包瑞玲 ，劉文濱 ，丁瑞峰，黎 敏，趙麗紅，段姝婷，張 玲

（1.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院，內(nèi)蒙古包頭 014000；2.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院中醫(yī)科，內(nèi)蒙古包頭 014010；3.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院消化科，內(nèi)蒙古包頭 014010；4.內(nèi)蒙古科技大學包頭醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院心功能科，內(nèi)蒙古包頭 014010）

消化不良是臨床上最常見的癥狀之一，在眾多的患者中，僅有較少的消化不良患者存在器質(zhì)性損害，大多數(shù)患者考慮為功能性消化不良。功能性消化不良（functional dyspepsia，F(xiàn)D）被定義為來自胃和十二指腸區(qū)域的臨床癥狀，多表現(xiàn)為惡心、嘔吐、餐后飽脹感、上腹痛等癥狀，并且排除可以解釋這些癥狀的器質(zhì)性改變及代謝性異常。FD 全球的發(fā)病率為11.5%～29.2%，亞洲地區(qū)約為8%～23%［1］。而且FD 患者常常伴隨有抑郁、焦慮及軀體化障礙等精神心理障礙，存在異常的人格特征，多有負性生活事件和生活應激事件的經(jīng)歷。部分學者研究發(fā)現(xiàn)舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利片可有效改善FD 患者臨床癥狀，本實驗通過建立FD 大鼠模型，予以舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利片干預，觀察其對大鼠體質(zhì)量、胃殘留率、胃黏膜促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（CRF）及干細胞因子受體（C-KIT）表達的影響。

1 材料

1.1 動物 30 只健康雄性Wistar 大鼠，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學實驗動物中心提供［許可證號SCXK（蒙）2015-0001］，體質(zhì)量（160±20）g；動物房溫度22～24 ℃。

1.2 藥物與試劑 舒肝解郁膠囊（四川濟生堂藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號Z20174037，0.36 g／粒）；枸櫞酸莫沙必利分散片（魯南制藥有限公司生產(chǎn)，批號H20031110，5 mg／片）；CRF 抗體（英國abcam 公司，貨號ab8901）；C-KIT 抗體（南昌英俊科技開發(fā)有限公司，貨號AF4701）。

2 方法

2.1 造模與分組 夾尾刺激+不規(guī)律飼養(yǎng)法［2］造模。30 只Wistar 雄性大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，隨機分為空白組、模型組、舒肝解郁+莫沙必利組，每組10 只?？瞻捉M不加任何干預，自然飼養(yǎng)，其余各組依照上述造模方法處理，造模1 周。造模結(jié)束后，空白組、模型組每只大鼠以生理鹽水1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁+莫沙必利組以莫沙必利1.37 mg／kg、1 mL／100 g 灌胃；舒肝解郁膠囊以15 mg／mL、1 mL／100 g 灌胃，大鼠與人臨床用藥劑量、體型系數(shù)公式［dB＝dA×RB／RA×（WA／WB）／3］）分別配制懸濁液。每周測量大鼠體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整用藥劑量。

2.2 體質(zhì)量 記錄造模期間大鼠體質(zhì)量變化。

2.3 胃殘留率測定實驗第21 天，各組大鼠禁食不禁水24 h，每只大鼠予1 mL／100 g 營養(yǎng)半固體米糊（10 g 羧甲基纖維素鈉、16 g 奶粉、8 g 糖、8 g 淀粉及250 mL 蒸餾水共同配制）灌胃，40 min 后予20% 烏拉坦（1 mL／100 g）腹腔麻醉后進行開腹，將大鼠腸胃分離，結(jié)扎賁門和幽門取胃，濾紙吸干水分稱胃全重（m1），沿胃大彎側(cè)剪開，去除胃內(nèi)容物，PBS 緩釋液清洗胃，濾紙吸干，稱得胃凈重（m2），胃內(nèi)殘留物質(zhì)量占營養(yǎng)半固體米糊質(zhì)量的百分比為胃殘留率，測胃殘留率＝ ［（m1-m2）／營養(yǎng)半固體米糊質(zhì)量］×100%。

2.4 觀察各組大鼠胃黏膜CRF、C-KIT 的表達情況

2.4.1 Western blot 距幽門0.5 cm 處取2 塊胃竇壁組織（1 cm×1 cm），分別裝入4%甲醛容器及凍存管中保存，將凍存管迅速放置液氮罐中等待檢測。將組織從液氮中取出，裂解提取蛋白，BCA 法測定蛋白濃度、制膠及上樣、電泳、蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移和膜封閉、抗原抗體反應、顯影、漂洗、定影、最后清水沖洗晾干保存、掃描，用IPP 軟件對掃描圖象的目的條帶進行灰度分析。

2.4.2 免疫組化 取材，固定，脫水浸蠟，包埋，切片，撈片，烤片，微波爐抗原修復—滴加5% BSA 封閉液，室溫20 min；滴加適當稀釋的一抗，4 ℃過夜，PBS（pH 7.4）洗3 次，2 min／次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，室溫20 min，PBS 洗；滴加試劑SABC，室溫20 min，PBS 洗4 次，5 min／次；DAB 顯色，蘇木素輕度復染，在通風櫥中晾干后，中性樹膠封片—顯微拍照。每張切片選擇互不重疊的視野在顯微鏡下觀察，測定單位面積的陽性細胞數(shù)表達（平均光密度），代表其表達情況。具有臨床病理工作5 年以上經(jīng)驗的兩名病理醫(yī)生閱片。

2.5 統(tǒng)計學分析 所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 25.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析，首先進行方差齊性、正態(tài)分布檢驗，計量資料以（）表示，多組間比較選用單因素方差分析，方差齊時選用LSD 檢驗，方差不齊時選用非參數(shù)cruskalwallis 檢驗；P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠體質(zhì)量變化值及胃殘留率 與空白組比較，模型組體質(zhì)量下降（P＜0.05），與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組體質(zhì)量上升（P＜0.05），見表1；與空白組比較，模型組胃殘留率升高（P＜0.05），提示模型組胃動力減弱；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃殘留率下降（P＜0.05），見表2，符合FD 大鼠模型。

表1 各組大鼠體質(zhì)量差值比較（g，，n＝10）

表1 各組大鼠體質(zhì)量差值比較（g，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

表2 各組大鼠胃殘留率比較（%，，n＝10）

表2 各組大鼠胃殘留率比較（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3.2 胃黏膜CRF 表達情況 與空白組比較，模型組、舒肝解郁+莫沙必利組胃CRF 表達升高（P＜0.05）；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃CRF 的表達降低（P＜0.05），見表3～4、圖1。

表3 Western blot 檢測各組大鼠胃CRF 表達（%，，n＝10）

表3 Western blot 檢測各組大鼠胃CRF 表達（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

3.3 胃黏膜C-KIT 表達情況 與空白組比較，模型組、舒肝解郁+莫沙必利組胃C-KIT 表達降低（P ＜0.05）；與模型組比較，舒肝解郁+莫沙必利組胃C-KIT 的表達升高（P＜0.05），見表5～6、圖2。

表4 免疫組化法檢測各組大鼠胃黏膜CRF 表達比較（μm，，n＝10）

表4 免疫組化法檢測各組大鼠胃黏膜CRF 表達比較（μm，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

表5 Western blot 檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（%，，n＝10）

表5 Western blot 檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（%，，n＝10）

注：與空白組比較，?P ＜0.05；與模型組比較，▲P ＜0.05。

圖1 Western blot 檢測各組大鼠胃竇組織CRF 蛋白表達

表6 免疫組化法檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（μm，，n＝10）

表6 免疫組化法檢測各組大鼠胃C-KIT 的表達（μm，，n＝10）

注：與空白組比較，?P＜0.05；與模型組比較，▲P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測各組大鼠胃竇組織C-KIT 蛋白表達

4 討論

FD 是多種因素參與的疾病，其中胃十二指腸動力異常、內(nèi)臟高敏感、精神因素是其公認的發(fā)病機制［3］。目前部分學者將舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利用于功能性胃腸病治療中。舒肝解郁膠囊由刺五加及貫葉金絲桃組成，貫葉金絲桃是目前國內(nèi)外報道最多、作用機制最明確的抗抑郁單方中藥，主要用于輕中度抑郁患者的治療［4-6］。莫沙必利為選擇性5-HT4受體激動劑，通過興奮胃腸道膽堿能中間神經(jīng)元及肌間神經(jīng)叢5-HT4受體，促進乙酰膽堿釋放，增加胃蠕動，促進胃排空。舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利可有效改善FD 患者臨床癥狀，降低復發(fā)率［7-8］。本實驗應用夾尾及不規(guī)律飲食法制備FD 大鼠模型，模型組大鼠體質(zhì)量下降，胃殘留率增加。應用舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利治療，F(xiàn)D 大鼠體質(zhì)量增加，胃殘留率下降，有效改善FD 大鼠病癥。

內(nèi)臟高敏感是導致FD 發(fā)生的重要發(fā)病機制之一。研究顯示約34%～64% FD 患者存在對胃擴張的高敏感［9-12］。Caldarella 等［13］研究發(fā)現(xiàn)FD 患者不僅對胃底擴張的敏感性增強，而且對胃竇擴張呈現(xiàn)出高敏狀態(tài)。而在應激反應中CRF 起著舉足輕重的作用，CRF 是一種重要的神經(jīng)內(nèi)分泌肽，主要分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中與應激反應相關(guān)的區(qū)域，也存在于如胃腸道等外周區(qū)域。CRF 通過迷走中樞及外周途徑參與了胃腸道應激反應過程［14］，可抑制副交感神經(jīng)和提高交感神經(jīng)活動，是調(diào)解下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)系統(tǒng)的關(guān)鍵。在慢性應激小鼠中CRF 含量增高，經(jīng)治療后CRF濃度降低，胃排空率增加，從而減弱內(nèi)臟敏感性［15-16］。FD大鼠胃CRF 陽性細胞表達數(shù)較空白組增高。予以舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利片治療后，胃CRF 陽性細胞數(shù)及WB 表達明顯下降。舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利對FD 大鼠病癥治療效果明顯，其作用機制可能是通過下調(diào)胃CRF 的表達，減弱內(nèi)臟高敏感相關(guān)。

Cajal 間質(zhì)細胞（ICC）作為胃腸道的慢性起搏細胞，分布在胃腸道的各個部位，越來越多的研究表明，Cajal 間質(zhì)細胞的減少可導致胃腸道動力障礙［17-18］。而幾乎所有ICC 都特異性表達C-KIT 受體［19］，C-KIT 受體又稱干細胞因子受體，干細胞因子（SCF）與C-KIT 通過胞外結(jié)構(gòu)域1～3 區(qū)結(jié)合后激活一系列的信號分子，從而調(diào)節(jié)ICC 的增值、分化、發(fā)育和結(jié)構(gòu)的完整性［20-21］，C-KIT 的表達下降可導致ICC 表型轉(zhuǎn)化異常，失去相應的功能［22］。本實驗表明舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利片可上調(diào)C-KIT 的表達，改善胃動力，促進胃排空，達到治療功能性消化不良的目的。也有研究發(fā)現(xiàn)C-KIT 的過度激活導致ICC 發(fā)生變化可能是胃腸道內(nèi)臟敏化發(fā)生的重要的基礎［23-25］。本實驗驗證舒肝解郁膠囊聯(lián)合莫沙必利對功能性消化不良病癥具有明顯治療意義，以期為舒肝解郁膠囊的臨床應用提供理論依據(jù)。