王雨佳 王夢(mèng)如＃ 趙健鋌金凡茂沈詠梅 劉 衡何 苗?李 玥?

（1.云南省昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室藥用特種昆蟲(chóng)開(kāi)發(fā)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心中國(guó)西南藥用昆蟲(chóng)及蛛形類資源開(kāi)發(fā)利用協(xié)同創(chuàng)新中心，云南大理 671000；2.藥用美洲大蠊四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610000）

宮頸炎是女性生殖器官炎癥中最常見(jiàn)且發(fā)病率較高的一種炎癥反應(yīng)，此炎癥與創(chuàng)傷、細(xì)菌、病毒等感染密切相關(guān)。臨床主要表現(xiàn)為陰道分泌物增多、宮頸出血、水腫等［1］。通常采用陰道局部給藥，使藥物通過(guò)陰道黏膜吸收進(jìn)入局部組織或全身血液循環(huán)達(dá)到治療目的［2］。凝膠劑是臨床常用的陰道給藥劑型，與人體組織有較好的生物相容性，對(duì)藥物具有緩、控釋作用，使局部病灶部位的有效濃度增加，提高了生物利用度，增強(qiáng)藥物療效［3］。美洲大蠊Periplaneta americana L.俗稱蟑螂，屬蜚蠊目、蜚蠊科、大蠊屬昆蟲(chóng)，其入藥始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，有散瘀、解毒、消腫、利水等功能［4］。研究發(fā)現(xiàn)，美洲大蠊提取物具有抗菌、抗病毒、抗炎鎮(zhèn)痛、促組織修復(fù)等多方面藥理作用［5-6］。本實(shí)驗(yàn)從美洲大蠊醇提取物中純化精制了抗炎活性部位［7］，制成美廉凈凝膠。建立苯酚致大鼠宮頸炎模型并使用美廉凈凝膠治療，通過(guò)大鼠血清生化因子及宮頸組織病變?cè)u(píng)價(jià)其對(duì)宮頸炎的治療作用，以期為宮頸炎的臨床治療提供新選擇。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SD 大鼠，雌性未孕，體質(zhì)量220～240 g，昆明醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（滇）2011-0004，飼養(yǎng)于大理大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心清潔級(jí)動(dòng)物房。

1.2 藥物與試劑 美洲大蠊浸膏（大理大學(xué)昆蟲(chóng)生物醫(yī)藥研究院張成桂副教授提供，批號(hào)1161-723-GZG，按照中國(guó)發(fā)明專利CN1943600“含有美洲大蠊及其乙醇提取物的藥物組合物及新用途”方法制備）；苯酚（西隴化工股份有限公司，批號(hào)CAS108-95-2）；羧甲基纖維鈉（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)F20110509）；丙三醇（天津市福晨化學(xué)試劑廠，批號(hào)20130107）；異氟烷（山東科源制藥有限公司，批號(hào)131101）；水合氯醛（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號(hào)20120619）；無(wú)水乙醇（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)20130124）；冰醋酸（天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，批號(hào)20130104）；復(fù)方地塞米松凝膠（廈門(mén)金日制藥有限公司，批號(hào)130603）；椿乳凝膠（株洲千金藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)20130113）；泊洛沙姆P407（德國(guó)BASF SE 公司，批號(hào)WPEH540B）；泊洛沙姆P188（德國(guó)BASF SE 公司，批號(hào)WPYH570B）；銅藍(lán)蛋白試劑盒（CP，批號(hào)20130125）、總超氧歧化酶試劑盒（T-SOD，批號(hào)20130202）、丙二醛試劑盒（MDA，批號(hào)20130110）均購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。

1.3 儀器 METTLERAE240 精密電子分析天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；RB-200 智能熱板儀（成都泰盟科技有限公司）；2010 型酶標(biāo)儀（奧地利安圖斯公司）；ES-1450 型高壓滅菌鍋（日本Tomy Kogyo 公司）；TL-16R 臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（上海市離心機(jī)械所）；APS-300S 型自動(dòng)脫水機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；BM-VIII 型生物組織包埋機(jī)、冷凍臺(tái)（孝感市宏業(yè)醫(yī)用儀器有限公司）；RM2245 型手動(dòng)切片機(jī)（德國(guó)Leica 公司）；YT-7FB 型生物組織攤烤片機(jī)（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子科技有限公司）；BI-2000 型醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)（成都泰盟科技有限公司）。

1.4 受試藥物配制 空白凝膠，稱取適量的泊洛沙姆P407、P188 固體，加足量水溶脹24 h，加適量乙醇、甘油，攪拌，混勻，于4 ℃靜置24 h，密封，備用。美廉凈凝膠，按上述方法制備空白凝膠，加入美洲大蠊浸膏，制備成美廉凈高（150 mg／mL）、中（100 mg／mL）、低（50 mg／mL）凝膠，密封，備用。

1.5 造模試劑（20%苯酚膠漿制備）量取50 ℃液態(tài)苯酚4 mL、1 g 羧甲基纖維鈉，6 mL 甘油在50 ℃的水浴中充分?jǐn)嚢杈鶆?，再加? mL 蒸餾水稀釋混勻，配制20%苯酚膠漿，密封4 ℃冰箱保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)放置室溫混勻使用［8-9］。

2 方法

2.1 造模 根據(jù)參考文獻(xiàn)［10-11］建立大鼠宮頸炎模型。從80 只雌性未孕SD 大鼠中隨機(jī)挑選10 只作為正常對(duì)照組，其余70 只用于造模。異氟烷將大鼠進(jìn)行麻醉，用帶有灌胃鈍性針頭的一次性注射劑器將20%的苯酚膠漿緩慢注入大鼠宮頸穹隆部腔內(nèi)，0.1 mL／只，后將大鼠頭低尾高體位傾斜放置5 min，每3 d 按上述方法操作1 次，連續(xù)3 次，造模時(shí)間共12 d。

2.2 分組及給藥 造模結(jié)束后第3 天，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》［12］中“中藥陰道用制劑毒性試驗(yàn)方法”的炎癥程度進(jìn)行評(píng)分（表1），根據(jù)紅斑、水腫、分泌物的總分進(jìn)行療效統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，并以總分0～3 分為無(wú)炎癥、4～6 分為輕度炎癥、7～9 分為中度炎癥、10～12 分為重度炎癥。分組時(shí)將無(wú)炎癥大鼠剔除，剩余大鼠按炎癥嚴(yán)重程度分層隨機(jī)分為凝膠組、模型對(duì)照組、復(fù)方地塞米松凝膠組（1.5 mg／kg）、椿乳凝膠組（1.0 g／kg）、美廉凈凝膠高（75 mg／kg）、中（50 mg／kg）、低（25 mg／kg）劑量組，每組10 只。分組后第1 天開(kāi)始陰道內(nèi)給藥，每天給藥2 次，正常對(duì)照組和模型對(duì)照組按上述給藥方式給予相應(yīng)的生理鹽水，連續(xù)給藥10 d。

2.3 取樣及指標(biāo)檢測(cè) 在給藥治療期間，觀察大鼠的一般癥狀，包括形態(tài)外觀、行為活動(dòng)、飲食、飲水及自主活動(dòng)功能等有無(wú)異常；觀察大鼠陰道及宮頸口紅斑、水腫及分泌物，并給予評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。末次給藥后，禁食不禁水12 h，10%水合氯醛麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血，冰水浴放置4～6 h，4 ℃、3 500 r／min、離心10 min，取上層血清適量，按照CP、MDA、T-SOD 試劑盒說(shuō)明書(shū)，依次加入試劑，37 ℃孵育顯色，加入終止液，酶標(biāo)儀測(cè)定OD 值；取大鼠肝臟、腎臟和宮頸組織，于生理鹽水中浸洗2～3次，濾紙吸干水分，稱定質(zhì)量，臟器指數(shù)＝相應(yīng)臟器質(zhì)量（mg）／大鼠處死前體質(zhì)量（kg）×100%；完整分離各組大鼠宮頸組織，經(jīng)10%的福爾馬林固定、梯度脫水、石蠟包埋、切片、蘇木精／伊紅染色、封片，顯微鏡下觀察宮頸組織的病理變化。

表1 外陰炎癥反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)分析軟件SPSS 17.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，數(shù)據(jù)以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），方差齊，組間兩兩比較采用LSD 法，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 美廉凈凝膠對(duì)宮頸炎大鼠一般狀態(tài)的影響 造模期間，與正常對(duì)照組比較，各造模組大鼠飲食量減少，喜扎堆、豎毛、易怒，外陰及宮頸口可見(jiàn)明顯的紅腫，并伴有大量黃色或白色甚至血絲的黏性分泌物。經(jīng)藥物治療后，與模型對(duì)照組比較，各給藥組大鼠上述癥狀均得到不同程度的改善。其中美廉凈凝膠高劑量組藥效最佳。

3.2 美廉凈凝膠對(duì)宮頸炎大鼠外陰炎癥程度的影響 給藥前，模型組各組間外陰炎癥評(píng)分無(wú)差異。與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組外陰炎癥評(píng)分升高（P＜0.01）；在給藥第10 天，與模型對(duì)照組比較，復(fù)方地塞米松凝膠組、椿乳凝膠組及受試藥各劑量組外陰炎癥評(píng)分降低（P＜0.01），凝膠組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與凝膠組比較，各給藥組外陰炎癥評(píng)分降低（P＜0.01）。綜上，本模型造模成功，且空白凝膠對(duì)模型不會(huì)產(chǎn)生顯著影響。見(jiàn)表2。

表2 美廉凈凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠外陰炎癥的影響（，n＝10）

表2 美廉凈凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠外陰炎癥的影響（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲▲P＜0.01。椿乳凝膠組給藥劑量為凝膠質(zhì)量計(jì)算。

3.3 美廉凈凝膠對(duì)宮頸炎大鼠臟器指數(shù)的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組大鼠腎臟指數(shù)、宮頸指數(shù)升高（P＜0.01）；與模型組對(duì)照組比較，美廉凈凝膠各劑量組腎臟指數(shù)、宮頸指數(shù)均有下降趨勢(shì)，肝臟指數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；與凝膠組比較，復(fù)方地塞米松凝膠組、美廉凈凝膠高劑量組宮頸指數(shù)不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01）。見(jiàn)表3。

表3 美廉凈溫度敏感型凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10）

表3 美廉凈溫度敏感型凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠臟器指數(shù)的影響（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.4 美廉凈凝膠對(duì)宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響 與正常對(duì)照組比較，模型對(duì)照組CP、MDA、T-SOD表達(dá)升高（P＜0.01）；與模型對(duì)照組比較，各給藥組CP、MDA、T-SOD 表達(dá)均有不同程度的降低，其中MDA、T-SOD 表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）；與凝膠組比較，復(fù)方地賽松凝膠組CP、T-SOD 表達(dá)降低（P＜0.01），美廉凝膠高劑量組CP、MDA 表達(dá)水平有不同程度降低（P＜0.05，P＜0.01），見(jiàn)表4。

表4 美廉凈溫度敏感型凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響（，n＝10）

表4 美廉凈溫度敏感型凝膠對(duì)苯酚致宮頸炎大鼠血清CP、MDA、T-SOD 水平的影響（，n＝10）

注：與正常對(duì)照組比較，△△P＜0.01；與模型對(duì)照組比較，??P＜0.01；與空白凝膠組比較，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01。

3.5 美廉凈凝膠對(duì)宮頸炎大鼠宮頸組織病理學(xué)的影響 正常對(duì)照組宮頸及陰道壁組織結(jié)構(gòu)正常各層清晰可見(jiàn)，未見(jiàn)鱗狀上皮增生和破損，未見(jiàn)柱狀上皮鱗狀化，鱗柱移行處結(jié)構(gòu)正常，宮頸黏膜下及陰道壁黏膜組織內(nèi)有少許淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞分散浸潤(rùn)；模型對(duì)照組和空白凝膠組可見(jiàn)宮頸黏膜鱗狀上皮增生，陰道壁淺表有潰瘍形成，組織中有大量中心粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，可見(jiàn)血管充血及組織細(xì)胞狀態(tài)異常；復(fù)方地塞米松凝膠組和美廉凈凝膠高、中劑量可見(jiàn)宮頸黏膜各層組織結(jié)構(gòu)清晰，宮頸黏膜下層及陰道壁黏膜組織中有少量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，其中復(fù)方地塞米松凝膠組趨于正常黏膜下白細(xì)胞數(shù)明顯少于高、中劑量組；椿乳凝膠組和美廉凈凝膠低劑量組可見(jiàn)宮頸黏膜有上皮增生的現(xiàn)象，黏膜下有較多量的中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)，組織及血管有異常。見(jiàn)圖1。

圖1 各組大鼠宮頸組織病理切片圖（HE，×400）

4 討論

本實(shí)驗(yàn)采用經(jīng)典苯酚膠漿化學(xué)灼傷致宮頸炎模型，造模后，各造模大鼠主要一般表現(xiàn)為陰道紅腫、分泌物增多，與臨床宮頸炎患者相似［13］。經(jīng)美廉凈凝膠各劑量組治療后，模型大鼠的紅腫減輕、分泌物也有減少的跡象，顯示實(shí)驗(yàn)藥物對(duì)宮頸炎大鼠有一定的治療作用。

雖然由于高分子輔料組成的空白凝膠有一定的促進(jìn)組織修復(fù)及抑制炎癥的作用，但藥物治療組與凝膠組比較存在顯著性差異，證實(shí)了美蠊浸膏在治療宮頸炎過(guò)程中發(fā)揮了主要作用。

當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥和組織壞死時(shí)，血清中作為炎癥反應(yīng)指標(biāo)之一的CP 活力會(huì)增強(qiáng)［14］，同時(shí)體內(nèi)的超氧自由基會(huì)增多，產(chǎn)生的MDA 升高，使SOD 活力降低［15］，故檢測(cè)血清中的CP、T-SOD 及MDA 對(duì)評(píng)價(jià)炎癥的程度有重要意義。本研究中，CP、MDA 表達(dá)量降低，T-SOD 表達(dá)量升高。提示美廉凈凝膠可能降低炎性因子的表達(dá)，調(diào)節(jié)氧自由基含有量，進(jìn)而起到治療宮頸炎的作用。

基于以上研究，可見(jiàn)美廉凈凝膠在一定程度上有減輕炎性癥狀的作用，但是主要是針對(duì)輕、中度的宮頸炎模型進(jìn)行研究，而且宮頸炎并不是單一因素引起的炎癥，可能還有很多微生物參與炎癥的發(fā)展。后期，課題組將進(jìn)一步研究美廉凈凝膠對(duì)不同致病機(jī)理的大鼠宮頸炎的治療作用，考察美廉凈抗宮頸炎的藥效學(xué)機(jī)制。