張凱惠 ，許立拔，馮成晶，張渝偲，韋露玲，滕建北?

（1.廣西中醫(yī)藥大學，廣西南寧 530200；2.廣西中醫(yī)藥大學壯瑤藥重點實驗室，廣西南寧 530200）

痛風是一種嘌呤及尿酸代謝障礙引起的疾病，為臨床難治性疾病之一，而高尿酸血癥是引起痛風的重要生化基礎和最危險的因素［1］。亦有研究表明5%～12%的高尿酸血癥患者因為長期不愈終發(fā)展為痛風［2］。高尿酸血癥的主要發(fā)病原因有尿酸生成增多和尿酸排泄減少兩條途徑，其中尿酸經(jīng)腎排泄量減少是引發(fā)痛風的主要原因，占患者總數(shù)的80%～85%［3］。目前對高尿酸血癥的西藥治療包括別嘌呤醇、苯溴馬隆非布司他和丙磺舒等，雖療效尚可，但靶點較單一，副作用較大，患者難以耐受，依從性亦較差［4-5］。故探尋有效且毒副作用小的中藥有著比較重要的意義。

美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe 為蘭科植物石斛重要的基原植物，其藥用部位為莖［6］。石斛在2 000 年前的《神農本草經(jīng)》 中便有載，并被列為上品［7］。主要分布于廣西、貴州、廣東和云南等省。其性味甘、微寒，歸胃、腎經(jīng)，具清熱、補腎陰之功效。用于治療治療胃陰不足，病后虛熱不退，目暗不明等癥［6］?，F(xiàn)在對于石斛的藥理學研究主要集中在緩解糖尿病及其并發(fā)癥、增強免疫，抗腫瘤、抗炎、保護心血管、改善胃腸功能等方面［8］。而對于高尿酸血癥的研究卻未見報道，本研究進行美花石斛乙醇提取物對次黃嘌呤誘導急性高尿酸血癥模型小鼠尿酸水平及血清和肝臟的黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性影響，以及對氧嗪酸鉀致慢性高尿酸血癥模型小鼠尿酸及肌酐水平的影響研究，探討美花石斛乙醇提取物降尿酸機制，以期為抗高尿酸血癥藥物的新藥研發(fā)提供依據(jù)。

1 材料

1.1 動物 KM 小鼠，SPF 級，雄性，18～22 g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司，生產許可證號SCXK（湘）2016-0002。飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學實驗動物中心標準動物實驗室，自由攝食飲水。適應性飼養(yǎng)3 d 后進行試驗。

1.2 藥物及試劑 美花石斛采自廣西百色市德?？h燕垌鄉(xiāng)下欽村，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學朱華教授鑒定為蘭科植物美花石斛Dendrobium loddigesii Rolfe；別嘌醇片（上海信宜萬象藥業(yè)股份有限公司，批號05180302）；氧嗪酸鉀（上海麥克林生化科技有限公司，批號C10237039）；次黃嘌呤（上海阿拉丁生化科技股份有限公司，批號J1817203）；4%多聚甲醛（合肥白鯊生物科技有限公司，批號1804895）；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na，國藥集團化學試劑有限公司，批號20160704）；尿酸（UA）、黃嘌呤氧化酶（XOD）、腺苷脫氨酶（ADA）、肌酐（Cr）、考馬斯亮藍等檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為20181229、20190104、20190103、20180813、20181229）。

1.3 儀器 Infinite M200pro 型酶標儀（瑞士TECAN 公司）；BL-2000F 型電子天平（天津丹納赫西特傳感工業(yè)控制有限公司）；SIM-F140AY65-PC 型制冰機（日本大阪松下電器產業(yè)株式會社）；BSA224S 型電子分析天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）；HWS-28 型電熱恒溫水浴鍋（上海齊欣科學儀器有限公司）；DZTW 型電子調溫電熱套（北京永光明醫(yī)療儀器有限公司）；Centrifuge 5424 R 型冷凍離心機（德國艾本德股份公司）；RE-5205 型旋轉蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；恒溫恒濕箱（上海一恒科學儀器有限公司）；Direct-Q 5 UV-R 型純水儀（美國默克密理博公司）。

2 方法

2.1 藥液制備 取美花石斛鮮品，于烘箱45 ℃烘干后粉碎，過2 號篩，按照參考文獻［9］，加10 倍量70%乙醇浸泡1 h，加熱回流提取2 次，2 h／次，合并續(xù)濾液，旋轉蒸發(fā)儀回收乙醇，水浴鍋蒸干成浸膏，取適量浸膏，加0.3%CMCNa，充分混勻成混懸液，依次配制成高（156 mg／mL）、中（78 mg／mL）、低（39 mg／mL）質量濃度的藥液（藥物濃度及劑量按生藥計），臨用現(xiàn)配。

2.2 分組、給藥及造模

2.2.1 對急性高尿酸血癥小鼠的影響［10］取KM 小鼠60只，隨機分為6 組，正常組、模型組、美花石斛醇提物低、中、高劑量組（780、1 560、3 120 mg／kg）（中劑量按2020 年版《中國藥典》 石斛人用量12 g／d 計算），別嘌醇片組（10 mg／kg），每組10 只。按照20 mL／kg 灌胃給藥，每天1 次，連續(xù)7 d，正常組與模型組給予等體積0.3%CMC-Na。第7 天灌胃給藥后1 h，除正常組腹腔注射等體積生理鹽水外，模型組與各給藥組小鼠腹腔注射給予次黃嘌呤溶液（100 mg／mL，10 mL／kg）誘導急性高尿酸血癥模型，同時撤去飼料，禁食不禁水。造模后0.5 h，均摘眼球采血，4 ℃靜置2 h，置于冷凍離心機4 ℃，3 500 r／min離心15 min，取上層澄清液分別測定SUA 水平以及XOD 和ADA 活性，于冰臺快速分離肝臟，勻漿器勻漿后測定XOD、ADA 活性。

2.2.2 對慢性高尿酸血癥小鼠的影響實驗 參考文獻［11］，取KM 小鼠60 只，隨機分為6 組，正常組、模型組、美花石斛醇提物低、中、高劑量組（780、1 560、3 120 mg／kg），別嘌醇片組（10 mg／kg），每組10 只。除正常組外，各組小鼠均每天腹腔注射給予氧嗪酸鉀（250 mg／kg，10 mL／kg）以復制慢性高尿酸血癥模型，并于造模后1 h，灌胃給予各組小鼠相應的藥物治療，正常組與模型組給予等量0.3%CMC-Na 溶液，每天1 次，連續(xù)給藥14 d。末次給藥后1 h，均摘眼球采血，4 ℃靜置2 h，于冷凍離心機4 ℃，3 500 r／min 離心15 min，取上層澄清液分別測定SUA、SCr，于冰臺快速分離腎臟，4% 多聚甲醛固定，石蠟包埋，伊紅-蘇木素（HE）染色，用于組織病理學檢測。

2.3 統(tǒng)計學分析 實驗數(shù)據(jù)用SPSS 21.0 統(tǒng)計分析，用（）表示，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布和方差齊性，多組間比較采用One-Way ANOVA 檢驗，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布和／或方差齊性，多組間比較采用Kruskal-Wallis H 分析，組間兩兩比較采用Mann-Whitney U分析。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 對急性高尿酸血癥小鼠的影響 如表1～2 顯示，與正常組比較，模型組尿酸水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，美花石斛低、中、高劑量組均可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平（P＜0.01），尿酸抑制率分別為39.34%、29.45%、26.83%。與正常組比較，模型組可提高血清和肝臟XOD、ADA 水平（P＜0.01），美花石斛低、中、高劑量組對高尿酸血癥小鼠的血清和肝臟XOD、ADA 均有抑制作用（P ＜0.01）。

表1 美花石斛對高尿酸血癥小鼠尿酸與血清XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

表1 美花石斛對高尿酸血癥小鼠尿酸與血清XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

表2 美花石斛對高尿酸血癥小鼠肝臟XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

表2 美花石斛對高尿酸血癥小鼠肝臟XOD、ADA 活性的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.2 對慢性高尿酸血癥小鼠的影響 如表3 顯示，與正常組比較，模型組尿酸水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，美花石斛低、中、高劑量組均可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平（P＜0.01），尿酸抑制率分別為35.33%、33.98%、31.43%。與正常對照組比較，模型組SCr 水平升高（P＜0.01），美花石斛給藥組的SCr 水平比較模型組下降（P＜0.01）。

表3 美花石斛70% 醇提物對高尿酸血癥小鼠尿酸與SCr水平的影響（，n＝10）

表3 美花石斛70% 醇提物對高尿酸血癥小鼠尿酸與SCr水平的影響（，n＝10）

注：與正常組比較，▲▲P＜0.01；與模型組比較，??P＜0.01。

3.3 對小鼠腎臟組織病理改變的影響 如圖1 顯示，正常組腎臟組織結構正常，未見明顯病理性改變。模型組與美花石斛組均可見不同程度的病理性改變，腎小球萎縮，腎小管擴張較明顯，并未見尿酸鹽結晶沉積。與模型組比較，美花石斛各劑量組腎臟病理性改變的程度均有所減輕。

圖1 小鼠腎臟組織病理改變（HE，×400）

4 討論

高尿酸血癥與痛風、尿酸性腎病、高血壓、心血管疾病等有著緊密的聯(lián)系［12］，故抗痛風新藥的研發(fā)有著十分重要的意義。臨床研究發(fā)現(xiàn)，中醫(yī)中藥治療高尿酸血癥有較好效果［13］，高尿酸血癥在中醫(yī)中并無明確的記載，從臨床上看屬中醫(yī)中的“歷節(jié)”“痛痹”等癥，其因過食高粱厚味，致濕熱內蘊，兼外感風寒，侵襲經(jīng)絡，氣血津液運行受阻，致濕熱煎熬成痰、瘀凝脈絡使關節(jié)紅腫灼痛；亦有先天稟賦不足，年老體虛、脾腎功能失調，脾失健運、腎失氣化，分清別濁失司、蘊久化熱、濕熱內生、聚痰留瘀而致風濕痰瘀、痹阻經(jīng)絡［14-15］。美花石斛其性味甘、微寒，具清熱、補腎陰之效。本實驗以上述理論為基礎，對其降尿酸作用進行研究。

本實驗模型分別采用次黃嘌呤和氧嗪酸鉀鹽為化學誘導劑復制高尿酸血癥模型，氧嗪酸的結構與尿酸的嘌呤環(huán)類似，可競爭地與尿酸酶結合，從而抑制尿酸酶的活性，形成高尿酸血癥模型，模型簡便、重復性好，但其不能反映減少尿酸生成藥物的降尿酸作用［10］；次黃嘌呤為尿酸生成的前體物質可以復制較穩(wěn)定的模型，小鼠血清尿酸在給藥0.5 h 后達到高峰，高尿酸狀態(tài)可維持24 h。因雌激素可使血尿酸水平明顯下降［16-17］，可能會導致造模不穩(wěn)定，故選擇雄鼠進行實驗。

本實驗研究結果表明，美花石斛70%乙醇提取物可顯著降低由次黃嘌呤誘導的急性高尿酸血癥小鼠及由氧嗪酸鉀復制的慢性高尿酸血癥小鼠血尿酸水平；可降低模型小鼠的血清肌酐水平，肌酐水平是評價腎功能的一個重要指標，一般腎功能受損會導致肌酐排泄障礙，可引起血清肌酐水平升高［18］。說明美花石斛醇提物對小鼠腎功能具有一定的保護作用，可減少甚至逆轉高尿酸血癥對腎臟造成的損傷，改善小鼠腎功能，進而可能會促進小鼠腎臟對尿酸的排泄；可顯著抑制模型小鼠血清與肝臟黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶活性，黃嘌呤氧化酶為體內核酸代謝的重要酶，可將體內黃嘌呤與次黃嘌呤氧化后生成尿酸，尿酸產生過多、腎臟尿酸排泄障礙將導致高尿酸血癥的發(fā)生［19］。腺苷脫氨酶亦是核苷代謝中重要的酶類，屬巰基酶，其先催化腺嘌呤核苷轉化為次黃嘌呤核苷，再經(jīng)核苷磷酸化酶作用轉化為次黃嘌呤，終代謝產物為尿酸，而攝入過多嘌呤類食物，腺苷脫氨酶、黃嘌呤氧化酶活性均可能異常升高，使尿酸生成增多［20］，故認為美花石斛可通過減少尿酸的生成降低小鼠血清尿酸水平。

綜上所述，實驗表明美花石斛提取物可降低高尿酸血癥小鼠的尿酸水平，其作用機制為抑制小鼠黃嘌呤氧化酶、腺苷脫氨酶的活性，從而減少尿酸的生成；美花石斛亦可改善小鼠腎臟功能，進而可能促進尿酸的排泄；實驗亦證明，在中醫(yī)藥理論的指導下，進行中藥新功能的探索研究是可行的。