徐志廣，張樸花

（南華大學(xué)附屬南華醫(yī)院，湖南衡陽(yáng) 421002）

肝臟缺血再灌注（hepatic ischemia-reperfusion，HIR）是肝臟切除或肝移植手術(shù)過(guò)程中不可避免的情況，其引起的損傷至今仍是一個(gè)重要的醫(yī)學(xué)問(wèn)題。已有研究表明［1］，炎癥和氧化應(yīng)激參與缺血再灌注損傷的發(fā)病機(jī)制，因此采用抗炎和抗氧化藥物治療HIR 損傷或許是一種有效的治療策略?；⒄溶帐菑幕⒄雀刑崛〉奶烊欢揭蚁╊?lèi)化合物，具有抗氧化、抗炎、改善微循環(huán)等多種藥理活性［2］。研究證實(shí)［3］，虎杖苷能通過(guò)發(fā)揮抗氧化和抗炎作用改善多器官的缺血再灌注損傷。然而，虎杖苷是否對(duì)HIR 誘導(dǎo)的肝損傷也有改善作用目前報(bào)道較少。核因子E2 相關(guān)因子2（nuclear factor erythroid-2 related factor 2，Nrf2）是一種氧化還原反應(yīng)性轉(zhuǎn)錄因子，是細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的主要調(diào)節(jié)因子，調(diào)控一系列抗氧化蛋白表達(dá)。此外，Nrf2 還被認(rèn)為是防治肝病的關(guān)鍵治療靶點(diǎn)［4］。因此，本研究擬通過(guò)干預(yù)Nrf2／HO-1 信號(hào)通路探討虎杖苷對(duì)HIR誘導(dǎo)的肝損傷的保護(hù)作用并初步闡明其作用機(jī)制，以期為虎杖苷應(yīng)用于臨床改善HIR 損傷提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 無(wú)特定病原體（SPF）級(jí)雄性SD 大鼠40 只，鼠齡6～7 周，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)自湖南昭泰生物醫(yī)藥有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)SYXK（湘）2017-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)條件為分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為20～23 ℃，相對(duì)濕度70%，光照周期12／12 h，自由飲水?dāng)z食。

1.2 試劑 虎杖苷（批號(hào)P1878，純度＞98%）購(gòu)自南京春秋生物工程有限公司；Nrf2 抑制劑ML385（批號(hào)HY-100523，純度99.55%）購(gòu)自美國(guó)Med-ChemExpress 公司；大鼠血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶（批號(hào)SBJ-M0650，alanine aminotransferase，ALT）檢測(cè)試劑盒和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（批號(hào)SBJ-M0078，aspartate aminotransferase，AST）檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京森貝伽生物科技有限公司；丙二醛（批號(hào)A003-1-1，malondialdehyde，MDA）水平檢測(cè)試劑盒和超氧化物歧化酶（批號(hào)A001-3-2，superoxide dismutase，SOD）活性檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自南京建成生物工程研究所；腫瘤壞死因子（批號(hào)E09-301，tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白細(xì)胞介素1β（批號(hào)E10-01，interleukin-1β，IL-1β）和白細(xì)胞介素6（批號(hào)E07-1131，interleukin-6，IL-6）ELISA檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自美國(guó)Ebioscience 公司；TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒（批號(hào)C1091）購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；兔抗Bcl-2 多克隆抗體（批號(hào)GR190314-1）、兔抗Bax 單克隆抗體（批號(hào)GR181216-2）、兔抗cleaved caspase-3 多克隆抗體（批號(hào)GR190404-1）、兔抗Nrf2 單克隆抗體（批號(hào)GR190211-2）、兔抗HO-1 多克隆抗體（批號(hào)GR181207-1）、兔抗β-actin 多克隆抗體抗體（批號(hào)GR190424-2）和兔抗lamin B1 單克隆抗體（批號(hào)GR190307-1）及辣根過(guò)氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG（批號(hào)GR190123-2）均購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司。

1.3 造模及分組 將SD 大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d 后，腹腔注射戊巴比妥（50 mg／kg）進(jìn)行麻醉，然后進(jìn)行中線剖腹術(shù)，再用血管夾夾持肝臟左側(cè)門(mén)靜脈支，造成70% 的肝臟缺血，觀察到肝正中葉和左側(cè)葉表面顏色由紅變灰白，提示缺血成功。缺血45 min 后取夾，再灌注6 h，灌注時(shí)之前灰白的肝臟組織顏色變紅。完成再灌注后，收集主動(dòng)脈血液標(biāo)本，并處死大鼠切除部分肝臟組織進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。采用隨機(jī)數(shù)字法將40 只SD 大鼠分為5 組（每組8 只）為假手術(shù)組、模型組、低劑量虎杖苷組、高劑量虎杖苷組、高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組。假手術(shù)組大鼠僅麻醉后開(kāi)腹，不阻斷肝臟血流，其余4 組均建立HIR 模型，并且低劑量虎杖苷組和高劑量虎杖苷組大鼠在造模前連續(xù)3 d 分別腹腔注射10、40 mg／kg 虎杖苷，每日1 次；高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠在高劑量虎杖苷組給藥處理方式的基礎(chǔ)上再給予腹腔注射30 mg／kg ML385，每日1 次；假手術(shù)組和模型組大鼠分別給予等體積生理鹽水。

1.4 血清指標(biāo)檢測(cè) 將血液樣品于4 ℃下5 000×g離心5 min，取血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）分別檢測(cè)血清ALT 和AST 活性以及血清TNF-α、IL-1β和IL-6 水平。

1.5 肝組織氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測(cè) 取肝左葉組織約1 mm3大小，加入適量（1 ∶10）組織蛋白抽提液，冰浴條件下充分碾碎，于4 ℃下12 000×g 離心20 min，取上清液按照試劑盒說(shuō)明書(shū)加入相應(yīng)試劑，37 ℃孵育10 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定各樣品吸光度值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線分別計(jì)算肝組織中SOD 活性和MDA 水平。

1.6 肝組織HE 染色 取部分肝左葉組織并置于10%中性福爾馬林緩沖液中固定24 h，將固定好的肝組織制成石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟、梯度濃度乙醇復(fù)水，蘇木精-伊紅染色后，中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察組織病理學(xué)改變。病理評(píng)分方法［5］為在顯微鏡下選擇10 個(gè)視野，觀察細(xì)胞核固縮、空泡形成、細(xì)胞質(zhì)染色消失、細(xì)胞核消失、紅細(xì)胞淤積以及炎性細(xì)胞浸潤(rùn)情況，根據(jù)病理學(xué)改變所占視野百分比計(jì)分，0 記0 分，0～10%記1 分，10%～50%記2 分，50%～100%記3 分。對(duì)6 項(xiàng)病理改變?cè)u(píng)分總和進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.7 肝組織TUNEL 染色 取石蠟切片，經(jīng)二甲苯脫蠟，濃度梯度乙醇復(fù)水，加入蛋白酶K 于室溫條件下孵育10 min，PBS 洗滌3 次，加入3% H2O2溶液室溫孵育10 min，滴加生物素標(biāo)記液于37 ℃避光孵育30 min，PBS 洗滌3 次，滴加二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）顯色液，室溫避光孵育15 min，蘇木精復(fù)染，濃度梯度乙醇脫水，二甲苯透明，中性樹(shù)脂封片，顯微鏡下可觀察陽(yáng)性細(xì)胞呈棕褐色。于高倍鏡下每張切片選擇5 個(gè)隨機(jī)視野統(tǒng)計(jì)500 個(gè)細(xì)胞，以陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目占統(tǒng)計(jì)的總細(xì)胞數(shù)目百分比表示細(xì)胞凋亡率。

1.8 Western Blot 檢測(cè)相關(guān)蛋白表達(dá) 將肝組織剪成小塊，加入RIPA 裂解液，冰上充分碾磨30 min，12 000×g 離心20 min，取上清液即為所提取蛋白溶液。另取部分肝組織，根據(jù)核蛋白提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取組織細(xì)胞核蛋白，均采用BCA 法測(cè)定蛋白濃度。取30 μg 蛋白沸水浴變性后，進(jìn)行10%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白，并將蛋白轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，加入5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，1×TBST 洗滌3 次，加入一抗cleaved caspase-3（1 ∶1 000）、Bax（1 ∶1 000）、Bcl-2（1 ∶1 000）、Nrf-2（1 ∶500）、HO-1（1 ∶1 000），β-actin（1 ∶2 000）和lamin B1（1 ∶1 000），置于4 ℃孵育過(guò)夜。用1×TBST 洗滌3 次后加入HRP標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，1×TBST 清洗3 次，加入增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光劑ECL 孵育1 min，曝光顯影。采用Image J 測(cè)定蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內(nèi)參蛋白灰度值的比值表示目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 分析軟件統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以（）表示。多組間比較采用單因素方差分析法進(jìn)行分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)進(jìn)行分析。 P ＜0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠血清ALT、AST 活性及肝組織病理學(xué)變化 如表1 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清ALT 和AST 活性均升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠血清ALT 和AST活性均降低（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠血清ALT 和AST 活性又升高（P＜0.01）。HE 染色結(jié)果（圖1）顯示，假手術(shù)組大鼠肝組織細(xì)胞形態(tài)正常，無(wú)明顯充血腫脹，未見(jiàn)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)；模型組和低劑量虎杖苷組大鼠肝組織內(nèi)可見(jiàn)大量細(xì)胞核固縮，細(xì)胞呈空泡樣，局部充血腫脹，大量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)以及肝細(xì)胞壞死；與假手術(shù)組比較，模型組病理評(píng)分升高（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織僅有少量細(xì)胞核固縮，局部充血腫脹得到明顯緩解，且有少量炎性細(xì)胞浸潤(rùn)及細(xì)胞壞死，病理評(píng)分明顯降低（P＜0.01）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織又出現(xiàn)大量細(xì)胞核固縮和細(xì)胞壞死，有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，病理評(píng)分明顯升高（P＜0.05）。

表1 各組大鼠ALT、AST 活性比較（，n＝8）Tab.1 Comparison of ALT and AST activities in rats among various groups（，n＝8）

表1 各組大鼠ALT、AST 活性比較（，n＝8）Tab.1 Comparison of ALT and AST activities in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

圖1 各組大鼠肝組織病理觀察（HE 染色，×400）Fig.1 Pathological observation of liver tissues of rats in various groups（HE staining，×400）

2.2 各組大鼠血清炎癥因子及肝組織氧化應(yīng)激水平變化 如表2～3 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平均增加（P＜0.01），而肝組織SOD 活性降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平均降低（P＜0.01），肝組織SOD 活性增加（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組則無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠血清TNF-α、IL-1β 和IL-6 水平以及肝組織MDA 水平增加（P ＜0.01），而肝組織SOD 活性降低（P＜0.01）。

2.3 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡水平 TUNEL 染色（圖2）顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡率降低（P ＜0.01），而低劑量虎杖苷組無(wú)明顯變化（P ＞0.05）；與高劑量虎杖苷比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組肝組織細(xì)胞凋亡率增加（P＜0.01）。Western blot（圖3）顯示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），而B(niǎo)cl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01），Bcl-2蛋白表達(dá)增加（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)增加（P ＜0.01），而B(niǎo)cl-2 蛋白表達(dá)降低（P＜0.01）。

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of serum levels of inflammatory factors in rats among various groups（，n＝8）

表2 各組大鼠血清炎癥因子水平比較（，n＝8）Tab.2 Comparison of serum levels of inflammatory factors in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激因子活性水平比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of levels of liver oxidative stress factors in rats among various groups（，n＝8）

表3 各組大鼠肝組織氧化應(yīng)激因子活性水平比較（，n＝8）Tab.3 Comparison of levels of liver oxidative stress factors in rats among various groups（，n＝8）

注：與假手術(shù)組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與高劑量虎杖苷組比較，△△P＜0.01。

圖2 各組大鼠肝組織細(xì)胞凋亡觀察（TUNEL 染色，×400）Fig.2 Observation of apoptosis of rat liver tissue cells in various groups（TUNEL staining，×400）

2.4 各組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá) 如圖4 所示，與假手術(shù)組比較，模型組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高（P ＜0.01）；與模型組比較，高劑量虎杖苷組大鼠肝組織Nrf2、HO-1 蛋白表達(dá)升高（P＜0.01），而低劑量虎杖苷組無(wú)明顯變化（P＞0.05）；與高劑量虎杖苷組比較，高劑量虎杖苷聯(lián)合Nrf2 抑制劑組大鼠肝組織Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)降低（P＜0.05，P＜0.01）。

3 討論

HIR 是影響肝移植和肝切除術(shù)后肝功能的一個(gè)主要因素［6］。HIR 的發(fā)病機(jī)制涉及多種因素，包括氧化應(yīng)激、線粒體損傷、趨化因子的產(chǎn)生等［7］。本研究通過(guò)阻斷肝血流45 min，再灌注6 h，引起HIR 損傷，結(jié)果表現(xiàn)為血清ALT 和AST 活性升高，肝損傷范圍從肝竇淤血腫脹到肝細(xì)胞壞死。這些結(jié)果與先前的研究結(jié)果一致［8-9］。表明成功構(gòu)建了大鼠HIR 模型。

圖3 虎杖苷對(duì)Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 蛋白表達(dá)的影響Fig.3 Effects of polydatin on protein expressions of Bcl-2，Bax and cleaved caspase-3

圖4 虎杖苷對(duì)HIR 大鼠Nrf2／HO-1 信號(hào)通路激活的影響Fig.4 Effects of polydatin on activation of Nrf2／HO-1 signaling pathway in HIR injury

虎杖苷作為從中藥虎杖根中分離出來(lái)的有效活性成分，具有抗氧化和抗炎活性［10］。已有研究提出虎杖苷對(duì)肝損傷具有保護(hù)作用，通過(guò)抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，防治非酒精性脂肪性肝炎和肝纖維化［11-12］。另外，虎杖苷還能通過(guò)抑制細(xì)胞凋亡改善對(duì)乙酰氨基酚藥物誘導(dǎo)的肝毒性［13］。這些研究說(shuō)明，虎杖苷通過(guò)抗氧化和抗炎對(duì)多種因素引起的肝損傷具有保護(hù)作用。另有研究證明虎杖苷對(duì)包括心臟，大腦和腎臟在內(nèi)的多器官缺血再灌注損傷的治療作用［3］。結(jié)合虎杖苷對(duì)肝損傷的保護(hù)作用，可以假設(shè)虎杖苷能改善HIR 誘導(dǎo)的肝損傷。

HIR 損傷主要由再灌注過(guò)程中產(chǎn)生的急性活性氧（ROS）誘導(dǎo)，急性ROS 引起氧化應(yīng)激，導(dǎo)致肝損傷和細(xì)胞凋亡。MDA 是脂質(zhì)過(guò)氧化終產(chǎn)物，具有細(xì)胞毒性，其水平可以用來(lái)評(píng)價(jià)細(xì)胞質(zhì)膜的受損程度。SOD 存在于所有正常細(xì)胞中，對(duì)ROS 自由基具有清除作用。在HIR 誘導(dǎo)的肝損傷中，抗氧化標(biāo)志物SOD 活性明顯降低。研究證明氧化應(yīng)激可以通過(guò)壞死或凋亡殺死細(xì)胞［14］。本研究中，虎杖苷能降低HIR 大鼠MDA 的水平，增加SOD 活性，間接驗(yàn)證了虎杖苷的抗氧化作用。同時(shí)，虎杖苷還能降低炎癥因子的表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡。

Nrf2 是一種多器官保護(hù)因子。正常生理?xiàng)l件下，在細(xì)胞質(zhì)中Nrf2 與KEAP1 結(jié)合形成復(fù)合物，當(dāng)發(fā)生氧化損傷，Nrf2 激活，導(dǎo)致復(fù)合物解離，Nrf2 轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核中并與抗氧化反應(yīng)原件結(jié)合，編碼多種抗氧化基因［15］。HO 酶系統(tǒng)在細(xì)胞應(yīng)激過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，通過(guò)血紅素間接發(fā)揮抗氧化和抗炎作用。在本研究中，HIR 大鼠肝組織Nrf2 的表達(dá)活性增加，這是HIR 引起的氧化應(yīng)激的適應(yīng)性反應(yīng)。在給與高劑量虎杖苷治療的HIR 大鼠中，加入Nrf2 抑制劑ML385 能明顯減弱虎杖苷對(duì)HIR大鼠肝損傷的治療作用，從側(cè)面驗(yàn)證了Nrf2 對(duì)HIR 具有保護(hù)作用［16］。在HIR 誘導(dǎo)的大鼠中，HO-1 水平的升高伴隨著顯著的肝損傷，這意味著應(yīng)激誘導(dǎo)的HO-1 升高不足以保護(hù)肝臟免受IR 引起的肝損傷［17］。在本研究中，虎杖苷能增加Nrf2和HO-1 蛋白表達(dá)，且加入Nrf2 抑制劑ML385 能降低Nrf2 和HO-1 蛋白表達(dá)，說(shuō)明虎杖苷對(duì)HIR 損傷的保護(hù)作用可能與Nrf2／HO-1 信號(hào)通路的激活有關(guān)。

綜上所述，虎杖苷通過(guò)激活Nrf2／HO-1 信號(hào)通路，抑制肝炎癥及氧化損傷，有效緩解HIR 誘導(dǎo)的肝損傷。