李亞玲 李俊杰董娟娟李高勤展文華舍雅莉劉永琦?
(1.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),甘肅省高校重大疾病分子醫(yī)學(xué)與中醫(yī)藥防治研究省級重點實驗室,甘肅蘭州 730000;2.敦煌醫(yī)學(xué)與轉(zhuǎn)化省部共建教育部重點實驗室,甘肅蘭州 730000;3.甘肅中醫(yī)藥大學(xué),基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院,甘肅蘭州 730000)
化療誘發(fā)的消化道黏膜炎是接受化療的患者中最常見的并發(fā)癥[1],可導(dǎo)致潰瘍、疼痛、胃腸道出血等,是癌癥患者治療延遲、住院時間延長、治療費用和死亡率增加的主要原因之一[2]。消化道黏膜炎的確切機制尚不清楚,可能與氧化應(yīng)激、炎性因子釋放、腸道免疫和腸道微生態(tài)等多種原因有關(guān)。目前對黏膜炎的治療以對癥治療為主,包括黏膜保護劑、抗生素、止痛、局部抗菌藥物和冷凍療法等[3],但臨床效果不容樂觀。近年來中醫(yī)藥在緩解化療引起的胃腸副作用方面展現(xiàn)出較好的療效。敦煌平胃丸(平胃丸)出自敦煌古書《不知名氏辨脈法》,甘肅省名中醫(yī)王道坤教授將此方進行加減研發(fā)的萎胃靈膠囊在治療慢性萎縮性胃炎及防癌變方面取得顯著臨床效果,在胃癌患者術(shù)后恢復(fù)中也可減輕放/化療引起的消化道反應(yīng)[4-5]。采用敦煌平胃丸干預(yù)順鉑誘導(dǎo)腸道黏膜炎小鼠,觀察療效并從腸屏障和炎性因子角度初步探討機制。
1.1 動物 C57BL/6(甘肅中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心,許可證號SCXK(甘)2018-0022),SPF 級,雌雄各半,周齡6 周左右,體質(zhì)量18~20 g,共24 只。
1.2 藥物 敦煌平胃丸由大黃、苦參、干姜、藁本、附子、防風(fēng)、桔梗、土鱉蟲、人參、玄參、當(dāng)歸組成,甘肅省中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥房提供中藥飲片。順鉑(合肥巴斯夫生物科技有限公司,批號BSF190225,50 mg/支),0.9%NaCl 配制備用,按照30 mg/kg 在小鼠進行腹腔注射。
1.3 試劑與儀器 ZO-1 抗體、Occludin 抗體、總RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、IL-6 和TNF-α ELISA 試劑盒購自美國Gene Tex 公司。OlymPus IX-81 型熒光倒置相差顯微鏡(日本Olympus 公司)。
2.1 敦煌平胃丸水煎液的制備 按照“1.2”項下敦煌平胃丸中藥飲片用蒸餾水浸泡1 h 后,武火煮沸,文火煎煮1 h,重復(fù)2 次,合并煎煮液,水浴鍋濃縮至100 mL,質(zhì)量濃度為6 g/mL,儲存在4 ℃冰箱備用。
2.2 分組與給藥 小鼠隨機分為對照組、平胃丸組、順鉑組、順鉑+平胃丸組,每組6 只。順鉑組于實驗第3、6、9天分別經(jīng)腹腔注射30 mg/kg 順鉑;平胃丸組每天1 次管飼法喂平胃丸30 g/kg(相當(dāng)于臨床用量),連續(xù)10 d,并于實驗第3、6、9 天經(jīng)腹腔注射0.9%NaCl 30 mL/kg;順鉑+平胃丸組每天1 次管飼法喂平胃丸30 g/kg,連續(xù)灌胃10 d,并于實驗第3、6、9 天經(jīng)腹腔注射順鉑30 mL/kg;對照組每天管飼法喂生理鹽水1 mL,實驗第3、6、9 天經(jīng)腹腔注射生理鹽水30 mL/kg。于第11 天將所有小鼠麻醉后取腸道。
2.3 腹瀉評分 實驗開始后,隔天監(jiān)測小鼠的一般狀況、體質(zhì)量及腹瀉等情況。根據(jù)Bowen 評分系統(tǒng)[6],根據(jù)糞便的稠度對腹瀉的嚴(yán)重程度進行量化。0 為正常大便;1 為輕微濕軟的大便,表示輕度腹瀉;2 為濕和不規(guī)則的大便,表示中度腹瀉;3 為水樣大便,表示嚴(yán)重腹瀉。
2.4 小腸病理組織學(xué)評價 將來自空腸近端和回腸遠(yuǎn)端的腸樣品固定在4%福爾馬林緩沖液中,常規(guī)石蠟包埋并切片,采用HE 染色法,光學(xué)顯微鏡下觀察各組切片病理情況。在100 倍鏡下選擇10 個絨毛和隱窩用于絨毛高度和隱窩深度測量。在200 倍鏡下對腸道損傷進行評分,具體評分指標(biāo)為(1)隱窩上皮細(xì)胞變性程度,(2)絨毛上皮細(xì)胞變形壞死程度,(3)固有層中炎細(xì)胞浸潤和水腫程度。使用半定量評分,0 為無,1 為輕度,2 為中度,3 為嚴(yán)重,每個腸道區(qū)域的最大得分為9[7]。
2.5 免疫組化分析 將低聚甲醛固定的腫瘤組織切片(厚4 μm)固定在載玻片上進行免疫組化染色,按照試劑盒說明書加入按比例稀釋的一抗ZO-1(1 ∶200)和Occludin(1 ∶100),用PBS 代替一抗進行陰性對照,二抗用辣根過氧化物酶標(biāo)記,DAB 顯色。采用Image-Pro Plus 6.0 圖像分析軟件對結(jié)果進行判定,每張切片在400 倍下隨機選取5個視野,對視野內(nèi)棕黃色陽性信號進行圖像分析,測定平均積分吸光度值(AOD)。
2.6 ELISA 檢測 按照ELISA 試劑盒說明書方法檢測空腸組織中TNF-α、IL-6 和sIgA 的水平。稱取空腸組織50 mg,采用0.5%HTBA 溶液制成5%的勻漿,4 ℃以1 500 r/min離心15 min 取上清。
2.7 RT-PCR 檢測 用Trizol 法提取空腸組織的總核糖核酸(RNA),逆轉(zhuǎn)錄法合成互補脫氧核糖核酸(cDNA),保存于-80 ℃?zhèn)溆谩TO(shè)計引物(表1),在常規(guī)反應(yīng)體系中進行并擴增,得到ZO-1、 occludin 基因和內(nèi)參基因的Ct 值,采用2—ΔΔCt法計算occludin 和ZO-1 mRNA 相對表達(dá)量。
表1 引物信息
2.8 統(tǒng)計學(xué)方法 用GraPh Pad Prism 8.0 進行統(tǒng)計分析和作圖。計量資料用()表示,兩組間比較用t 檢驗,多組間比較用單因素方差分析。 P <0.05 差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
3.1 敦煌平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠體質(zhì)量和腹瀉的影響 與對照組比較,順鉑組小鼠于實驗第3 天開始進食減少、行動減少、精神較差、出現(xiàn)抱團現(xiàn)象、體質(zhì)量下降(P<0.01),于實驗第5 天開始腹瀉(P<0.01),且隨著用藥時間的延長,體質(zhì)量下降和腹瀉現(xiàn)象均加重。順鉑與平胃丸聯(lián)合使用組小鼠體質(zhì)量比較對照組也下降(P<0.01),但與順鉑組比較,平胃丸改善了順鉑引起的體質(zhì)量下降和腹瀉(P<0.05),平胃丸在用藥1 周后顯現(xiàn)出對順鉑誘發(fā)小鼠腹瀉的緩解作用。見圖1~2。
圖1 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠體質(zhì)量的影響(,n=6)
圖2 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠腹瀉的影響(,n=6)
3.2 敦煌平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響 順鉑導(dǎo)致空腸和回腸黏膜結(jié)構(gòu)破環(huán),絨毛上皮變性、壞死和脫落,高度下降(P<0.01);隱窩上皮變性壞死,隱窩擴張、深度增加(P<0.01),部分隱窩充血和粘液積聚;固有層明顯水腫和炎細(xì)胞浸潤。以上形態(tài)學(xué)改變在空腸更為明顯。平胃丸可減緩順鉑引起的小腸結(jié)構(gòu)破壞,減輕絨毛和隱窩上皮的變性壞死及固有層的水腫和炎癥,增加絨毛高度(P<0.01),減輕隱窩擴張(P<0.01)。見圖3~4。
3.3 敦煌平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸屏障相關(guān)mRNA 和蛋白的影響 與對照組比較,順鉑減少空腸黏膜上皮屏障因子occludin 和ZO-1 的蛋白和mRNA 的表達(dá)(P<0.01),平胃丸可改善順鉑導(dǎo)致的空腸黏膜屏障破壞(P<0.01)。見圖5、表2。
圖3 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠小腸形態(tài)學(xué)的影響(HE,×200)
圖4 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠小腸絨毛高度和隱窩深度的影響(,n=6)
表2 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸黏膜Occludin 和ZO-1 的影響(,n=6)
表2 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸黏膜Occludin 和ZO-1 的影響(,n=6)
注:與對照組比較,?P<0.05,??P<0.01;與順鉑組比較,ΔP<0.05,ΔΔP<0.01。
3.4 敦煌平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸炎癥和免疫因子的影響 與對照組比較,順鉑增加空腸組織中IL-6和TNF-α 水平(P<0.01),平胃丸可改善順鉑導(dǎo)致的空腸組織IL-6 和TNF-α 的上調(diào)(P<0.01)。與對照組比較,順鉑組小鼠空腸組織中sIgA 水平減少(P<0.01),平胃丸可改善這種情況(P<0.01);與順鉑組比較,順鉑+平胃丸組小鼠空腸IL-6、TNF-α 水平下降,sIgA 水平升高。見表3。
圖5 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸黏膜occludin 和ZO-1 的影響(ICH,×200)
表3 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸IL-6、TNF-α 和sIgA 的影響(,n=6)
表3 平胃丸對順鉑誘發(fā)腸道黏膜炎小鼠空腸IL-6、TNF-α 和sIgA 的影響(,n=6)
注:與對照組比較,?P<0.05,??P<0.01;與順鉑組比較,ΔΔP<0.01。
順鉑是臨床常用的化療藥,消化道黏膜炎是其常見的不良反應(yīng)。Al-Dasooqi 等[8]提出了黏膜炎過程中的五個重要生物學(xué)步驟為初始—誘發(fā)炎癥—炎癥信號級聯(lián)倍增—潰瘍形成—愈合?;煂δc黏膜的直接損傷會釋放炎癥因子,導(dǎo)致腸絨毛和隱窩上皮細(xì)胞變性、壞死等,緊密連接蛋白減少,腸黏膜屏障功能下降,通透性增加。腸黏膜是抵抗病原微生物入侵的屏障,屏障功能的喪失使細(xì)菌易位并觸發(fā)促炎性級聯(lián)反應(yīng),促發(fā)黏膜炎。故腸屏障的破壞及炎癥相關(guān)信號通路的激活及級聯(lián)放大是引起黏膜炎主要原因[9]。sIgA 是腸黏膜免疫的重要因子,它是防御病原菌在腸道黏膜黏附和定植的第一道防線,當(dāng)腸黏膜上皮表面免疫活性細(xì)胞受到細(xì)菌黏附素刺激時,黏附局部產(chǎn)生sIgA,阻止腸道微生物及其毒素分子對腸黏膜的攻擊,而sIgA 的減少降低了對細(xì)菌的防御作用,也可促進黏膜炎的發(fā)生[9]。本研究顯示順鉑誘發(fā)的C57BL/6 小鼠腸道黏膜炎模型中,小鼠體質(zhì)量下降、攝食減少、腹瀉較為嚴(yán)重,小腸(尤其空腸)形態(tài)學(xué)改變明顯,故進一步檢測了空腸屏障及炎性改變,可見腸屏障相關(guān)蛋白及mRNA 水平均下降,IL-6 和TNF-α 炎癥因子顯著上調(diào),小腸sIgA 分泌減少。故認(rèn)為順鉑誘發(fā)的腸道黏膜炎與破環(huán)腸道屏障、誘發(fā)炎癥因子的產(chǎn)生和降低腸道免疫功能有關(guān)。
目前盡管在化學(xué)療法誘發(fā)的腸黏膜炎上采用了許多策略,但是僅限于緩解疼痛、止瀉藥和控制感染,但療效有限。研究顯示中草藥在輔助治療癌癥中有減毒增效的作用[10]。中醫(yī)認(rèn)為,化療藥具有典型的“其性深伏、峻烈,易耗傷正氣,波及多臟腑等”毒邪特性,兼具寒熱夾雜的“(藥)毒”邪特性,該“毒”損傷氣血陰陽、四肢百骸,引起脾胃臟腑功能的失調(diào),出現(xiàn)氣運乏力、脈道受損、血流艱澀,多造成血瘀表現(xiàn)[11]?;煻靖弊饔玫闹嗅t(yī)病因是內(nèi)毒為患,病機以氣血虧虛為主,合并脾胃失調(diào)、血瘀。敦煌平胃丸組方中君藥大黃破癥瘕積聚,留飲宿食,蕩滌腸胃;臣藥附子、干姜溫陽散寒,苦參清熱燥濕,藁本、防風(fēng)、桔梗三藥合用既可升發(fā)脾之清陽之氣,又可宣利肺氣、布散津液、杜絕水濕形成;土鱉蟲活血破瘀、通絡(luò)止痛;人參益氣健脾,玄參養(yǎng)陰,當(dāng)歸養(yǎng)血。全方配伍嚴(yán)謹(jǐn),寒熱并用,虛實兼顧,氣血同調(diào),補益脾胃,與化療后的中醫(yī)病機相符。本研究結(jié)果顯示敦煌平胃丸可明顯改善黏膜炎,表現(xiàn)在小鼠的進食增加,腹瀉情況明顯好轉(zhuǎn),后期檢測顯示改善小腸形態(tài)結(jié)構(gòu)、屏障相關(guān)因子及炎癥情況,增加黏膜免疫蛋白sIgA 的量。故推測敦煌平胃丸通過增加緊密連接蛋白occludin 和ZO-1 的相對表達(dá)量,改善了腸上皮機械和免疫屏障,抑制細(xì)菌移位,進而抑制炎性信號的級聯(lián)放大和免疫功能發(fā)揮作用。實驗中發(fā)現(xiàn)服用平胃丸的小鼠在1 周后腹瀉明顯好轉(zhuǎn),這提示其發(fā)揮作用不在于止瀉,而是通過調(diào)節(jié)腸道內(nèi)環(huán)境起到減輕炎癥和止瀉的作用。
綜上,敦煌平胃丸可以通過改善順鉑所致腸道黏膜炎小鼠的腸道機械和免疫屏障,進而緩解炎癥反應(yīng),減輕小鼠腹瀉和腸道黏膜炎情況,但其發(fā)揮療效的物質(zhì)基礎(chǔ)和深層機制還有待進一步探討,可通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)、腸道微生態(tài)等探討可能的物質(zhì)基礎(chǔ)和分子機制。