壽斌耀 ，陳蘭英? ，張 妮，謝欣序，羅穎穎，邵 峰，劉榮華

（1.江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥固體制劑制造技術(shù)國家工程研究中心，江西南昌 330006；2.江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，江西南昌 330004）

降香Dalbergia odorifera T.Chen，為豆科植物降香檀樹干和根的干燥心材，具有行氣止痛、化瘀止血的功效［1］。其成分復(fù)雜，主要含有揮發(fā)油、黃酮類?，F(xiàn)代研究表明降香具有抗氧化、抗炎、抗血小板聚集等多種作用［2］。臨床上降香被廣泛用于心血管疾病的治療。然而，降香在心血管方面的作用及機制仍不明確。本研究以降香中醫(yī)功效行氣止痛為起點，探索降香的藥理作用與機制。行氣是指進入心臟的氣（氧氣和水谷精微），產(chǎn)生ATP，進而維持心肌正常結(jié)構(gòu)與功能［3］，其與能量代謝密切相關(guān)。同時研究報道指出降香油（volatile oil of D.odorifera，DOO）、降香水提物（aqueous extract of D.odorifera，DOA）具有調(diào)節(jié)心臟正常能量代謝的作用［4］。基于此，為進一步研究降香水提物與降香油對心臟的影響，實驗構(gòu)建異丙腎上腺素誘導(dǎo)的急性心肌缺血模型，探究降香水提物和降香油對缺血大鼠心臟能量代謝的影響及可能機制，以期為降香的臨床使用提供實驗數(shù)據(jù)和指導(dǎo)。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF 級SD 大鼠，雄性，體質(zhì)量180～220 g，購于湖南斯萊克景達(dá)實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號SCXK（湘）2019-0004。

1.2 試劑與藥物 實驗用降香藥材購于廣西玉林東盟藥材市場，由廣西大學(xué)林產(chǎn)品質(zhì)量檢測中心檢測鑒定。降香水提物（自制）和降香油（自制），均由江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院劉榮華教授團隊提供。降香水提物的制備（降香藥材陰干粉碎后1 kg，加10 L 水提取1 h，濾過。濾渣用8 L 水再提取1 h，濾過，合并濾液，濃縮干燥，得到干浸膏，得干浸膏93.8 g，得膏率9.38%）。降香油的制備（降香藥材1 kg，水蒸氣蒸餾法回流提取6 h。收集餾出液，通過分液處理得到油性成分，得到降香油21.5 g，得油率2.15%）；異丙腎上腺素（批號WXBB7695V，美國Sigma 公司）；鹽酸普萘洛爾片（批號E180913，江蘇亞邦愛普森藥業(yè)有限公司）；乳酸脫氫酶（LDH）測定試劑盒（批號 R1 AR796，R2 AP318）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）測定試劑盒（批號R1 AR792，R2 TG862），均購于日本和光純藥株式會社；肌酸激酶同工酶MB（CKMB）測定試劑盒（批號18111001，北京利德曼生化股份有限公司）；蘇木精及伊紅染液（批號517-28-2，美國Sigma 公司）；三磷酸腺苷二鈉（批號140674-201502）、一磷酸腺苷鈉（批號140719-200501）、二磷酸腺苷二鈉（批號140809-201501），均購自于中國食品藥品檢定研究院；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號K1622）、SYBR Green mix 試劑盒（批號4472908），均購于美國Thermo Fisher 公司。

1.3 儀器 Centrifuge5810R 高速冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；ABI750 型熒光定量PCR 儀（美國ABI 公司）；ML204E 分析天平（瑞士Mettler Tiledo 公司）；亞光YB-6LF 型生物組織石蠟包埋機（孝感市亞光醫(yī)用電子技術(shù)有限公司）；日立7100全自動生化分析儀（日本日立公司）；常壓高效液相色譜儀（日本島津公司）；ML866 型Powerlab 電生理記錄儀（澳大利亞ADI Instruments 公司）；RM2016 型輪轉(zhuǎn)式切片機（德國Leica 公司）。

2 方法

2.1 動物造模及給藥 取健康大鼠70 只，適應(yīng)環(huán)境后按體質(zhì)重隨機分成7 組，分別為正常組（給予等容量蒸餾水），模型組（給予等容量蒸餾水），普萘洛爾（30 mg／kg），降香水提物高劑量組（320 mg／kg）、降香水提物低劑量組（160 mg／kg），降香油高劑量組（72 mg／kg）、降香油低劑量組（36 mg／kg）。連續(xù)灌胃給藥5 d。根據(jù)文獻(xiàn)［5］方法以及實驗室前期對造模劑量的摸索，第4 天、第5 天，灌胃給藥30 min 后，除正常組外，其余各組皮下注射異丙腎上腺素30 mg／kg，每天1 次，連續(xù)注射2 d，復(fù)制急性心肌缺血模型。正常組皮下注射等體積的生理鹽水。實驗期間自由進水，進食。

2.2 大鼠心電圖測定 末次給藥40 min 后，腹腔注射10%水合氯醛麻醉大鼠，仰臥固定，Powerlab電生理記錄儀記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖10 min。在皮下注射異丙腎上腺素或者生理鹽水后繼續(xù)觀察30 min，比較各組大鼠造模前后的ST 段差值。

2.3 大鼠血壓的測定 心電圖檢測完畢后，自大鼠頸部正中切開，促使大鼠左頸總動脈充分暴露，并對其進行鈍性分離，將頸總動脈遠(yuǎn)心端結(jié)扎，近心端用動脈夾夾住，將準(zhǔn)備好的頸動脈插管向近心端插入，用近心端的穿線結(jié)扎動脈血管和導(dǎo)管，即可看到動脈的血壓波形，等動物穩(wěn)定后，就開始實驗內(nèi)容。測得收縮壓、舒張壓、平均動脈壓。

2.4 血清心肌酶LDH、CK-MB、AST 檢測 血壓檢測后，每只大鼠立即腹主動脈采血，室溫靜置1 h后低溫高速離心機以3 500 r／min 離心10 min，分離血清。全自動生化分析儀檢測血清LDH、CKMB、AST 水平。

2.5 心肌組織病理學(xué)觀察 取心臟組織，10%甲醛固定24 h 以上，然后進行常規(guī)石蠟包埋，切片（5 μm），HE 染色，封片最后在光學(xué)顯微鏡下觀察心肌組織病理變化。

2.6 HPLC 檢測心臟組織高能磷酸化合物含量按照文獻(xiàn)方法對心臟組織進行處理［6］，制備樣本。ODSHYPERSILC18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫25 ℃；流動相50 mmol／L 的磷酸鉀緩沖液（pH 6.5）；體積流量1 mL／min；紫外檢測波長254 nm；進樣量10 μL。根據(jù)以上檢測條件，測定心肌組織中ATP、ADP 和AMP 含量，其中總腺苷酸量TAN＝ATP+ADP+AMP；心肌細(xì)胞能荷EC ＝（ATP+1／2ADP）／TAN。

2.7 RT-PCR 法檢測心臟組織AMPK 相關(guān)基因的表達(dá) 取心臟組織按照trizol 試劑盒說明書提取RNA，測定RNA 的濃度，在總體積20 μL 的條件下逆轉(zhuǎn)錄RNA 得到cDNA。進行Real-time PCR。引物序列為VEGF（正向：CGGTGTGGTCTTTCGTCCTTC，反向：GGTTTGTCGTGTTTCTGGAAGTG ）；ENOS（正 向：GATGGCTGAACGAAGATTGC，反向：TATTTGATGCTCGGGACTGC）；β-actin（正向：ACAGTGGAGAACTGTGAGCA，反向：CTGCTCCCGGTTAGAGTAGG ）；AMPK（正向：TTGAAACCTGAAAATGTCCTGCT，反向：GGTGAGCCACAACTTGTTCTT）；CPT1（正向：TATGGTCAAGGTCCTCTCAGGT，反向：GAAGACGAATGGGTTTGAGTTC）；GLUT4（正向：ACTCAGGGCTAACATCAGGGT，反向：CTCAGGACAGAAGGGCAACAG）；PFKFB3（正向：AGCTGACTCGCTACCTCAAC，反向：GCCCACCATGACGATGACGG）；PKM2（正向：TTCCTGCCTCTTGGTATGAC，反向：CGGCTTGTTCCCTCCTAC）；PDH（正向：CCATCTCATCACTGCCTATCG，反向：AGCCTCCTCTTCGTCCTGTTA）；PI3K（正向：AACGACAAGCAGAAGT，反 向：CGAGGACAGCAACAT）。反應(yīng)條件按照ThermoFisher Real-time PCR 試劑盒?；虮磉_(dá)計算由2-△△CT表示。

2.8 統(tǒng)計學(xué)處理 通過SPSS 19.0 軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（）表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比采用LSD 法。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 對急性心肌缺血大鼠心電圖的影響 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組ST 段變化值和心率升高（P ＜0.01），顯示心肌缺血；與模型組比較，降香各提取物組與普萘洛爾能顯著ST 段變化值（P＜0.01，P＜0.05）；降香油組能降低大鼠心率（P＜0.01）。見表1。

表1 降香水提取和降香油對急性心肌缺血大鼠心電圖ST段變化值與心率的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

表1 降香水提取和降香油對急性心肌缺血大鼠心電圖ST段變化值與心率的影響（，n＝6）Tab.1 Effects of DOA and DOO on ECG ST segment changes and heart rate in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6）

注：與正常組比較，??P ＜0.01；與模型組比較，＃ P ＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 對急性心肌大鼠血壓的影響 研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠的收縮壓、舒張壓均低于正常大鼠的收縮壓、舒張壓（P＜0.01）。給予降香油處理，大鼠收縮壓、舒張壓對比模型組有所恢復(fù)；普萘洛爾組和降香水提物組，大鼠收縮壓、舒張壓對比模型組無差異。見表2。

表2 降香水提物和降香油對急性心肌缺血大鼠收縮壓、舒張壓和平均動脈壓的影響（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

表2 降香水提物和降香油對急性心肌缺血大鼠收縮壓、舒張壓和平均動脈壓的影響（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）Tab.2 Effects of DOA and DOO on systolic blood pressure，diastolic blood pressure and mean arterial pressure in rats with acute myocardial ischemia（，n＝6，1 mmHg＝0.133 3 kPa）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.3 對血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響 實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組比較，模型組大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平升高（P＜0.01）。與模型組比較，除了降香水提物低劑量組外其余各組都能降低血清LDH、CK-MB、AST 水平（P＜0.05，P＜0.01）；降香水提物低劑量組能降低血清CK-MB、AST 水平（P＜0.05）。見表3。

3.4 對組織病理學(xué)的影響 HE 染色結(jié)果顯示，正常組大鼠心肌纖維排列整齊，細(xì)胞核形態(tài)正常，未出現(xiàn)炎性細(xì)胞浸潤等情況。模型組大鼠心肌損傷明顯、心肌纖維斷裂、排列紊亂、空泡化明顯、炎性細(xì)胞浸潤。普萘洛爾組心肌纖維排列整齊，細(xì)胞間質(zhì)內(nèi)可見炎性細(xì)胞浸潤。降香油高劑量組與降香油低劑量組大鼠心肌纖維輕度排列紊亂，局部少量炎性細(xì)胞浸潤。降香水提物高劑量組大鼠心肌纖維中度紊亂，輕中度空泡樣變性，輕度水腫，間質(zhì)少量炎性細(xì)胞浸潤。降香水提物低劑量組大鼠心肌纖維斷裂，細(xì)胞空泡變性明顯，間質(zhì)有明顯炎性細(xì)胞浸潤。見圖1。

表3 降香水提物和降香油對急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

表3 降香水提物和降香油對急性心肌缺血大鼠血清LDH、CK-MB、AST 水平的影響（，n＝10）Tab.3 Effects of DOA and DOO on serum LDH，CK-MB and AST levels in rats with acute myocardial ischemia（，n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.5 對心臟組織高能磷酸化合物及能荷的影響 在本實驗中，ATP、ADP、AMP 在10 min 內(nèi)達(dá)到基線分離，保留時間為3.259、3.510、4.314 min。見圖2。與正常組比較，模型組心肌組織高能磷酸化合物含量和細(xì)胞能荷EC 水平下降（P＜0.01）；與模型組比較，普萘洛爾組能夠明顯改善心肌能量代謝，心肌組織ATP 含量和能荷EC 水平提升（P＜0.01）。降香水提物和降香油各組在ATP、ADP、AMP 水平?jīng)]有明顯改善，在能荷EC 水平上提升（P＜0.01）。見表4。

圖2 心肌提取液樣本與ATP、ADP、AMP 標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖Fig.2 Chromatograms of myocardial extract samples and ATP，ADP，AMP standards

表4 降香水提物和降香油對心臟組織ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影響（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

表4 降香水提物和降香油對心臟組織ATP、ADP、AMP 及能荷EC 的影響（，n＝6）Tab.4 Effects of DOA and DOO on cardiac tissue ATP，ADP，AMP and energy charge（，n＝6）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.6 對心臟組織VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 水平的影響 與正常組比較，模型組AMPK、 CPT1、PI3K、 VEGF mRNA 表達(dá)降低（P ＜0.05，P ＜0.01），PFKFB3、 PKM2 mRNA 表達(dá)上升高（P ＜0.01），ENOS mRNA 表達(dá)有降低趨勢；與模型組比較，降香水提物各組PFKFB3、 PKM2 mRNA 表達(dá)降低（P＜0.01），PI3K、 ENOS、 VEGF mRNA 表達(dá)升高（P＜0.01），高低劑量組存在量效關(guān)系。降香油各組AMPK、 CPT1mRNA 顯著升高（P ＜0.01），高劑量組表達(dá)更顯著。見圖3。

4 討論

圖3 降香水提物和降香油對VEGF、 ENOS、 CPT1、 AMPK、 GLUT4、 PFKFB3、 PKM2、 PDH、 PI3K mRNA 表達(dá)的影響Fig.3 Effects of DOA and DOO on VEGF，ENOS，CPT1，AMPK，GLUT4，PFKFB3，PKM2，PDH，PI3K mRNA expressions

脂質(zhì)代謝、糖代謝是心肌細(xì)胞維持正常能量代謝的主要途徑。其中脂肪酸是心臟的主要能量來源，約60%～70%的三磷酸腺苷（ATP）是由脂肪酸通過脂肪酸β 氧化產(chǎn)生。在整個脂肪酸β 氧化中脂酰CoA 進入線粒體是脂肪酸氧化的限速步驟，CPT-1 蛋白位于線粒體外膜是脂肪酸氧化的限速酶［7-8］。葡萄糖是心臟代謝的另一種重要底物，葡萄糖代謝是一種高效率的能量代謝方式。通過糖酵解產(chǎn)生丙酮酸，丙酮酸進入線粒體后在丙酮酸脫氫酶（PDH）的作用下不可逆的轉(zhuǎn)化為乙酰CoA 和NADH，PDH 是葡萄糖氧化過程中的關(guān)鍵酶。心肌缺血，心肌細(xì)胞氧氣供應(yīng)減少，能量代謝改變，主要表現(xiàn)為脂肪酸與葡萄糖氧化的變化［9］。本實驗結(jié)果表明異丙腎上腺素造模后，模型組心臟組織ATP、ADP、AMP 整體下降，心肌細(xì)胞能量狀態(tài)EC 水平明顯降低。普萘洛爾組心臟組織ATP 含量較模型組顯著上升，心肌細(xì)胞能量狀態(tài)EC 水平明顯提升。降香水提物與降香油組ATP、ADP、AMP、TAN 與模型組比較并無差異，但是心肌細(xì)胞能荷EC 水平卻明顯升高，表明了降香水提物與降香油能夠在低能量水平維持正常的心肌細(xì)胞能荷EC。另外，實驗數(shù)據(jù)也表示降香水提物組能夠抑制葡萄糖有氧代謝的關(guān)鍵酶PDH 的表達(dá)，增強VEGF、 PI3K、 ENOS 基因的表達(dá)；VEGF 是多方位影響血管內(nèi)皮細(xì)胞的生產(chǎn)因子，其介導(dǎo)血管新生是微細(xì)血管增殖、新生血管形成的關(guān)鍵因素［10］。降香油能夠增強AMPK 基因的表達(dá)。腺苷酸激活蛋白激酶AMPK 是CPT1 的正向基因，能夠調(diào)節(jié)多種脂質(zhì)代謝相關(guān)酶及轉(zhuǎn)錄因子，在維持脂質(zhì)代謝穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮著極其重要的作用［11］。實驗表明降香水提物和降香油能夠調(diào)節(jié)脂肪酸氧化與糖代謝，維持心肌細(xì)胞能量代謝的平衡，從而起到保護心肌的作用。

在本研究中，課題組發(fā)現(xiàn)降香抑制糖代謝，增強脂肪酸氧化調(diào)控心肌能量代謝平衡，保護心臟的作用這一機制與市場上的一些藥物如曲美他嗪、哌克昔林通過抑制脂肪酸氧化，增強糖代謝發(fā)揮心肌保護作用的機制相反；與正常心臟能量代謝中脂肪酸氧化占比高于糖代謝這一情況相同。分析其可能原因為強糖代謝、抑制脂肪酸氧化，能夠用更少的氧氣提供更多的能量［12］，能夠緩解心肌缺血心臟能量供需不平。而增強脂肪酸氧化、抑制糖代謝，更有利于維持心臟的正常能量代謝，在治療心絞痛，預(yù)防心肌缺血上發(fā)揮更大的作用。

實驗研究結(jié)果顯示降香水提物和降香油對異丙腎上腺素誘導(dǎo)的大鼠急性心肌缺血模型具有保護作用，可以明顯降低心電圖ST 段變化，降低血清心肌酶CK-MB、LDH 及AST 的水平，減輕心肌組織形態(tài)結(jié)構(gòu)的損傷。進一步的機制研究結(jié)果顯示，降香油主要是通過上調(diào)AMPK、CPT1 增強脂肪酸氧化維持能量代謝平衡，降香水提物主要通過抑制PKM2、PFKFB3 抑制糖酵解途徑來維持能量代謝平衡。