較高的為GAA／AGA 和 AAG／GAG，均占三核苷酸重復(fù)基元的18.2%。

2.4.2 多態(tài)性引物篩選 采用16 對EST-SSR 引物對10 份大籽獼猴桃種質(zhì)DNA 及同屬近緣種進(jìn)行擴(kuò)增（大籽獼猴桃野生群體8 個及對萼獼猴桃群體1 個、黑蕊獼猴桃群體1個、小葉獼猴桃群體1 個）。舍棄產(chǎn)生條帶不清晰、不穩(wěn)定、多態(tài)性差或者條帶較為復(fù)雜而無法讀帶的引物，最終篩選出6 對EST-SSR 引物在10%的聚丙烯酰胺凝膠上能夠獲得清晰的擴(kuò)增條帶，成功率37.5%，見表4。其中，三核苷酸重復(fù)SSR 的成功率最高，為66.67%。6 對引物共擴(kuò)增出36 種條帶，平均每對引物能擴(kuò)增出6 種條帶。通過PIC 計算，AM-es03、AM-es06、AM-es09 為多態(tài)性EST-SSR（PIC≥0.10），多態(tài)性擴(kuò)增率為50%，對10 份供試材料的區(qū)分率達(dá)100%，占總引物數(shù)的18.75%。3 個多態(tài)性引物擴(kuò)增的多態(tài)性條帶為23 條，占6 對引物總擴(kuò)增條帶的63.89%；共檢測到37 個等位基因，每對引物可檢測到的等位基因數(shù)平均為12.3 個。

3 討論

使用PowerMarker 等軟件構(gòu)建UPGMA 聚類圖［13］。大籽獼猴桃EST-SSR 分子標(biāo)記在獼猴桃屬種質(zhì)遺傳多樣性分析中的應(yīng)用。3 個EST-SSR 分子標(biāo)記用于大籽獼猴桃野生群體8 個及對萼獼猴桃群體1 個、黑蕊獼猴桃群體1 個、小葉獼猴桃群體1 個的基因型分析。聚類分析采用NTSYSpc 2.1 軟件，該分析基于UPGMA 法計算遺傳相似性。選取根據(jù)UPGMA 聚類結(jié)果，基于鄰接法（NJ）和最大簡約法（MP）進(jìn)行測算，在遺傳相似系數(shù)為0.73 的水平上可將10 份獼猴桃群體材料聚為2 類，見圖2，其結(jié)果與傳統(tǒng)的形態(tài)分類大體一致［14］。

圖2 大籽獼猴桃及其近緣種傳統(tǒng)分類群UPGMA 聚類圖

表4 6 對大籽獼猴桃的EST-SSR 引物擴(kuò)增結(jié)果

凈果組中，大籽獼猴桃先聚為一類，來自富陽環(huán)山與浙江臨安的大籽獼猴桃被聚成一支，與安徽歙縣三陽、黃山九龍瀑及休寧的大籽獼猴桃較為接近；浙江磐安大盤山、寧波天童與江西武陵巖的大籽獼猴桃則稍遠(yuǎn)。上述結(jié)果與地理分布的區(qū)塊基本一致。而后，江西武寧的黑蕊獼猴桃、江西武寧的對萼獼猴桃、最終與8 份大籽獼猴桃聚為一類。而屬于星毛組的來自浙江臨安西天目山的小葉獼猴桃被明顯分開，提示該份種質(zhì)與其他種質(zhì)親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

綜上，本研究所篩選的EST-SSR 能夠?qū)⒋笞勋J猴桃種質(zhì)按照區(qū)域分開，并明顯區(qū)別于大籽獼猴桃藥材資源混淆品的常見同屬近緣種［15］，研究結(jié)果從分子水平上解釋了這些種質(zhì)資源的遺傳多樣性水平，展示了大籽獼猴桃ESTSSR 在大籽獼猴桃的種質(zhì)鑒定及評價上的良好通用性，以期為后續(xù)大籽獼猴桃的遺傳結(jié)構(gòu)、遺傳變異、藥材道地性分析奠定基礎(chǔ)。