王西彬，左瑞庭

［1.河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院） 脊柱科，河南鄭州 450002；2.河南省中醫(yī)院（河南中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院） 風(fēng)濕科，河南鄭州 450002］

強(qiáng)直性脊柱炎（ankylosing spondylitis，AS）是一種主要累及骶髂關(guān)節(jié)、脊柱的慢性進(jìn)行性炎性疾病，嚴(yán)重者可致脊柱畸形和關(guān)節(jié)強(qiáng)直［1］。至今該病發(fā)病機(jī)制仍未明確，目前亦無(wú)根治方法，患者后期可因關(guān)節(jié)強(qiáng)直致殘，嚴(yán)重影響患者生存質(zhì)量［2-3］。骶髂關(guān)節(jié)炎是AS 的主要標(biāo)志特點(diǎn)，骶髂關(guān)節(jié)病理組織活檢發(fā)現(xiàn)，骶髂關(guān)節(jié)炎以軟骨破壞、纖維化等變性，軟骨下骨板及骨髓炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、血管翳形成、骨質(zhì)破壞等為主要表現(xiàn)。軟骨細(xì)胞是關(guān)節(jié)軟骨中的唯一一種細(xì)胞，在維持關(guān)節(jié)功能方面發(fā)揮著重要作用。因此，研究骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的損傷，能夠?yàn)轺诀年P(guān)節(jié)炎的治療提供理論依據(jù)，對(duì)早期阻斷或者延緩關(guān)節(jié)強(qiáng)直的發(fā)生具有重大的臨床意義。

金絲桃苷，又名槲皮素-3-O-β-D-吡喃半乳糖苷，是一種天然的黃酮醇苷類化合物，存在于金絲桃科、薔薇科、桔梗科、唇形科等多種植物中，具有抗氧化、抗炎、心肌保護(hù)等多種藥理學(xué)活性［4-5］，在腫瘤、心肌缺血、肝損傷等多種疾病中具有重要的作用［6-8］，但金絲桃苷對(duì)于軟骨細(xì)胞損傷的作用未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道，因此，本研究用白介素（interleukin，IL）-1β 誘導(dǎo)小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷模型，觀察金絲桃苷對(duì)于軟骨細(xì)胞損傷的作用并進(jìn)行初步的機(jī)制探討，以期為臨床治療關(guān)節(jié)炎提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料 金絲桃苷標(biāo)準(zhǔn)品（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%，批號(hào)B20631，上海源葉生物科技有限公司）；IL-1β（美國(guó)Sigma 公司，批號(hào)SRP8033）；DMEM 培養(yǎng)液（批號(hào) 12491023）、胎牛血清（批號(hào)2094466RP）、Ⅱ型膠原酶（批號(hào)17101015、胰蛋白酶（批號(hào)25300054）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；MTT（批號(hào)G020-1-1）、IL-6（批號(hào)H007）、TNF-α（批號(hào)H052）、Col-Ⅰ（批號(hào)H142）和Col-Ⅲ（批號(hào)H144）等ELISA 檢測(cè)試劑盒均購(gòu)于由南京建成生物工程研究所；PMSF（批號(hào)ST505）、RIPA 細(xì)胞裂解液（批號(hào)P0013C）和BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（批號(hào)P0012S）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；PVDF 膜購(gòu)自美國(guó) Millipore 公司（批號(hào)HVLP2932A）；抗MMP-3（批號(hào)ab52915）、MMP-9（批號(hào)ab38898）、p-IκB-α（批號(hào)ab133462）、pp65（批號(hào)ab28856）和GAPDH（批號(hào)M00227-5）等一抗購(gòu)于美國(guó)Abcam 公司和武漢博士德生物工程有限公司；相應(yīng)的IgG 購(gòu)自北京中杉金橋生物有限公司（批號(hào)ZF0311）。

1.2 方法

1.2.1 軟骨細(xì)胞分離和培養(yǎng)［9］在無(wú)菌條件下，將BALB／c 小鼠 ［生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（豫）2017-0001］骶髂關(guān)節(jié)軟骨收集在磷酸鹽緩沖液中，清洗3 次，剪成l mm3左右的組織塊，轉(zhuǎn)入無(wú)菌離心管中，加0.05% Ⅱ型膠原酶消化30 min，反復(fù)洗滌、離心。然后加入2 g／L Ⅱ型膠原酶溶液及2.5 g／L 胰蛋白酶溶液振蕩消化，置于37 ℃水浴中輕微振蕩消化，直至軟骨組織塊基本消失、溶液變混濁為止。計(jì)數(shù)細(xì)胞，以1×109／L 的密度接種細(xì)胞，每2 d 換液1 次。當(dāng)原代細(xì)胞融合并覆蓋瓶底80%以上時(shí)，用2.5 g／L 胰蛋白酶消化，按1 ∶2比例傳代。

1.2.2 細(xì)胞處理及分組 用25、50、100 μg／mL金絲桃苷分別處理細(xì)胞24 h 后，然后直接用5 ng／mL IL-1β 繼續(xù)處理細(xì)胞24 h，或單獨(dú)用5 ng／mL IL-1β 處理細(xì)胞24 h。因而可以將細(xì)胞分為5 組，對(duì)照組、IL-1β 組、金絲桃苷（25、50、100 μg／mL）組。

1.2.3 MTT 檢測(cè) 將細(xì)胞接種到96 孔板上，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。然后每孔加入10 μL MTT 試劑（0.5 mg／mL），在培養(yǎng)箱中孵育4 h后棄去培養(yǎng)基，每孔加入150 μL 二甲基亞砜溶液，震蕩溶解15 min，于酶標(biāo)儀處檢測(cè)OD 值。

1.2.4 ELISA 檢測(cè) 分別根據(jù)試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 Western blot 檢測(cè) 將細(xì)胞接種到24 孔板上，每組設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔，分別進(jìn)行不同處理。每孔加入RIPA 裂解液與PMSF 的混合液（100 ∶1）裂解細(xì)胞15 min，離心收集上清提取總蛋白。然后用BCA 蛋白定量試劑盒法測(cè)定蛋白樣品濃度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算上樣量，然后進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，用5% BSA 于37 ℃搖床封閉1 h。隨后進(jìn)行Ⅰ抗4 ℃孵育過(guò)夜，漂洗3 次（5 min／次）。再將PVDF 膜用相應(yīng)Ⅱ抗室溫孵育1 h，漂洗4 次（5 min／次）。經(jīng)Odyssey 紅外激光成像系統(tǒng)掃描，目的蛋白與內(nèi)參GAPDH 灰度值的比值反映蛋白的表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以（）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni 檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響 分別用0、25、50、100、200 μg／mL 金絲桃苷處理軟骨細(xì)胞48 h，MTT 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，如圖1A 所示，各組細(xì)胞活性沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），說(shuō)明200 μg／mL 以下的金絲桃苷處理對(duì)軟骨細(xì)胞無(wú)毒性。25、50、100 μg／mL 金絲桃苷處理用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。如圖1B 所示，與對(duì)照組比較，IL-1β 導(dǎo)致軟骨細(xì)胞的活性下降（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性降低（P＜0.05）。

圖1 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞活性的影響Fig.1 Effects of hyperin on the chondrocyte viability of mice sacroiliac joint pre-induced with IL-1β

2.2 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎性因子的影響 如圖2 所示，與對(duì)照組比較，IL-1β 組的IL-6 和TNF-α 水平上調(diào)（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的IL-6 和TNF-α 水平上調(diào)（P ＜0.05）。

2.3 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膠原分泌的影響 如圖3 所示，與對(duì)照組比較，IL-1β 組的Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平上調(diào)（P ＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平上調(diào)（P ＜0.05）。

圖2 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞炎性因子的影響Fig.2 Effects of hyperin on the inflammatory cytokines of mice sacroiliac joint chondrocytes pre-induced with IL-1β

圖3 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞膠原分泌的影響Fig.3 Effects of hyperin on the collagen secretion of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

2.4 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMPs 的影響 如圖4 所示，與對(duì)照組比較，IL-1β 組的MMP-3 和MMP-9 水平上調(diào)（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的MMP-3 和MMP-9 水平上調(diào)（P＜0.05）。

圖4 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞MMPs 表達(dá)的影響Fig.4 Effects of hyperin on MMPs expression of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

2.5 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞NF-κB 通路的影響 如圖5 所示，與對(duì)照組比較，IL-1β 組的p-IκB-α 和p-p65 水平上調(diào)（P＜0.05）；與IL-1β 組比較，金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的p-IκB-α 和p-p65 水平上調(diào)（P＜0.05）。

圖5 金絲桃苷對(duì)IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞NF-κB 通路的影響Fig.5 Effects of hyperin on the NF-κB signaling pathway of mice sacroiliac joint chondrocytes inducted with IL-1β

3 討論

AS 的發(fā)病機(jī)制至今尚不清楚，主要以中軸脊柱、骶髂關(guān)節(jié)病變?yōu)橹鳎?0］，而軟骨細(xì)胞損傷是軟骨病變的重要表現(xiàn)［11］。目前，中藥單體化合物治療關(guān)節(jié)軟骨病變受到越來(lái)越多的關(guān)注［12］。馬勇等［13］研究表明，姜黃素對(duì)軟骨細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用，通過(guò)調(diào)節(jié)Wnt／β-catenin 信號(hào)通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖。劉益杰等［14］證實(shí)，淫羊藿苷能影響軟骨細(xì)胞基質(zhì)微環(huán)境，拮抗IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞退變。本研究發(fā)現(xiàn)，金絲桃苷能夠通過(guò)提高細(xì)胞活性、抑制炎性因子和ECM 紊亂抵抗IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞損傷。

作為關(guān)節(jié)軟骨中唯一的一種細(xì)胞成分，軟骨細(xì)胞能夠大量地生成和分泌膠原等ECM 組成成分；同時(shí)，軟骨細(xì)胞也能夠不斷地生成和分泌多種MMPs，降解消化變性、功能異常的ECM 蛋白，從而維持ECM 的合成與分解代謝穩(wěn)態(tài)。研究表明，IL-1β 在改變正常軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)、改變軟骨細(xì)胞ECM 方面發(fā)揮重要作用。在本研究中，發(fā)現(xiàn)IL-1β處理顯著抑制軟骨細(xì)胞活性，提高IL-6 和TNF-α水平，降低Col-Ⅰ和Col-Ⅲ的水平，并上調(diào)MMP-3和MMP-9 的表達(dá)；而金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的細(xì)胞活性下降，IL-6 和TNF-α 水平上升，Col-Ⅰ和Col-Ⅲ水平下降，以及MMP-3 和MMP-9 表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明，金絲桃苷能夠抵抗IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的損傷。

NF-κB 是一種具有多種功能的轉(zhuǎn)錄因子，而IκB 磷酸化將導(dǎo)致其降解，從而暴露出NF-κB 的核識(shí)別位點(diǎn)，游離的NF-κB 由此從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移進(jìn)入細(xì)胞核，進(jìn)而調(diào)控NF-κB 調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄。研究表明，軟骨細(xì)胞損傷與NF-κB 的過(guò)度激活密切相關(guān)［15］。而金絲桃苷能夠通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路在肺癌、急性肺損傷、肝硬化的治療過(guò)程中發(fā)揮重要作用［16-18］。在本研究中，發(fā)現(xiàn)IL-1β 處理顯著上調(diào)p-IκB-α和p-p65 的表達(dá)；而金絲桃苷呈濃度依賴性抑制IL-1β 誘導(dǎo)的p-IκB-α 和p-p65 的表達(dá)上調(diào)，表明金絲桃苷能夠通過(guò)抑制NF-κB 信號(hào)通路的激活來(lái)抵抗IL-1β 誘導(dǎo)的小鼠骶髂關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的損傷。

綜上所述，金絲桃苷能夠抑制IL-1β 誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞活性下降，降低炎性因子水平，并促進(jìn)ECM 平衡，這與其抑制NF-κB 信號(hào)通路有關(guān)。本研究提示金絲桃苷可能作為治療軟骨損傷，甚至骶髂關(guān)節(jié)炎的新藥物，但后期仍需大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究、臨床研究，為金絲桃苷治療骶髂關(guān)節(jié)炎提供強(qiáng)有力的理論支持。