甘椿椿，金 湛，魏曉鵬，靳美娜?

（1.衢州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，浙江衢州 324000；2.天津醫(yī)科大學(xué)，天津 300070）

藤梨根為中華獼猴桃Actinidia chinensis Planch的根，為獼猴桃科獼猴桃屬植物。臨床上以單方或者復(fù)方用于胃癌、肝癌、直腸癌等惡性腫瘤以及胃病、肝病、前列腺炎等疾病的治療。已報(bào)道的從藤梨根中分離鑒定化學(xué)成分超過90 種［1］，主要包括三萜類、黃酮類、蒽醌類、甾體及其苷類、生物堿類、酚酸類、糖類、氨基酸、揮發(fā)油、無機(jī)金屬元素以及其他類，隨著研究的不斷深入，其化學(xué)成分的種類和數(shù)量不斷增加?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，藤梨根中的化學(xué)成分具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、抗氧化、降血脂、保肝、提高免疫力等藥理活性［2-3］，抗腫瘤作用一直是研究的熱點(diǎn)，目前也取得了一定進(jìn)展［4］。但是，抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用方面的研究鮮有報(bào)道，本研究前期工作基礎(chǔ)表明，藤梨根乙醇提取物能夠明顯抑制乳腺癌MDA-MA-231 細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［5］。因此本實(shí)驗(yàn)對(duì)藤梨根進(jìn)行化學(xué)成分研究，同時(shí)測定單體化合物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，以期豐富藤梨根的藥理活性，開發(fā)新的抗腫瘤轉(zhuǎn)移先導(dǎo)化合物。

1 材料

Bruker AV 500 核磁共振儀（TMS 內(nèi)標(biāo)）、Bruker esquire 3000 00142 質(zhì)譜儀（德國Bruker 公司）；LC-3000 島津半制備高效液相色譜儀（日本島津公司）；YMC-Pack ODS-A SH-343-5 色譜柱（20 mm×250 mm，5 μm）、柱色譜和薄層色譜用硅膠（青島海洋化工廠）；Toyoperl HW-40C、HW-40F、LH-20 柱填料（日本Tosoh 公司）；CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（美國熱電公司）；全自動(dòng)酶標(biāo)板分析儀（美國BioTek 儀器有限公司）；AE2000 倒置生物顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司）；移液器（德國Eppendorf 公司）；Transwell 小室（美國康寧公司）；所用試劑均為分析純；LY294002（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞購自中科院上海細(xì)胞庫。

藤梨根藥材于2018 年7 月采自浙江衢州，經(jīng)衢州瑞草堂醫(yī)藥有限公司汪建剛主任中藥師鑒定為正品，標(biāo)本（B20180720）存放于衢州瑞草堂醫(yī)藥有限公司。

2 提取與分離

藤梨根乙醇提取物以及不同極性有機(jī)溶劑萃取部位為前期研究工作的基礎(chǔ)［5］。藤梨根乙酸乙酯部位用二氯甲烷-甲醇溶解，用300 g 硅藻土拌樣，經(jīng)硅膠柱層析，二氯甲烷-甲醇（95 ∶5～70 ∶30）梯度洗脫得8 個(gè)組分（Fr.1～8），F(xiàn)r.2 經(jīng)Sephadex HW-40 凝膠柱二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫分離純化，重結(jié)晶（甲醇）后得化合物1（312.0 mg）。Fr.3 經(jīng)硅膠柱石油醚-乙酸乙酯（5 ∶1～1 ∶1）梯度洗脫得Fr3.1～3.4，F(xiàn)r3.2 經(jīng)凝膠滲透色譜二氯甲烷-甲醇（1 ∶1）洗脫得化合物2（6.1 mg）；Fr3.3 經(jīng)半制備HPLC 甲醇-水（85 ∶15）洗脫得化合物3（10.5 mg）、8（21.1 mg）。Fr.4 經(jīng)Sephadex HW-40 凝膠柱二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫分為3 段Fr.4.1～4.3，F(xiàn)r.4.1 經(jīng)反復(fù)制備型HPLC（95% 甲醇）分離，重結(jié)晶（甲醇）得化合物4（17.0 mg）、5（15.7 mg）、6（18.7 mg）。Fr.5 經(jīng)硅膠柱層析氯仿-甲醇（50 ∶1～5 ∶1）梯度洗脫得Fr5.1～5.5，F(xiàn)r5.2 經(jīng)凝膠滲透色譜二氯甲烷-甲醇（2 ∶1）洗脫得化合物7（7.6 mg）。

3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物1：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：414.3，分子式C29H50O，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。3 種溶劑展開體系分別為石油醚-乙酸乙酯、石油醚-丙酮、二氯甲烷-甲醇與對(duì)照品Rf 值相同。1H-NMR（500 MHz，CDCl3） δ：0.69（3H，s，H-18），0.79～0.87（9H，m，H-26，27，29），0.93（3H，d，J ＝6.4 Hz H-21），1.02（3H，s，H-19），2.20～3.29（2H，m，H-4），3.49（1H，brs，H-3），5.35（1H，s，H-6）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］基本一致，故鑒定為β-谷甾醇。

化合物2：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：454.3，分子式C30H46O3，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.88（3H，s，H-25），0.92（3H，d，J ＝6.2 Hz，H-30），1.00（3H，d，J ＝6.1 Hz，H-29），1.08，1.10，1.12，1.13（each 3H，s，H-26，H-24，H-23，H-27），2.21（1H，d，J ＝11.3 Hz，H-18），5.31（1H，brs，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：39.0（C-1），19.9（C-2），217.7（C-3），39.4（C-4），55.6（C-5），19.6（C-6），33.7（C-7），40.6（C-8），48.8（C-9），37.1（C-10），23.8（C-11），125.9（C-12），138.5（C-13），42.7（C-14），26.9（C-15），24.5（C-16），48.4（C-17），52.9（C-18），39.7（C-19），39.8（C-20），31.0（C-21），37.1（C-22），28.4（C-23），21.8（C-24），15.6（C-25），15.9（C-26），23.8（C-27），184.1（C-28），17.3（C-29），21.6（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［7］基本一致，故鑒定為3-氧代-12-烯-28-烏蘇酸。

化合物3：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：456.3，分子式C30H48O3，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。多種溶劑展開體系與對(duì)照品Rf 值相同。1HNMR（500 MHz，CDCl3） δ：0.70（3H，s，H-24），0.75（3H，s，H-25），0.80（3H，d，J ＝6.3 Hz，H-29），0.88，0.93，1.03，1.20，（each 3H，s，H-30，23，26，27），2.12（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-18），3.16（1H，dd，J ＝11.3，4.7 Hz，H-3），5.20（1H，t，J ＝11.1 Hz，H-12）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［8］基本一致，故鑒定為烏蘇酸。

化合物4：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：488.3，分子式C30H48O5，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.92（3H，s，H-30），0.95（3H，s，H-29），1.01（3H，s，H-25），1.05（3H，s，H-27），1.17（3H，s，H-26），1.70（3H，s，H-23），3.83（1H，d，J ＝10.9 Hz，H-24），4.12（1H，d，J ＝10.7 Hz，H-3），4.45（1H，d，J ＝10.9 Hz H-24′），4.60（1H，brs，H-2），5.45（1H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：43.0（C-1），66.1（C-2），74.0（C-3），44.0（C-4），49.3（C-5），19.0（C-6），33.8（C-7），40.3（C-8），48.0（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.5（C-12），138.9（C-13），42.7（C-14），28.8（C-15），25.1（C-16），48.2（C-17），53.5（C-18），39.5（C-19），39.5（C-20），31.2（C-21），37.5（C-22），23.9（C-23），65.5（C-24），17.0（C-25），17.2（C-26），23.9（C-27），180.5（C-28），17.5（C-29），21.4（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［9］基本一致，故鑒定為2α，3α，24-三羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物5：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：488.3，分子式C30H48O5，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.88（3H，d，J ＝6.4 Hz，H-30），0.93（3H，s，J ＝6.3，H-29），0.85，0.97，1.03，1.10（each 3H，s），1.05（3H，d，J ＝11.1 Hz，），2.60（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-18），3.74，3.89（each 1H，d，J ＝10.9 Hz，H-23），4.11（1H，d，J ＝10.7 Hz H-3），4.25（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-2），5.45（1H，s，H-12）；13CNMR（125 MHz，C5D5N） δ：42.9（C-1），66.3（C-2），79.0（C-3），50.3（C-4），43.5（C-5），18.5（C-6），33.3（C-7），42.0（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.3（C-12），139.5（C-13），42.7（C-14），28.8（C-15），25.0（C-16），48.1（C-17），53.5（C-18），39.3（C-19），39.4（C-20），31.1（C-21），37.5（C-22），71.3（C-23），17.0（C-24），17.3（C-25），17.5（C-26），24.0（C-27），180.0（C-28），17.9（C-29），21.2（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］基本一致，故鑒定為2α，3α，23-三羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物6：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：472.3，分子式C30H48O4，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.97（3H，d，J ＝6.4 Hz，H-30），0.98（3H，d，J ＝4.8 Hz，H-29），0.96，1.03，1.05，1.20，1.27（each 3H，s，-CH3），2.61（1H，d，J ＝11.3 Hz，H-18），3.41（1H，d，J ＝9.2 Hz，H-3），4.10（1H，t，J ＝7.8，H-2），5.47（1H，brs，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：48.1（C-1），68.7（C-2），83.9（C-3），39.5（C-4），56.0（C-5），19.0（C-6），33.6（C-7），40.3（C-8），48.1（C-9），38.5（C-10），23.9（C-11），125.5（C-12），139.5（C-13），42.8（C-14），28.8（C-15），25.0（C-16），48.3（C-17），53.4（C-18），40.0（C-19），39.5（C-20），31.2（C-21），37.6（C-22），29.5（C-23），17.9（C-24），17.7（C-25），17.5（C-26），24.0（C-27），181.0（C-28），17.1（C-29），21.6（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［11］基本一致，故鑒定為2α，3β-二羥基齊墩果烷-12-烯-28 酸。

化合物7：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：504.3，分子式C30H48O6，硫酸鈰噴霧后加熱顯紫紅色。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.92（3H，d，J ＝6.5 Hz，H-30），0.96（3H，d，J ＝6.3 Hz，H-29），1.05，1.10，1.13，（each 3H，s，-CH3），2.59（1H，d，J ＝11.1 Hz，H-18），3.99（1H，d，J ＝11.2 Hz，H-24′），4.28（1H，d，J ＝10.8 Hz，H-23′），4.33（1H，d，J ＝9.6 Hz，H-3），4.43（1H，m，H-2），4.56（1H，d，J ＝11.1 Hz，H-24），4.85（1H，d，J ＝10.9 Hz，H-23），5.46（1H，s，H-12）；13C-NMR（125 MHz，C5D5N） δ：48.1（C-1），69.1（C-2），79.9（C-3），47.4（C-4），44.8（C-5），19.1（C-6），33.7（C-7），40.5（C-8），47.9（C-9），38.1（C-10），24.3（C-11），127.9（C-12），139.9（C-13），42.1（C-14），29.0（C-15），26.5（C-16），48.3（C-17），54.7（C-18），72.7（C-19），42.2（C-20），26.9（C-21），38.5（C-22），69.0（C-23），64.1（C-24），16.9（C-25），16.8（C-26），24.5（C-27），180.5（C-28），27.1（C-29），17.0（C-30）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［10］基本一致，故鑒定為2α，3β，23，24-四羥基烏蘇烷-12-烯-28 酸。

化合物8：白色固體粉末（甲醇），ESI-MS m／z：576.4，分子式C35H60O6。多種溶劑展開體系與對(duì)照品Rf 值相同。1H-NMR（500 MHz，C5D5N） δ：0.68（3H，s，H-18），0.86～0.89（6H，m，H-26，27），0.92（3H，s，H-29），0.96（3H，s，H-19），1.01（3H，d，J ＝6.4 Hz，CH3），2.49～2.81（1H，m，H-4），5.35（1H，d，J ＝4.5 Hz，H-6），5.01（1H，d，J ＝7.7 Hz，Glc H-1），3.75～3.92（7H，m，H-3，葡糖糖上6 個(gè)H）。以上數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)［6］基本一致，故鑒定為胡蘿卜苷。

4 活性篩選

實(shí)驗(yàn)結(jié)果用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)均以（）表示，采用兩獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4.1 MTT 實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［5］，采用MTT 實(shí)驗(yàn)檢測化合物在不同濃度下對(duì)乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231 的細(xì)胞毒性，結(jié)果顯示，化合物3～6 在10、50 μmol／L 濃度作用下均能明顯抑制MDA-MB-231細(xì)胞的增殖，顯示出較強(qiáng)的細(xì)胞毒性，而化合物2、7 在10 μmol／L 濃度作用下沒有細(xì)胞毒作用，對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的增殖沒有影響?；衔?、8 在10、50 μmol／L 濃度作用下均沒有細(xì)胞毒作用，見表1。

表1 各化合物對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的生長抑制率（）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on MDA-MB-231 cells（）

表1 各化合物對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞的生長抑制率（）Tab.1 Inhibition rate of various compounds on MDA-MB-231 cells（）

注：與對(duì)照組比較，?P＜0.05，??P＜0.01。

4.2 劃痕實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［5］，劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示化合物7 能夠劑量依賴性地抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的遷移，其IC50值為1.161 μmol／L。LY294002是磷脂酰肌醇3-激酶的特異性抑制劑，能夠明顯抑制腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移。在10 μmol／L 濃度下，化合物7 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞遷移抑制的效果明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照藥LY294002（10 μmol／L），見圖1。

4.3 Transwell 實(shí)驗(yàn) 參考文獻(xiàn)［5］，進(jìn)一步采用Transwell 實(shí)驗(yàn)測定化合物7 在非細(xì)胞毒劑量下對(duì)乳腺癌MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲的影響，見圖2，化合物7 能夠明顯抑制MDA-MB-231 細(xì)胞的侵襲，并呈一定劑量依賴性，IC50值為1.091 μmol／L。在10 μmol／L 濃度下，化合物7 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲抑制的效果明顯強(qiáng)于陽性對(duì)照藥LY294002（10 μmol／L）。

圖2 化合物7 對(duì)MDA-MB-231 細(xì)胞侵襲的影響Fig.2 Effect of compound 7 on invasion of MDA-MB-231 cells

5 討論

在眾多有關(guān)藤梨根藥理活性的研究報(bào)道中，關(guān)于抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用方面的研究鮮有報(bào)道。郭清戈、郭勇等［12-13］發(fā)現(xiàn)復(fù)方藤梨根制劑能夠有效抑制小鼠結(jié)腸癌人工肺轉(zhuǎn)移。徐玲等［14］發(fā)現(xiàn)復(fù)方藤梨根制劑能夠有效抑制胃癌轉(zhuǎn)移，其機(jī)制可能與下調(diào)HPA、 MMP-9 基因的表達(dá)有關(guān)。張廣順等［15］發(fā)現(xiàn)藤梨根總?cè)苹衔锬軌蛎黠@抑制胃癌細(xì)胞的侵襲。以上研究僅限于藤梨根復(fù)方制劑和總?cè)苹衔?，而關(guān)于藤梨根單體化合物的抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性研究尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)從藤梨根中共分離得到8 個(gè)化合物，其中化合物2、7 從該植物中首次分離得到。本研究前期通過MTT 實(shí)驗(yàn)確定了化合物的非細(xì)胞毒劑量，繼而采用劃痕和Transwell 實(shí)驗(yàn)，評(píng)價(jià)化合物7 對(duì)體外乳腺癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響。結(jié)果顯示化合物7 具有明顯的體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，其作用機(jī)制可能與抑制乳腺癌細(xì)胞遷移和侵襲相關(guān)。研究首次確定了藤梨根中單體化合物具有明顯的體外抗腫瘤轉(zhuǎn)移活性，以期為中藥藤梨根的現(xiàn)代應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，為抗腫瘤轉(zhuǎn)移藥物的開發(fā)奠定基礎(chǔ)。