吳倩蓮 劉佳佳 潘林梅 朱華旭

（1.南京中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江蘇南京 210023；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省植物藥深加工工程研究中心，江蘇南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué)江蘇省中藥資源產(chǎn)業(yè)化過(guò)程協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210023）

骨痹顆粒具有補(bǔ)肝腎、通經(jīng)絡(luò)的功效，臨床上用于治療骨關(guān)節(jié)炎［1-2］。骨痹顆粒［3］原方由桑寄生、川續(xù)斷、骨碎補(bǔ)、雞血藤等8 味中藥組成?？傸S酮為骨痹顆粒中的藥效成分之一，課題組在研究膜技術(shù)精制骨痹顆粒的過(guò)程中將其保留率作為指標(biāo)成分之一［4-5］，并在研究骨痹顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)桑寄生黃酮類成分進(jìn)行薄層鑒別［3］。為了更好地控制制劑質(zhì)量，本研究針對(duì)骨痹顆粒原方中君藥桑寄生展開(kāi)。

本研究收集不同產(chǎn)地、寄主、生長(zhǎng)狀態(tài)及加工方式的桑寄生藥材，建立指紋圖譜并測(cè)定槲皮苷的含量，初步探究影響指紋圖譜的藥材信息與色譜峰因素，以期為桑寄生及骨痹顆粒質(zhì)量提升研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Waters e2695 高效液相色譜系統(tǒng)（含四元泵溶劑系統(tǒng)、在線脫氣機(jī)和自動(dòng)進(jìn)樣器、Waters 2998 型紫外檢測(cè)器（PDA）（美國(guó)Waters 公司）；BSA224S-CW 電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司）；HC-C6002 型電子天平（慈溪市華徐衡器實(shí)業(yè)有限公司）；EPED-E2-20TS 實(shí)驗(yàn)室級(jí)超純水器（南京易普易達(dá)科技發(fā)展有限公司）；KH-250B 型超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑與藥物 乙腈、甲醇（德國(guó)默克公司）；水為超純水；磷酸（分析純，西隴科技股份有限公司）。原兒茶酸（南京良緯生物科技有限公司，批號(hào)lw18012207）；（+）-兒茶素（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)PO2A9F57645）；槲皮苷（批號(hào)111538-201606）、蘆?。ㄅ?hào)100080-201810）、槲皮素（批號(hào)100081-201610），均購(gòu)于中國(guó)食品藥品檢定研究院；萹蓄苷（金益柏生物科技有限公司，批號(hào)16060806）；桑寄生藥材，信息見(jiàn)表1。

表1 桑寄生藥材信息

2 方法

2.1 桑寄生指紋圖譜建立

2.1.1 色譜條件 Agilent ZORBX SB-C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 磷酸水溶液（B），洗脫梯度（0～6 min，2%～8%A；6～10 min，8%～10%A；10～15 min，10%～12%A；15～25 min，12%～16%A；25～45 min，16%～30% A；45～50 min，30%～36% A；50～53 min，36% A；53～55 min，36%～43% A；55～60 min，43%～56% A；60～62 min，56%～60% A；62～65 min，60%～2% A；65～70 min，2% A）；檢測(cè)波長(zhǎng)225 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)按槲皮苷峰計(jì)算應(yīng)不低于10 000。

2.1.2 對(duì)照品溶液制備 分別取原兒茶酸、（+）-兒茶素、萹蓄苷、槲皮苷、槲皮素對(duì)照品適量，精密稱定，各加甲醇制成每1 mL 含0.10 mg 的溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 精密稱定1.0 g 藥材粗粉，加入50%甲醇-水溶液30 mL，超聲（200 W，40 kHz）提取30 min，離心，取上清液過(guò)0.45 μm 微孔濾膜，即得。

旅游紀(jì)念品長(zhǎng)“同一張臉”，不僅會(huì)讓游客產(chǎn)生審美疲勞，且不利于推廣各個(gè)景區(qū)的獨(dú)特旅游價(jià)值。尤其是同質(zhì)化、低端化、地?cái)偦穆糜渭o(jì)念品會(huì)大大拉低國(guó)人的旅游購(gòu)物消費(fèi)。據(jù)統(tǒng)計(jì)，旅游購(gòu)物在歐美國(guó)家占旅游業(yè)收入的50%到60%，在亞洲發(fā)達(dá)國(guó)家占40%以上，而在我國(guó)目前只占28%，國(guó)內(nèi)外游客對(duì)旅游商品的滿意度可見(jiàn)一斑。

2.1.4 方法學(xué)考察

2.1.4.1 精密度試驗(yàn) 取S9 供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄色譜圖。以槲皮苷色譜峰為參照，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于0.5%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.4.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9 供試品溶液，每隔3 h 進(jìn)樣一次，共測(cè)定18 h，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，以槲皮苷色譜峰為參照，測(cè)得各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于2.5%，相對(duì)峰面積RSD 均小于3.0%，表明供試品溶液在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 取S9 樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，分別在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，記錄色譜圖，以槲皮苷色譜峰為參照，測(cè)得各共有峰相對(duì)保留時(shí)間RSD 均小于1.5%，相對(duì)峰面積RSD 均小于4.5%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.5 指紋圖譜建立 取11 批樣品，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，并在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣，收集色譜圖。圖譜導(dǎo)入國(guó)家藥典委員會(huì)推薦的中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A 版，設(shè)S9 樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正后自動(dòng)匹配，對(duì)11 批不同樣品的指紋圖譜及與生成的對(duì)照指紋圖譜進(jìn)行相似度分析。

2.2 槲皮苷含量測(cè)定

2.2.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 同“2.1.1”項(xiàng)下方法；檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。

2.2.2 供試品溶液制備 同“2.1.3”項(xiàng)下方法。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 線性關(guān)系考察 對(duì)照品母液制備，取槲皮苷對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容，制備成1 mL 含1 mg 槲皮苷對(duì)照品溶液。精密吸取對(duì)照品母液5.0 mL，置于10 mL 量瓶中，用甲醇定容，并逐級(jí)對(duì)半稀釋，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣。以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得槲皮苷回歸方程Y＝25 493 401X+181 920（r ＝0.999 9），在0.312 5～10.000 0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.2.3.2 精密度試驗(yàn) 取S9 供試品溶液與槲皮苷對(duì)照品，在“2.1.1”項(xiàng)條件下連續(xù)進(jìn)樣6 次，每次10 μL，記錄色譜圖，測(cè)得槲皮苷峰面積RSD 分別為0.47%、0.92%，表明儀器精密度良好。

2.2.3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取S9 供試品溶液與槲皮苷對(duì)照品，在“2.1.1”項(xiàng)條件下，每隔3 h 進(jìn)樣1 次，共測(cè)定18 h，分別進(jìn)樣10 μL，記錄色譜圖，測(cè)得槲皮苷峰面積RSD 分別為0.33%、0.54%，表明供試品及對(duì)照品溶液中槲皮苷在18 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn) 按“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備6份S9 供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL 分析，記錄色譜圖，測(cè)得槲皮苷峰面積RSD 為0.54%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.3.5 加樣回收率試驗(yàn) 平行精密稱取6 份S9 樣品，加入一定量槲皮苷對(duì)照品溶液按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下進(jìn)樣10 μL 分析，記錄色譜圖，測(cè)得槲皮苷的回收率分別為100.18%、99.64%、100.32%、102.12%、102.64%、102.84%，平均回收率101.29%。

3 結(jié)果

3.1 特征圖譜建立 設(shè)S9 樣品圖譜作為參照?qǐng)D譜，采用平均數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.1，生成對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖1，在桑寄生藥材特征圖譜中建立24 個(gè)特征峰。與槲皮苷參照峰相應(yīng)的峰為S 峰，計(jì)算各特征峰與S 峰的相對(duì)保留時(shí)間，其相對(duì)保留時(shí)間應(yīng)在規(guī)定值的±5%之內(nèi)。規(guī)定值為0.16（峰4）、0.30（峰9）、0.39（峰10）、0.43（峰11）、0.46（峰12）、0.48（峰13）、0.64（峰15）、0.66（峰16）、0.72（峰17）、0.74（峰18）、0.86（峰20）、0.90（峰21）、0.93（峰22）、0.98（峰23）。采用對(duì)照品比對(duì)法結(jié)合紫外吸收光譜可指認(rèn)峰9 為原兒茶酸，峰12 為（+）-兒茶素，峰20 為蘆丁，峰23 為萹蓄苷，峰24 為槲皮苷。

圖1 桑寄生特征圖譜

3.2 相似度評(píng)價(jià) 經(jīng)多點(diǎn)校正后對(duì)11 批樣品指紋圖譜進(jìn)行匹配，僅得到2 個(gè)共有峰，見(jiàn)圖2，相似度見(jiàn)表2。

圖2 11 批樣品HPLC-PDA 指紋圖譜

表2 桑寄生藥材指紋圖譜相似度與含量

11 批藥材相似度為0.366～0.871，均小于0.9，表明藥材差異大。11 批樣品指紋圖譜中，僅找到2 個(gè)共有峰，共有峰數(shù)目少，主要由個(gè)別樣品引起，S3、S10 在0～25 min部分色譜峰較少，S1、3、11 在25～40 min 部分色譜峰較少。

3.3 槲皮苷含量 將11 批樣品按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)條件下（檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm）進(jìn)樣分析，平行3 次，計(jì)算各批樣品中槲皮苷的平均含量及RSD。表2 顯示，槲皮苷含量最高達(dá)0.551 4%，最低0.007 8%，具有較大差異。采用SPSS 24.0 軟件，經(jīng)Explore 過(guò)程檢驗(yàn)其平均含量正態(tài)分布，設(shè)置信區(qū)間為95%，依據(jù)ShapiroWilk 法檢驗(yàn)，結(jié)果為P ＝0.237＞0.05，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明各批槲皮苷含量呈正態(tài)分布。

4 討論與分析

4.1 檢測(cè)波長(zhǎng) 采用二極管陣列在200～400 nm 范圍內(nèi)進(jìn)行紫外全波長(zhǎng)掃描，得到3D 峰形-時(shí)間圖譜，從整體上看，225 nm 波長(zhǎng)下整體色譜峰吸收強(qiáng)烈，色譜信息豐富，桑寄生中主要為黃酮類成分，360 nm 下槲皮苷成分色譜峰面積穩(wěn)定。與水以及甲醇相比，桑寄生中成分用50%甲醇-水提取的效果更佳，基線噪音小，對(duì)色譜峰干擾小。

4.2 指標(biāo)成分選擇 桑寄生中多含黃酮類、生物堿、生物堿、氨基酸等成分，曾有報(bào)道含有兒茶類成分，寄主不同，糖苷類含量具有一定差異。本研究采用PDA 全波長(zhǎng)掃描檢測(cè)全程色譜峰紫外吸收光譜，60%以上色譜峰表現(xiàn)出黃酮類紫外吸收光譜特點(diǎn)。黃酮類成分主要為槲皮苷、萹蓄苷等，是桑寄生的主要活性成分，有研究表明槲皮苷是桑寄生歸肝、腎經(jīng)與祛風(fēng)濕功效的重要物質(zhì)基礎(chǔ)［14-18］，故將槲皮苷作為含量檢測(cè)對(duì)象。另外，文獻(xiàn)曾有報(bào)道桑寄生檢測(cè)出槲皮素［11］，曹越等［19］將槲皮素作為桑寄生指紋圖譜的特征性成分之一，但本研究中僅S11 檢測(cè)出少量槲皮素，大部分黃酮類以槲皮苷形式存在，與蘇本偉等［18］報(bào)道一致。

4.3 聚類分析 將特征峰響應(yīng)值導(dǎo)入SPSS 24.0，采用系統(tǒng)聚類法，方法組間聯(lián)接，平均歐式距離為測(cè)量區(qū)間。聚類樹(shù)狀圖分為2 個(gè)主支，S6～S9 為非野生品種，聚在一起，其余為另外一支，均為非野生品種。下支S3～S5 相聚，S1～S2、S10～S11 相聚，其中S5 為桑樹(shù)寄主，而S3～S4 非桑樹(shù)寄主，但S3 與S5 更為相似，表明寄主差異對(duì)桑寄生特征峰面貌影響較低；另外，S10～S11 產(chǎn)于海南，與產(chǎn)于廣西的S1～S2 區(qū)分開(kāi)，表明一定程度上可區(qū)分產(chǎn)地。初步推測(cè)影響桑寄生特征峰整體面貌的因素①生長(zhǎng)狀態(tài)（野生／非野生）；②寄主（桑樹(shù)寄主／雜寄生）；③產(chǎn)地，且其影響程度可能為生長(zhǎng)狀態(tài)＞產(chǎn)地因素＞寄主因素。見(jiàn)圖3。

圖3 聚類分析圖

4.4 主成分分析 為研究影響桑寄生藥材特征峰面貌的主要成分，將響應(yīng)值數(shù)據(jù)采用SPSS 24.0 進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理?？偡讲罱忉尳Y(jié)果見(jiàn)表3。

表3 總方差分析

前4 個(gè)主成分特征值均大于1，對(duì)總方差的貢獻(xiàn)率達(dá)90.434%，即累積對(duì)桑寄生特征峰整體面貌的貢獻(xiàn)為90.434%，因此選擇前4 個(gè)主成分進(jìn)行分析，將得到的成分矩陣進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化處理，經(jīng)過(guò)方差最大正交旋轉(zhuǎn)后，得到旋轉(zhuǎn)后因子負(fù)荷矩陣。

將矩陣導(dǎo)入SIMCA 14，繪制橢圓得分圖，見(jiàn)圖4。以色譜峰為研究對(duì)象，以經(jīng)過(guò)橢圓中心（0，0）點(diǎn)的兩垂直坐標(biāo)軸為基準(zhǔn)，綜合考察色譜峰對(duì)應(yīng)點(diǎn)與兩坐標(biāo)軸的距離，垂直距離越遠(yuǎn)，代表其對(duì)區(qū)分不同批樣品的貢獻(xiàn)越大，即對(duì)桑寄生特征峰整體面貌的影響作用越大。結(jié)果見(jiàn)圖4，表明9、6、24、23 號(hào)峰是影響桑寄生整體面貌的特征峰，其中原兒茶酸、槲皮苷及萹蓄苷的含量對(duì)表現(xiàn)桑寄生整體面貌具有意義。

表4 旋轉(zhuǎn)后因子負(fù)荷矩陣

圖4 22 批樣品主成分分析圖

5 結(jié)論與展望

本研究建立了桑寄生藥材指紋圖譜與含量測(cè)定方法，對(duì)主要色譜峰進(jìn)行指認(rèn)，通過(guò)聚類分析與主成分分析研究影響桑寄生特征峰面貌的因素（生長(zhǎng)狀態(tài)、產(chǎn)地、寄主）及主要色譜峰（原兒茶酸、槲皮苷、萹蓄苷），以期為研究桑寄生質(zhì)量及骨痹顆粒成方制劑質(zhì)量穩(wěn)定提供基礎(chǔ)。精制后的骨痹方藥液能改善炎癥并促軟骨細(xì)胞增殖［19］，桑寄生化學(xué)成分繁多復(fù)雜，藥效成分眾多，藥理作用廣泛，要建立全面的科學(xué)的藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)體系，針對(duì)桑寄生單味藥以及有效成分群進(jìn)行細(xì)胞水平生物藥效研究，以期為進(jìn)一步提高骨痹顆粒質(zhì)量與臨床合理用藥提供參考。