于子洛

流感是一種高發(fā)于冬春季的急性呼吸道疾病,具有極強的傳染性,若不及時對患者進行診治則可能造成大規(guī)模傳染,引發(fā)嚴重公共衛(wèi)生事件。一般流感是由流感病毒感染所致,但因其臨床表現(xiàn)與普通感冒相似,導致在前期檢測診斷時容易發(fā)生誤診或漏診的情況,不利于后期相關的防治。張群等［1］團隊通過研究發(fā)現(xiàn),可將實時熒光定量PCR 法應用于流感的檢測診斷,并在研究結果中表明該方法不僅具有較高的檢出率,同時還能有效分析其特異度等指標,為后期診療提供更多有利信息［2］。為驗證上述論點,本次研究將實時熒光定量PCR 法用于流感病毒的檢測,并通過對比方式分析該檢驗方式的應用價值,研究的方法及結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取本院于2019 年3 月～2020 年3 月收治的250例疑似流感患者,其中男137例,女113例；年齡16～83 歲,平均年齡(38.14±16.35)歲。納入標準：①患者體溫均在38～41℃；②患者均伴隨咳嗽、咽痛等臨床癥狀［3］；③患者均知曉本次研究內(nèi)容并簽署知情同意書。本次臨床研究符合赫爾辛基宣言,并已通過醫(yī)院倫理委員會審核并批準。排除標準：①合并嚴重心腦血管疾病,肝腎等臟器功能不足、惡性腫瘤患者；②合并其他傳染性疾病患者；③存在嚴重精神病癥,依從性低的患者；④一般資料不全或中途退出者。

1.2 方法

1.2.1 儀器及試劑 力新HFsafe1200 生物安全柜(BSC-1100IIB2-X1 濟南鑫貝西生物技術有限公司)、核酸提取儀［美國Applied Biosystems 公司(中科拜爾)］、MDF-382EN 三洋(美菱)超低溫冰箱、5415R 高速冷凍離心機(由德國Eppendrof 公司)、熒光定量PCR 擴增儀(美國life 公司)、核酸提取試劑盒(中科拜爾)。

1.2.2 標本采集 對患者進行咽拭子采集,每例患者均采取3 ml 標本,共采集2 次,并于24 h 內(nèi)進行送檢,樣本留置時間不宜過長。

1.2.3 病毒分離培養(yǎng)法 將采集的標本進行分離、接種,再根據(jù)類型進行分類,根據(jù)每瓶25 ml 的比例接種標本,每份標本接種3 份,于接種后2 d 觀察標本是否存在細胞病毒病變,若當標本內(nèi)細胞有80%以上受到病毒感染或?qū)?nèi)細胞連續(xù)培養(yǎng)7 d 后提取細胞,應用豚鼠血展開血凝實驗,當血凝滴度數(shù)值＜1∶8 或陰性培養(yǎng)物在后代培養(yǎng)均為陰性,則可以呈陰性標本,并將流感病毒進行分型。

1.2.4 實時熒光定量PCR 法 依照試劑盒說明提取RNA 及配置反應體系,在進行實時熒光定量PCR 法時對陽性及陰性進行對比,該反應流程包括：根據(jù)5 個循環(huán)分別將時間和環(huán)境溫度設置為：第1 循環(huán)：50℃,培養(yǎng)30 min；第2 循環(huán)：95℃,培養(yǎng)3 min；第3 循環(huán)：95℃,培養(yǎng)15 s；第4 循環(huán)：50℃,培養(yǎng)30 min；第5 循環(huán)：72℃,培養(yǎng)1 min；于10 s 設定95℃、40 s 設定55℃為40 個循環(huán)。其中將羧基熒光素(FAM)設定為熒光素,當在55℃時進行熒光信號的收集。

1.3 觀察指標 以細胞培養(yǎng)法檢測結果作為金標準,對比病毒分離培養(yǎng)法和實時熒光定量PCR 法檢測的陽性檢出率、靈敏度、特異度及準確率。

1.4 統(tǒng)計學方法 采用SPSS22.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。計數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兩種檢測方法陽性檢出率對比 細胞培養(yǎng)法檢測檢出140例陽性標本,110例陰性標本；病毒分離培養(yǎng)法檢出59例陽性標本,191例陰性標本,陽性檢出率為23.60%；實時熒光定量PCR 法檢出93例陽性標本,157例陰性標本,陽性檢出率為37.20%。實時熒光定量PCR 法陽性檢出率高于病毒分離培養(yǎng)法,差異有統(tǒng)計學意義(χ2=10.927,P=0.001＜0.05)。

2.2 兩種檢測方法靈敏度、特異度及準確率對比 實時熒光定量PCR 法的靈敏度62.14%、特異度94.55%及準確率76.40%均高于病毒分離培養(yǎng)法的31.43%、86.36%、55.60%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 兩種檢測方法靈敏度、特異度及準確率對比(%,n=250)

3 討論

由于流感臨床癥狀表現(xiàn)與普通感冒臨床癥狀差異不明顯,故在前期診斷時易發(fā)生誤診甚至漏診情況,進而影響后期相關診療。當前有關實驗室流感病毒診斷最常用的方式為病毒分離培養(yǎng)法及鑒定病毒。通過將采集自流感患者的咽拭子作為標本,對該標本內(nèi)的細胞進行培養(yǎng),并取受到感染的細胞進行分離,將病毒進行分型［4-6］。通過該診斷方式能夠確保流感病毒的抗原性,并使原始標本處于一致的狀態(tài),這有利于對標本的長時間保存,可更準確的分析病毒抗原性及其基因。雖然該方法具有較高的臨床診斷價值,但病毒培養(yǎng)難度較大,同時還需保證標本品質(zhì)高,載量足,若無法滿足上述要求,則容易在對病毒進行鑒定時出現(xiàn)假陰性或假陽性的情況,同時應用該方法分離出的病毒無法作為后期診療過程中的參照物,因此采取該檢測方法需要在收集、保存標本的過程中確保病毒的活性［7］。本次研究將實時熒光定量PCR 法應用于流感病毒的檢測中,該方法近年來被廣泛應用于多種病毒入侵致感染的檢測和診斷中,在病毒性傳染病的快速診斷、病毒分型、不同病毒的鑒別檢測、耐藥突變體檢測、新發(fā)傳染病病原體快速檢測等方面發(fā)揮著重要作用［8］。通過同時檢測4種熒光信號實現(xiàn)熒光定量PCR 法對不同分型流感病毒進行分型,對PCR 擴增反應中的每一個循環(huán)產(chǎn)物的熒光信號進行實時檢測,實現(xiàn)在該過程中定量以及定性分析起始模板到最后一個信號的收集,實時熒光定量PCR 反應產(chǎn)物都會不斷增多,熒光信號強度也會不斷增強,每經(jīng)過一個循環(huán)就會收集到一個熒光信號強度,從中可以根據(jù)熒光強度的變化觀察產(chǎn)物量的變化狀況,具有成本低、靈敏度高、特異度高、檢測速度快、檢測設備重量輕等特點,相較于病毒分離培養(yǎng)法不僅更能有效降低假陰性和假陽性的發(fā)生,同時在靈敏度、特異度以及準確性上表現(xiàn)更佳。本次研究結果顯示,實時熒光定量PCR 法陽性檢出率37.20%高于病毒分離培養(yǎng)法的23.60%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。實時熒光定量PCR 法的靈敏度62.14%、特異度94.55%及準確率76.40%均高于病毒分離培養(yǎng)法的31.43%、86.36%、55.60%,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。上述結果與王寧紅等［9］的研究結果較為一致。但需要注意,在開展實時熒光定量PCR 法檢測需要在條件較高的實驗室中實施,實驗室要求配備特殊儀器,需要專業(yè)操作人員操作,因此想全方面開展該項技術還需經(jīng)過長期發(fā)展［10］。

綜上所述,相較于病毒分離培養(yǎng)法,通過實時熒光定量PCR 法檢測流感病毒能更快更準確檢測樣本,具有較高的應用價值。