孟慶良 ，孟婉婷 ，卞 華，鄭福增?，谷慧敏，左瑞庭，周子朋，王慧蓮，苗喜云，馬俊福

（1.河南省中醫(yī)院風(fēng)濕病科，河南鄭州 450002；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)／上海中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)系，河南鄭州 450002；3.南陽理工學(xué)院張仲景國醫(yī)學(xué)院，河南南陽 473004）

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎（Rheumatoid arthritis，RA）是一種常見的自身免疫性慢性疾病，慢性炎癥、滑膜增生和關(guān)節(jié)進(jìn)行性破壞是其重要的病理特征；在RA 的發(fā)生發(fā)展過程中，成纖維樣滑膜細(xì)胞是其重要的效應(yīng)細(xì)胞，可通過異常增殖、產(chǎn)生炎癥因子逐漸浸潤至包括軟骨和骨關(guān)節(jié)在內(nèi)的多種關(guān)節(jié)或器官，嚴(yán)重威脅著人們的身體健康［1-2］。因此，抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖、控制或減輕滑膜炎癥進(jìn)展是治療RA的重要策略。

目前，臨床上治療RA 的常用藥物為甲氨喋呤和來氟米特等生物制劑，但因其不良反應(yīng)和價格昂貴等因素給患者用藥帶來嚴(yán)重負(fù)擔(dān)。RA 屬于中醫(yī)學(xué)的“痹癥”范疇，中藥治療RA 一直是研究的熱點。大黃素是藥用植物大黃的有效成分之一，具有抗炎、抗菌、抗病毒和抗癌等多種生物活性，其對角膜炎和心肌炎等多種自身免疫性具有良好的改善作用［3-5］。核轉(zhuǎn)錄因子κB（nuclearfactor-κB，NFκB）信號通路是一種細(xì)胞內(nèi)重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，可通過腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、B 細(xì)胞活化因子和病毒等刺激因子的活化誘導(dǎo)產(chǎn)生炎癥因子參與炎癥反應(yīng)，也可通過調(diào)控細(xì)胞的增殖和凋亡等生物學(xué)過程參與RA 的發(fā)生發(fā)展［6-7］。已有研究［8］指出，大黃素可通過抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移發(fā)揮抗RA 發(fā)生發(fā)展的作用，但其對炎癥因子及NF-κB 信號通路的影響尚不清楚。TNF-α 是一種常見的促炎因子，可造成成纖維樣滑膜細(xì)胞炎癥損傷［9］。本研究以人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜HFLS-RA 細(xì)胞為研究對象，通過觀察大黃素對TNF-α 刺激的HFLS-RA 細(xì)胞增殖凋亡、炎癥因子和NF-κB 信號通路的影響，探討其抗RA 發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，以期為大黃素的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料

1.1 藥物與試劑 大黃素（純度＞98%，批號20161025）購于北京索萊寶科技公司；胰蛋白酶（批號SH30042.01）、DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號SH30022.018B）購于美國HyClone 公司；胎牛血清（批號16000-44）、青鏈霉素（批號1450572）購于美國Gibico 公司；TNF-α（批號YW-6）購于上海生物工程公司；噻唑藍(lán)（Methylthiazolyldiphenyltetrazolium bromide，MTT；批號 2035B358）購于美國Promega 公司；Trizol 試劑（批號DP121221）購于北京天根生物有限公司；p-IκBα 抗體（貨號ab7217）、p-NF-κB p65 抗體（貨號ab95020）購于英國Abcam 公司；β 肌動蛋白（β-actin）抗體（批號161106）、辣根過氧化物酶（Horse reddish peroxidase，HRP）山羊抗兔／鼠（批號160913）購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；放射免疫沉淀法（Radio-Immunoprecipitation Assay，RIPA）裂解液（批號P0013B）購于上海碧云天生物研究所；白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）ELISA 試劑盒（批號20161021）、白細(xì)胞介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）（批號20161028）購于南京建成生物工程研究所；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號RR420 A）購于日本 Takara 公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白定量分析試劑盒（批號23225）購于美國Pierce 公司。

1.2 儀器 Gallios 型號流式細(xì)胞儀購于美國Beckman Coulter 公司；CFX384 型號實時定量PCR 儀購于美國Bio-Rad 公司；MK3 型號酶標(biāo)儀購于美國Thermo 公司；GelDoc XR+型號購于美國Bio-Rad 公司；TS100-F 型號倒置顯微鏡購于日本尼康公司；XSP-9CA 型號光學(xué)顯微鏡購于上海光學(xué)儀器廠。

2 方法

2.1 細(xì)胞、培養(yǎng)與分組 將來自于美國ATCC 細(xì)胞庫的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞株HFLS-RA 解凍復(fù)蘇后，接種于含15% 胎牛血清、100 μg／mL 鏈霉素和100 U／mL青霉素的DMEM 高糖培養(yǎng)基中，置于條件為37 ℃和5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱（日本SANYO 公司）中培養(yǎng)。每2 天換液1 次。待細(xì)胞融合度達(dá)85%時，胰蛋白酶消化，并按1 ∶3 比例傳代至第4 代時進(jìn)行后續(xù)實驗。實驗分為5 組，分別為對照組（未處理）、誘導(dǎo)組（給予20 ng／mL TNF-α 處理）、25 μmol／L 大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和25 μmol／L 大黃素共同處理）、50 μmol／L大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和50 μmol／L 大黃素共同處理）和100 μmol／L 大黃素組（給予20 ng／mL TNF-α 和100 μmol／L大黃素共同處理）。每組設(shè)置3 個重復(fù)。

1.3 MTT 法檢測 取對數(shù)生長期的HFLS-RA 細(xì)胞以每孔5 000 個細(xì)胞接種至含完全培養(yǎng)基的96 孔細(xì)胞板上，于培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)過夜。根據(jù)“1.2”項下分組給藥干預(yù)24 h。每個處理設(shè)置6 個平行孔。干預(yù)結(jié)束后，取出培養(yǎng)板，吸去培養(yǎng)液后加入質(zhì)量濃度為5 g／L MTT 溶液20 μL 干預(yù)4 h。以200 μL二甲基亞砜溶解MTT 結(jié)晶物后，采用美國Thermo公司的酶標(biāo)儀檢測各處理組細(xì)胞在450 nm 處的光密度值（OD 值）。按照公式細(xì)胞存活率＝（OD 值藥物組／OD 值對照組）×100%計算各組細(xì)胞的存活率。實驗重復(fù)3 次。

2.2 克隆形成實驗 取干預(yù)24 h 后的HFLS-RA 細(xì)胞，以每皿300 個細(xì)胞接種至60 mm 培養(yǎng)皿中，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 d 后，吸去培養(yǎng)基以磷酸緩沖液沖洗。沖洗2 次后，加入預(yù)冷的4%甲醇溶液。待固定10～15 min 后，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，加入0.1% Giemsa 溶液。待染色15～30 min 后，流水沖洗晾干。置于顯微鏡下觀察統(tǒng)計克隆細(xì)胞數(shù)。其中，大于50 個細(xì)胞的集落記為有效克隆，以克隆形成率＝（克隆細(xì)胞數(shù)／接種細(xì)胞株）×100% 的公式計算各組細(xì)胞的克隆形成能力。實驗重復(fù)3 次。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測 將干預(yù)24 h 后的HFLS-RA 細(xì)胞以胰蛋白酶消化制備細(xì)胞懸液。取細(xì)胞懸液1 mL，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌和離心后，重懸于200 μL 的結(jié)合緩沖液中，加入5 μL 膜聯(lián)蛋白V-FITC（Annexin V-FITC）和10 μL 碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）避光條件下染色15 min 后，補(bǔ)加300 μL 的結(jié)合緩沖液，上美國Beckman Coulter 公司的流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測。實驗重復(fù)3 次。

2.4 RT-PCR 檢測 收集待檢測的HFLS-RA 細(xì)胞，采用Trizol 法提取總RNA，并采用分光光度法檢測總RNA 的質(zhì)量。再按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟將RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA。將由中國Invitrogen 公司合成的B 細(xì)胞淋巴瘤／白血病-2（B cell lymphoma／lewkmia-2），Bcl-2 引物（正向5′-GGTGGGGTCATGTGTGTGG-3′ 和反向 5′-CGGTTCAGGTACTCAGTCATCC-3′）、Bcl-2 相關(guān)X 蛋白（Bcl-2 Associated X Protein），Bax 引物（正向5′-GCGCTCGTGTTTCTGGACA-3′和反向5′-AGTATAGACACTCGTCACTGGTG-3′）和β-actin引物（正向5′-ATCATGTTTGAGACCTTCAACACC-3′和反向5′-CATGGTGGTGCCGCCAGACAG-3′）加入二乙基焦磷酰胺（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理水稀釋成終濃度為0.4 μmol／L的工作液，取1 μL cDNA、各1 μL 正反引物、10 μL 2×SYBR Premix Ex TaqⅡ和7.4 μL ddH2O 配成20 μL的PCR 反應(yīng)體系，放入PCR 儀中，按照95 ℃ 120 s、（95 ℃30 s、60 ℃30 s、72 ℃30 s）×40 個循環(huán)的PCR 擴(kuò)增條件進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin 作為管家基因，2-△△CT法分析Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達(dá)水平。實驗重復(fù)3 次。

2.5 ELISA 法檢測上清液中IL-6 和IL-1β 水平 取含高糖培養(yǎng)基的6 孔細(xì)胞板，將生長良好的HFLS-RA 細(xì)胞以每孔3×105個細(xì)胞接種，放入細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。按“2.1”項下的分組給藥處理，每組設(shè)置3 個復(fù)孔。處理24 h 后，收集各處理組上清液，參照ELISA 試劑盒說明書步驟分別檢測IL-6 和IL-1β 水平。實驗重復(fù)3 次。

2.6 Western blot 檢測 向待測的HFLS-RA 細(xì)胞中加入含蛋白酶抑制劑的蛋白質(zhì)裂解液提取總蛋白。向經(jīng)BCA 法定量后的總蛋白中加入等體積上樣緩沖液于沸水浴中變性3～5 min。取變性蛋白60 μg 行聚丙烯酰胺凝膠電泳（Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）電泳分離。待完全分離后，電轉(zhuǎn)于聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜。浸于新鮮的含5% 脫脂奶粉的TBST（Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween）溶液溫育1 h 后，放入TBST 溶液稀釋1 000 倍的一抗中于4 ℃下孵育24 h。經(jīng)TBST 溶液洗膜3 次，10 min／次，放入TBST 溶液稀釋5 000倍的二抗中37 ℃下孵育1 h。避光下加入化學(xué)發(fā)光劑顯影曝光后，采用美國Bio-Rad 公司的凝膠成像系統(tǒng)掃描分析。實驗重復(fù)3 次。

3 結(jié)果

3.1 大黃素對HFLS-RA 細(xì)胞增殖的影響 MTT 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞的存活率升高（P ＜0.05）；與誘導(dǎo)組比較，25、50、100 μmol／L 大黃素處理組細(xì)胞的存活率下降（P＜0.05）。同時，克隆形成實驗結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞的克隆形成率較對照組升高（P ＜0.05）；而給予25、50、100 μmol／L 大黃素處理后，HFLSRA 細(xì)胞的克隆形成率較誘導(dǎo)組均降低（P＜0.05）。隨著大黃素濃度的增加，HFLS-RA 細(xì)胞的存活率和克隆形成率越低。見表1。

表1 各組細(xì)胞的存活率、克隆形成率和凋亡率（，%，n＝9）

表1 各組細(xì)胞的存活率、克隆形成率和凋亡率（，%，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導(dǎo)組比較，＃P＜0.05。

3.2 大黃素對HFLS-RA 細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀（圖2）檢測對照組、誘導(dǎo)組、25 μmol／L 大黃素組、50 μmol／L大黃素組和100 μmol／L 大黃素組細(xì)胞的凋亡率存在差異（P＜0.05），與對照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞的凋亡率降低（P＜0.05）；與誘導(dǎo)組比較，25、50、100 μmol／L大黃素組細(xì)胞的凋亡率均升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性。結(jié)果見圖1、表1。

圖1 流式細(xì)胞儀檢測各組HFLS-RA 細(xì)胞的凋亡

3.3 大黃素對HFLS-RA 細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響RT-PCR 檢測結(jié)果顯示，誘導(dǎo)組細(xì)胞中Bcl-2 mRNA 的表達(dá)水平高于對照組（P＜0.05），而Bax mRNA 表達(dá)低于對照組（P＜0.05）；隨25、50、100 μmol／L 大黃素濃度的升高，HFLS-RA 細(xì)胞中Bcl-2 mRNA 逐漸降低，而Bax mRNA 表達(dá)逐漸升高，與誘導(dǎo)組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0.05）。見表2。

3.4 大黃素對HFLS-RA 細(xì)胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平的影響 與對照組比較，誘導(dǎo)組中IL-6 和IL-1β 水平升高（P＜0.05）；而大黃素組較誘導(dǎo)組降低（P＜0.05），且大黃素濃度越高降低幅度越明顯。見表3。

表2 各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達(dá)水平（，n＝9）

表2 各組細(xì)胞中Bcl-2 和Bax mRNA 的相對表達(dá)水平（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導(dǎo)組比較，＃P＜0.05。

3.5 大黃素對HFLS-RA 細(xì)胞中NF-κB 信號通路的影響與對照組比較，誘導(dǎo)組細(xì)胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)升高（P ＜0.05）；與誘導(dǎo)組比較，25、50、100 μmol／L大黃素組細(xì)胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)下降（P＜0.05），且呈濃度依賴性。見圖2、表4。

表3 各組HFLS-RA 細(xì)胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平（，n＝9）

表3 各組HFLS-RA 細(xì)胞上清液中IL-6 和IL-1β 水平（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導(dǎo)組比較，＃P＜0.05。

圖2 Western blot 檢測p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)

表4 各組HFLS-RA 細(xì)胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的相對表達(dá)量（，n＝9）

表4 各組HFLS-RA 細(xì)胞中p-IκBα 和p-NF-κB p65 蛋白的相對表達(dá)量（，n＝9）

注：與對照組比較，?P＜0.05；與誘導(dǎo)組比較，＃P＜0.05。

4 討論

從中醫(yī)角度講，RA 是一種因風(fēng)、寒、濕邪入侵導(dǎo)致的氣血凝滯和經(jīng)絡(luò)痹阻的肢體關(guān)節(jié)病變，關(guān)節(jié)腫脹壓痛是急性活動期的重要表現(xiàn)。有報道［10］指出，中藥復(fù)方大黃散可通過緩解RA 關(guān)節(jié)的紅腫熱痛改善RA 病情，而其中的君藥大黃是我國傳統(tǒng)的中草藥，具有逐瘀通經(jīng)之功效。此外，作為大黃的主要成分，大黃素是一種蒽醌類化合物，具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗病毒和抗腫瘤等藥理作用。已有研究［11-12］證實，大黃素可通過Notch-1／Hes 信號通路促進(jìn)胰腺細(xì)胞凋亡進(jìn)而減輕胰腺炎反應(yīng)；另外，在LPS 刺激的小膠質(zhì)細(xì)胞中，還可通過AMPK／Nrf2 信號通路發(fā)揮抗神經(jīng)炎癥的作用。

TNF-α 是參與滑膜炎癥反應(yīng)的重要細(xì)胞因子，貫穿RA的整個病程，其作為一種促炎因子，可通過激活巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞等參與免疫調(diào)節(jié)，也可通過誘導(dǎo)成纖維樣滑膜細(xì)胞和軟骨細(xì)胞產(chǎn)生炎癥介質(zhì)，在觸發(fā)RA 炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)破壞等過程中發(fā)揮著重要作用。有研究［13-14］指出，TNF-α 可誘導(dǎo)RA 滑膜細(xì)胞增殖，抑制其凋亡并激活NF-κB 信號通路。NF-κB 信號通路是與炎癥反應(yīng)關(guān)系密切的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，NF-κB p65 是NF-κB 家族中的重要成員，正常情況下，NF-κB p65 與p50 形成的二聚體與NF-κB 抑制蛋白IκB 結(jié)合成為無活性的復(fù)合物，但當(dāng)受到外界刺激時，IκB 降解使NF-κB p65／p50 暴露出來，導(dǎo)致NF-κB 活化，其活化后可通過誘導(dǎo)促炎因子如IL-6 和IL-1β 的生成加重炎癥反應(yīng)［15］，還可引發(fā)RA 滑膜細(xì)胞增殖和凋亡異常等反應(yīng)，參與RA 發(fā)生發(fā)展［16］。本研究以TNF-α 刺激體外培養(yǎng)的人類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜HFLS-RA 細(xì)胞24 h后發(fā)現(xiàn)，HFLS-RA 細(xì)胞的存活率、克隆形成率、 Bcl-2 mRNA 的表達(dá)水平、p-IκBα 蛋白和p-NF-κB p65 蛋白的表達(dá)水平和上清液中IL-6、IL-1β 含量均明顯升高，細(xì)胞凋亡率和Bax mRNA 的表達(dá)降低；而給予25、50 和100 μmol／L大黃素干預(yù)后，TNF-α 引起的上述變化均明顯受到顯著抑制，且呈濃度依賴性。 Bcl-2 和Bax 是與細(xì)胞凋亡關(guān)系密切的抑凋亡因子和促凋亡因子，在RA 患者中Bcl-2 表達(dá)升高而Bax 表達(dá)降低，通過活化抑制RA 滑膜細(xì)胞調(diào)亡信號，促進(jìn)細(xì)胞增殖［13，17］。已有報道［18-19］證實，大黃素可抑制NFκB 信號通路的活化改善缺氧和脂多糖誘導(dǎo)的腸上皮屏障功能障礙，而NF-κB 信號通路受到抑制可降低舌鱗癌移植瘤細(xì)胞中Bcl-2 和上調(diào)Bax。結(jié)果提示，大黃素可通過抑制NF-κB 信號通路的活化抑制HFLS-RA 細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)。

綜上所述，大黃素可抑制RA 滑膜細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，減輕炎癥反應(yīng)，其分子機(jī)制可能與抑制NF-κB 信號通路的活化有關(guān)。該結(jié)果為大黃素臨床治療RA 提供新依據(jù)。然而，大黃素是否通過調(diào)控其他信號通路或基因的表達(dá)發(fā)揮抗RA 的作用還有待后續(xù)進(jìn)一步研究。