李 熒，楊彩瑜，賈 冬，明彩榮，齊 越?

（1.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)研究生學(xué)院，遼寧沈陽 110847；2.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，遼寧沈陽 110034）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是一種以β-淀粉樣蛋白（Aβ）異常沉積、tau 蛋白過度磷酸化和神經(jīng)纖維纏結(jié)為主要病理特征的中樞神經(jīng)退行性疾病，主要表現(xiàn)為學(xué)習(xí)記憶能力減退和認(rèn)知功能障礙。血腦屏障由腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞間的緊密連接、星形膠質(zhì)細(xì)胞終足和周細(xì)胞組成。研究表明，AD 患者存在血腦屏障損傷［1］。Aβ 作為一種公認(rèn)的與AD 病理相關(guān)的小分子肽，體外研究顯示Aβ25-35能夠破壞血腦屏障緊密連接結(jié)構(gòu)，引起血腦屏障滲漏［2］。當(dāng)血腦屏障結(jié)構(gòu)和功能的完整性出現(xiàn)缺失時，會引起中樞與外周分子交換異常、神經(jīng)元與神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞受損、血管氧化應(yīng)激［3］、腦微血管Aβ 沉積增加等［4］，可能會進(jìn)一步加劇認(rèn)知功能障礙。

Sigma-1 受體（σ1R）廣泛存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和相關(guān)的免疫和內(nèi)分泌組織中。多種研究表明，σ1R 在改善AD 模型動物學(xué)習(xí)記憶能力方面表現(xiàn)出積極的作用。癲癇清顆粒是臨床經(jīng)驗處方，具有豁痰息風(fēng)、活血化瘀、開竅益智的功效。本研究利用Aβ25-35致AD小鼠模型，并給予癲癇清顆粒和σ1R 拮抗劑，觀察癲癇清顆粒對于AD 模型小鼠血腦屏障功能的影響及其相關(guān)機(jī)制，旨在為AD 防治提供更廣泛的理論基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 動物 96 只SPF 級ICR 雄性小鼠，體質(zhì)量為20～24 g，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，許可證號SYXK（遼）2013-0009。

1.2 藥物與試劑 癲癇清顆粒（遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，批號20140110，生藥含量為5.31 g／g）；鹽酸多奈哌齊片［衛(wèi)材（中國）藥業(yè)有限公司，5 mg／片，批號140 606 A］；Aβ25-35（美國Sigma 公司，貨號A4559，批號038M4822 V）；BD1047（TOCRIS 公司，貨號138356-21-5，批號4A／219731）；EB（伊文斯藍(lán)，上海瑞永生物科技有限公司，貨號RS1049-5 g，批號RS18B1116）；鼠抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白（GFAP，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號bsm-33065 M，批號AH03099387）；兔抗血管內(nèi)皮生長因子（VEGF，北京博奧森生物技術(shù)有限公司，貨號bs-1313R，批號AB9071709）；TRIzol（武漢谷歌生物科技有限公司，批號171025）；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（悠揚(yáng)生物科技有限公司，貨號RT-01001，批號095634）；Cx43、 occludin 引物由華大基因生物科技有限公司提供；實時定量PCR 擴(kuò)增預(yù)混合液［2×SYBR qPCR Master Mix（Universal）］（悠揚(yáng)生物科技有限公司，貨號R-01001，批號190601）。

1.3 儀器 DW-200 型腦立體定位儀（成都泰盟科技公司）；微量進(jìn)樣器（上海安亭微量進(jìn)樣器廠，規(guī)格10 μL）；Y 迷宮（遼寧中醫(yī)康復(fù)中心）；MT-200 型Morris 水迷宮（成都泰盟科技公司）。

2 方法

2.1 分組 96 只雄性小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，按體質(zhì)量隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、癲癇清顆粒組、鹽酸多奈哌齊組、BD1047 組和癲癇清+BD1047 組，每組16 只。

2.2 造模 350 mg／kg 水合氯醛麻醉小鼠后，固定，剪毛，碘伏、酒精消毒頭部皮膚。切開小鼠頭部皮膚約2 cm，找到囟門位置，以囟門為原點，向右移動1 mm，向后移動0.5 mm，深度為3 mm，微量進(jìn)樣器緩慢注射3 μL 老化的Aβ25-35，彌散5 min。消毒后傷口處涂抹適量青霉素鈉粉末，縫合傷口，涂抹火棉膠。置于鼠籠中飼養(yǎng)，注意術(shù)后保暖。假手術(shù)組注射等體積無菌生理鹽水。

2.3 給藥 造模第2 天開始灌胃給藥癲癇清顆粒（12.48 g／kg，按生藥量計，每克含有5.31 g 生藥）和鹽酸多奈哌齊（1.3 mg／kg），給藥量為20 mL／kg，拮抗劑BD1047（1 mg／kg），為腹腔注射給藥，每日1 次，連續(xù)給藥21 d，各組動物無死亡，小鼠狀態(tài)良好。假手術(shù)組和模型組小鼠灌胃等體積蒸餾水并腹腔注射等體積無菌生理鹽水。

2.4 Y 迷宮實驗 Y 迷宮可用于評估小鼠的短期記憶能力［5］，第15 天給藥結(jié)束后1 h 對所有實驗動物進(jìn)行Y 迷宮實驗。Y 迷宮裝置由長40 cm、寬15 cm、上口9 cm、下底5 cm 的3 個互為120 °夾角的木質(zhì)支臂組成，依次標(biāo)為A、B、C。將小鼠放在Y 迷宮交叉點，任其自由探索8 min，記錄小鼠進(jìn)入3 個臂的總次數(shù)（N）和進(jìn)臂順序。以連續(xù)進(jìn)入3 個不同支臂為1 次正確交替反應(yīng)，記錄正確交替反應(yīng)次數(shù)。用自發(fā)交替反應(yīng)率反映實驗動物的空間工作記憶能力。自發(fā)交替反應(yīng)率＝正確交替反應(yīng)次數(shù)／（N-2）×100%［6］。

2.5 水迷宮定位航行實驗 對所有動物進(jìn)行水迷宮實驗。Morris 水迷宮定位航行實驗考察動物空間學(xué)習(xí)的記憶能力。Morris 水迷宮為直徑80 cm、高33 cm 的白色圓桶狀裝置。將水迷宮裝置分為4 個等面積的扇形區(qū)域，分別記為第一至四象限。平臺為俯視圓形，側(cè)視工形的白色金屬裝置。平臺位于第一象限扇形區(qū)域中間位置。桶內(nèi)裝水，水中混勻可食用白色素掩蓋平臺位置，保持水面高于平臺1 cm。第16 天給藥結(jié)束后1 h 所有實驗小鼠進(jìn)行Morris 水迷宮定位航行實驗。將小鼠面壁腹部朝內(nèi)放入水中，1 min 內(nèi)小鼠從入水到登上平臺的時間為潛伏期。若小鼠在1 min 內(nèi)未能成功登臺，則潛伏期為60 s。每天游泳2 次，間隔4 h，連續(xù)游泳5 d。

2.6 伊文斯藍(lán)滲漏實驗 空間探索實驗結(jié)束后，在每組動物中隨機(jī)選取6 只小鼠，尾靜脈注射2%的伊文斯藍(lán)溶液（4 mL／kg），全身循環(huán)3 h 后，用350 mg／kg 水合氯醛麻醉，心臟灌流生理鹽水至流出液體透明為止，斷頭取腦，稱量大腦濕重。將大腦置于有錫紙包裹的離心管中，每例樣本加入3 mL 甲酰胺，剪碎大腦，45 ℃水浴孵育72 h 后離心取上清。酶標(biāo)儀（632 nm）測定吸光度值。

將伊文思藍(lán)溶解于甲酰胺中，終質(zhì)量濃度分別為8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 μg／mL，45 ℃避光水浴72 h?？瞻卓诪榈润w積甲酰胺溶液，酶標(biāo)儀（632 nm）測定吸光度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算每克腦組織含伊文斯藍(lán)的質(zhì)量（μg／g）。

2.7 免疫組化染色檢測VEGF、GFAP 表達(dá) 空間探索實驗結(jié)束后，在每組動物中隨機(jī)選取6 只小鼠制備常規(guī)石蠟切片，切片經(jīng)過脫蠟水化、內(nèi)源性過氧化氫酶滅活后，進(jìn)行抗原修復(fù)、封閉、4 ℃孵育一抗過夜。次日PBS 沖洗、孵育生物素化二抗，DAB 染色，蘇木素復(fù)染。中性樹膠封片。顯微鏡鏡下觀察目標(biāo)抗原表達(dá)。每只小鼠各取10 張冠狀切片，每張切片隨機(jī)選取5 個不同的視野。陽性結(jié)果為細(xì)胞內(nèi)表達(dá)棕黃色顆粒。用JEOA 801D 形態(tài)學(xué)圖像分析系統(tǒng)，計算各組陽性細(xì)胞平均光密度值。

2.8 Cx43、 occludin mRNA 檢測 每組動物隨機(jī)選取4 只小鼠，用TRIzol 法提取皮層組織總RNA，使用紫外吸收測定法、變性瓊脂糖凝膠電泳法測定總RNA 濃度和純度。濃度和純度測定結(jié)束后，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)1，5×gDNase Mix 2.0 μL，Template（RNA）5 μL，RNase-Free ddH2O 3 μL，42 ℃2 min，4 ℃+∞；反應(yīng)2，反應(yīng)液1 取10 μL，5×RO-Easy Mix 4 μL，RNaseFree ddH2O 6 μL，37 ℃15 min，85 ℃5s，4 ℃+∞；將cDNA 配置于Realtime quantitative PCR 反應(yīng)體系中。cDNA 0.4 μL，正向引物（10 μmol／L）0.4 μL，反向引物（10 μmol／L）0.4 μL，2×SYBR Green Fast qPCR Mix with Low Rox 10 μL，ddH2O 8.8 μL，95 ℃2 min；95 ℃15 s，60 ℃1 min，72 ℃1 min，40 cycles；95 ℃15 s，60 ℃1 min，95 ℃15 s，60 ℃15 s。得到Ct值，以β-actin 作為內(nèi)參基因進(jìn)行校準(zhǔn)，以2-△△Ct進(jìn)行分析。引物序列，Cx43 正向（5′to 3′）CTAGGTGTGGATGGACCTTATG，反 向（5′ to 3′）ATCATTTGGTGAGGGTGAGG；occludin 正向（5′to 3′）GCCCTCAGGTGACTGTTATTTA，反向（5′ to 3′）CTGCCTTAGTTTCA GTTTG；β-actin-正 向（5′ to 3′）GTCCCTCACCCTC CCAAAAG，反向（5′to 3′）GCTGCCTCAACACCTCAACCC。

2.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，實驗結(jié)果以（）表示，多組間比較單因素方差分析或雙因素方差分析，以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 Y 迷宮實驗 Y 迷宮用于評估空間識別記憶能力，各組小鼠進(jìn)入支臂總次數(shù)無差異，說明癲癇清顆粒對小鼠自發(fā)活動沒有明顯影響。與假手術(shù)組比較，模型組自發(fā)交替反應(yīng)率下降（P＜0.05）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組自發(fā)交替反應(yīng)率增加（P＜0.05），BD1047組和癲癇清+BD1047 組自發(fā)交替反應(yīng)無差異。見圖1。

圖1 癲癇清顆粒對AD 小鼠Y 迷宮實驗的影響（，n＝16）

3.2 水迷宮定位航行實驗 水迷宮前3 天各組小鼠游泳潛伏期無差異；第4 天，與假手術(shù)組比較，模型組小鼠游泳潛伏期增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組小鼠游泳潛伏期縮短（P＜0.01，P＜0.05），BD1047 組和癲癇清+BD1047 組潛伏期比較模型組雖有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；第5 天，與假手術(shù)組比較，模型組游泳潛伏期增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組潛伏期縮短（P＜0.01），BD1047組和癲癇清+BD1047 組潛伏期相比模型組雖有降低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖2。

圖2 癲癇清顆粒對AD 小鼠潛伏期的影響（，n＝16）

3.3 伊文斯藍(lán)滲漏實驗 與假手術(shù)組比較，模型組伊文思藍(lán)的含量增加（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組的伊文斯藍(lán)滲漏量減少（P ＜0.01），BD1047 組和癲癇清+BD1047 組的伊文斯藍(lán)滲漏量與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 各組AD 小鼠腦組織伊文斯藍(lán)含量（，n＝6）

表1 各組AD 小鼠腦組織伊文斯藍(lán)含量（，n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 GFAP 和VEGF 免疫組化染色 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠海馬區(qū)域GFAP 表達(dá)增多（P＜0.01），VEGF 表達(dá)減少（P＜0.01）；與模型組比較，癲癇清顆粒組和鹽酸多奈哌齊組海馬區(qū)域GFAP 陽性表達(dá)降低（P＜0.01），VEGF陽性表達(dá)增加（P＜0.01，P＜0.05）；BD1047 組和癲癇清+BD1047 組的GFAP 和VEGF 表達(dá)與模型組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見圖3～4、表2。

表2 各組小鼠海馬組織中GFAP 和皮質(zhì)中VEGF 的表達(dá)（，n＝6）

表2 各組小鼠海馬組織中GFAP 和皮質(zhì)中VEGF 的表達(dá)（，n＝6）

注：與假手術(shù)組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

圖3 各組小鼠海馬組織GFAP 表達(dá)（ICH，×400）

圖4 各組小鼠皮質(zhì)部位VEGF 表達(dá)（ICH，×400）

3.5 癲癇清顆粒對AD 小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 的影響 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，癲癇清顆粒組Cx43、 occludin mRNA 的表達(dá)升高（P＜0.01），BD1047 組Cx43、 occludin mRNA 表達(dá)雖有增加，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；癲癇清顆粒+BD1047 組Cx43 mRNA 表達(dá)，與模型組比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但occludin mRNA 表達(dá)增加（P＜0.05）。見圖5。

4 討論

Zlokovic 等［7］首次提出了AD 的神經(jīng)血管假說，該假說認(rèn)為Aβ 在血腦屏障清除的障礙，異常血管生成和腦血管系統(tǒng)的老化可能會引發(fā)神經(jīng)血管退化、腦灌注不足和神經(jīng)血管炎癥，最終導(dǎo)致血腦屏障損傷、內(nèi)環(huán)境失衡以及突觸和神經(jīng)元功能損傷和喪失。保護(hù)血腦屏障結(jié)構(gòu)與功能的完整性是改善AD 病理的可能途徑之一。

圖5 癲癇清顆粒對AD 小鼠皮層Cx43、 occludin mRNA 的影響（，n＝4）

腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞通過緊密連接結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系是構(gòu)成血腦屏障的基礎(chǔ)。緊密連接結(jié)構(gòu)包括occludin、連接黏附分子（Junction adhesion molecule，JAM）、claudins 和胞質(zhì)附著蛋白（ZO-1、ZO-2 和ZO-3），其中occludin 是緊密連接結(jié)構(gòu)的主要組成部分［8］。星形膠質(zhì)細(xì)胞作為血腦屏障的重要組成部分，對于調(diào)節(jié)突觸功能、參與腦能量代謝［9］和維持神經(jīng)元生長等具有重要意義?？p隙連接蛋白43（Cx43）作為星形膠質(zhì)細(xì)胞之間的主要連接蛋白，與血腦屏障通透性密切相關(guān)［10］。AD 發(fā)生時常伴隨著occludin 及Cx43 等多種連接蛋白的丟失和分布異常，星形膠質(zhì)細(xì)胞的過度活化，神經(jīng)元損傷加重以及血腦屏障的通透性增加［11］。GFAP 是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物，且在星形膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)下表達(dá)增加。VEGF 主要由星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生，可特異性的促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂，參與血管形成［12］。研究表明，AD 中VEGF 含量顯著降低［13］；增加VEGF 可降低血腦屏障通透性［14］，較高的VEGF 水平與記憶改善相關(guān)［15］。

癲癇清顆粒處方由石菖蒲（Acorus tatarinowii Schott.）、膽南星（Arisaema cum Bi）、紅花（Carthamus tinctorius L.）等11 味中藥組成。前期研究結(jié)果顯示，癲癇清顆?？赏ㄟ^減少BACE1、PS1 的蛋白表達(dá)，抑制Aβ 的生成［16］，保護(hù)海馬神經(jīng)元［17］，進(jìn)而改善AD 模型動物的學(xué)習(xí)記憶障礙。在本研究中，AD 模型小鼠VEGF、 Cx43 和occludin mRNA表達(dá)顯著降低，GFAP 水平顯著升高，伊文斯藍(lán)滲漏增加，提示血腦屏障受損。癲癇清顆粒給藥干預(yù)后，小鼠VEGF、occludin 和Cx43 mRNA 表達(dá)顯著升高，GFAP 水平顯著降低，伊文斯藍(lán)向腦實質(zhì)滲漏減少，說明癲癇清顆?？赡芡ㄟ^調(diào)節(jié)腦內(nèi)VEGF 水平；增加血腦屏障中連接蛋白的表達(dá)；抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞過度活化，維護(hù)血腦屏障功能，進(jìn)而發(fā)揮抗AD 的作用。

σ1R 主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體相關(guān)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜（MAM），激活時，可通過調(diào)節(jié)離子通道、蛋白激酶和G 蛋白偶聯(lián)受體發(fā)揮作用［18］。在本研究中，課題組給予AD 模型小鼠σ1R 拮抗劑BD1047 后發(fā)現(xiàn)，BD1047 組連接蛋白表達(dá)降低，膠質(zhì)細(xì)胞活性增強(qiáng)，說明σ1R 與AD 模型血腦屏障功能有關(guān)聯(lián)。癲癇清顆粒和BD1047 聯(lián)合用藥后，與模型組比較，星型膠質(zhì)細(xì)胞活性、血腦屏障通透性及連接蛋白表達(dá)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義，說明癲癇清顆?？赏ㄟ^σ1R 降低AD 模型小鼠的血腦屏障通透性，改善其學(xué)習(xí)記憶能力，發(fā)揮抗AD 的作用。