王鄭通 楊華巍

(中法歐亞森林入侵生物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué))，北京，100083) (江蘇省太倉(cāng)海關(guān)口岸生物安全防控實(shí)驗(yàn)室)

李碧鷹 任利利 石娟

(中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院) (中法歐亞森林入侵生物聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室(北京林業(yè)大學(xué)))

隨著國(guó)際經(jīng)濟(jì)一體化進(jìn)程的加快，林業(yè)生物入侵形勢(shì)愈發(fā)嚴(yán)峻。林業(yè)入侵物種對(duì)森林資源、物種多樣性、生態(tài)環(huán)境以及經(jīng)濟(jì)安全造成了嚴(yán)重?fù)p害，防控入侵生物已成為全球的重大課題之一。

松樹(shù)蜂(Sirexnoctilio)隸屬于膜翅目(Hymenoptera)樹(shù)蜂科(Siricidae)樹(shù)蜂屬(Sirex)，原產(chǎn)于歐亞大陸和北非，是林業(yè)上十分重要的害蟲(chóng)，也是國(guó)際重大檢疫性害蟲(chóng)，先后入侵大洋洲、南北美洲和非洲的諸多國(guó)家，主要危害松屬(Pinus)、冷杉屬(Abies)等針葉樹(shù)種，對(duì)當(dāng)?shù)卦斐芍卮蟮纳鷳B(tài)、經(jīng)濟(jì)損失[1-3]。松樹(shù)蜂雌性成蟲(chóng)體內(nèi)專(zhuān)門(mén)制造昆蟲(chóng)毒素的腺體被稱(chēng)為毒素腺，毒素腺分泌的毒素儲(chǔ)存在一個(gè)被稱(chēng)為毒素囊的器官內(nèi)，在松樹(shù)蜂產(chǎn)卵時(shí)與卵一起通過(guò)產(chǎn)卵器注入寄主松樹(shù)中[4]。毒素可降低松樹(shù)的抗性，為松樹(shù)蜂卵的發(fā)育提供條件，另外毒素也能促進(jìn)松樹(shù)蜂體內(nèi)攜帶的一種共生真菌的生長(zhǎng)[5]。研究表明，膜翅目昆蟲(chóng)的毒素是一種含有多種小分子質(zhì)量物質(zhì)和生物活性多肽的極其復(fù)雜的混合物，通過(guò)活性測(cè)定、基因序列比對(duì)分析及蛋白質(zhì)組等方法，數(shù)余種酶類(lèi)和毒素蛋白已被成功鑒定[6]。早期的研究學(xué)者指出松樹(shù)蜂毒素是一種由黏多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的呈酸性的混合物，含有多種酶、活性多肽和其他小分子質(zhì)量物質(zhì)[7]，但沒(méi)有對(duì)其成分做進(jìn)一步分析。以往的研究對(duì)象主要集中在跟人類(lèi)健康密切相關(guān)且有重大經(jīng)濟(jì)價(jià)值的種屬，如蜜蜂科(Apidae)和胡蜂科(Vespidae)上，而對(duì)植物性寄生的樹(shù)蜂毒素研究較少。

自2013年松樹(shù)蜂入侵我國(guó)以來(lái)，有關(guān)其毒素腺的生理結(jié)構(gòu)和毒素溶液有效成分的分析尚未見(jiàn)報(bào)道。鑒于此，筆者通過(guò)對(duì)松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)腹部的解剖與觀察，找到毒素囊和毒素腺的位置并分離提純獲得毒素溶液，同時(shí)，對(duì)松樹(shù)蜂毒素腺的結(jié)構(gòu)及其功能進(jìn)行了分析。最后，利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀得出GC-MS譜圖，分析得到毒液各有效成分的種類(lèi)，以期為明確松樹(shù)蜂毒素的作用原理及了解松樹(shù)蜂的致病機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)的解剖

試驗(yàn)所用蟲(chóng)體均來(lái)源于前期在各蟲(chóng)源地(黑龍江省杜蒙縣、黑龍江省鶴崗市、內(nèi)蒙古通遼市)采集的樟子松受害木段，待雌性成蟲(chóng)羽化后，放置冰箱中4 ℃保存待測(cè)，所有活蟲(chóng)試驗(yàn)均在北京林業(yè)大學(xué)植物檢疫實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。

將待測(cè)松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)取出后，用沾有體積分?jǐn)?shù)96%酒精的小毛刷輕輕擦拭蟲(chóng)體進(jìn)行消毒，并對(duì)解剖鏡臺(tái)面和解剖過(guò)程中使用的手術(shù)剪和昆蟲(chóng)針等實(shí)驗(yàn)用具進(jìn)行消毒。用昆蟲(chóng)針將雌蟲(chóng)固定在蠟盤(pán)內(nèi)，蟲(chóng)體背面朝上，放置在解剖鏡(Lecia M205C,Germany)臺(tái)面上，放大15～20倍。將手術(shù)剪的尖端輕輕插入蟲(chóng)體第8和第9腹板的結(jié)合處，剪斷第8腹板，并順著向上依次剪斷第7至第2腹板；用昆蟲(chóng)針將剪斷的腹板向兩側(cè)挑開(kāi)并固定在蠟盤(pán)上；將背板下方的脂肪、肌肉以及結(jié)締組織用昆蟲(chóng)針剔除干凈；最后，將1對(duì)卵巢分開(kāi)并撥向兩側(cè)，觀察雌成蟲(chóng)內(nèi)部的組織和器官。

1.2 松樹(shù)蜂毒素成分分析

1.2.1 毒素溶液的制備

在完成了對(duì)松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)腹部的解剖和貯菌囊的分離之后，用昆蟲(chóng)針將毒素腺和毒素囊一一挑出，隨后立即裝入1.5 mL的滅菌離心管并在-80 ℃保存，以備后用。毒素溶液的制備參考Bordeaux的方法[8]，將收集到的10頭雌蟲(chóng)的毒素腺體和毒素囊集中在一起，稱(chēng)質(zhì)量，加去離子水，用勻漿器(組織研磨器)研磨至懸濁液狀態(tài)，稀釋至20 g·L-1，17 000g離心8 min，取上清液，分裝至1.5 mL滅菌離心管，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 樣品預(yù)處理

以吳晨等[9]的方法對(duì)毒素溶液樣品分別進(jìn)行預(yù)處理。蛋白樣品使用氨水萃取，萃取后蛋白質(zhì)完全溶解于氨水，加入蛋白酶水解或5～10倍的體積分?jǐn)?shù)20% HCl煮沸回流16～20 h，或加壓于120 ℃水解12 h，將蛋白質(zhì)水解成氨基酸。利用N-甲基-N-特丁基二甲硅烷基三氟乙酰胺(MTBSTFA)或N,O-雙(三甲基硅烷基)三氟乙酰胺(BSTFA)對(duì)水解產(chǎn)物進(jìn)行硅烷化衍生，以降低水解產(chǎn)物的極性和氣化溫度，增加其化學(xué)穩(wěn)定性。脂類(lèi)樣品使用乙醚、丙酮等有機(jī)溶劑萃取，萃取后使用KOH的甲醇溶液進(jìn)行皂化甲酯化處理，水解產(chǎn)物經(jīng)萃取，酸化等處理，使用MTBSTFA、BSTFA等試劑衍生。多糖類(lèi)樣品使用酸性水解試劑(三氟乙酸(TFA))水解，水解產(chǎn)物經(jīng)離心沉淀過(guò)濾后，采用三甲基硅烷化和乙?；苌?。

1.2.3 分析條件

采用賽默飛世爾TRACE ISQ氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司)；HP-5色譜柱(30.00 m×0.25 mm，膜厚0.25 μm)；進(jìn)樣口溫度230 ℃，分流比1∶1，分流流量1 mL·min-1，F(xiàn)ID檢測(cè)器溫度290 ℃；升溫程序：初溫50 ℃，保持0 min，然后10 ℃·min-1，到280 ℃，保持7 min；空氣壓力52 kPa，載氣(高純氮?dú)?；總流速5 mL·min-1，吹掃流速3 mL·min-1；進(jìn)樣量1 mL[10-11]。

2 結(jié)果與分析

2.1 松樹(shù)蜂毒腺的解剖結(jié)構(gòu)

解剖結(jié)果顯示了松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)內(nèi)部生殖系統(tǒng)的組織構(gòu)造和結(jié)構(gòu)特點(diǎn)以及貯菌囊(圖1a，松樹(shù)蜂雌性成蟲(chóng)體內(nèi)貯藏共生真菌的囊狀器官)、腹神經(jīng)節(jié)(圖1b)、毒素腺(圖1c)和毒素囊(圖1d)等重要組織和器官的分布位置。進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)：毒素腺位于產(chǎn)卵器(圖1e)基部，為體積較小的腺體組織。毒素囊也位于產(chǎn)卵器基部附近的位置，與毒素腺相鄰。與其他組織和器官相比，毒素囊占據(jù)了雌蟲(chóng)腹部相當(dāng)大的空間，呈淡黃透明色，類(lèi)似米粒大小的球狀晶體，肉眼可見(jiàn)，毒素囊通過(guò)管狀組織和松樹(shù)蜂中輸卵管相連成為雌蟲(chóng)生殖系統(tǒng)的一部分。值得注意的是松樹(shù)蜂體內(nèi)的管狀組織將松樹(shù)蜂的貯菌囊、毒素囊和生殖系統(tǒng)緊密地聯(lián)系在一起，形成了一個(gè)類(lèi)似“三通管”的結(jié)構(gòu)，貯菌囊、毒素囊和卵巢(圖1f)位于“三通管”的3個(gè)分支方向，3個(gè)分支最終匯集到中輸卵管。這種組織結(jié)構(gòu)方式保證了松樹(shù)蜂雌蟲(chóng)在產(chǎn)卵時(shí)能夠?qū)⒙殉仓械穆?、貯菌囊貯藏的共生菌菌絲片段(分節(jié)孢子)和毒素囊中的毒素一起注入寄主體內(nèi)。

a.貯菌囊；b.腹神經(jīng)節(jié)；c.毒素腺；d.毒素囊；e.產(chǎn)卵器；f.卵巢。(參照文獻(xiàn)[12])。

2.2 松樹(shù)蜂毒素成分

通過(guò)裂解氣相色譜質(zhì)譜試驗(yàn)，得到松樹(shù)蜂毒素樣品裂解氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖，其結(jié)果見(jiàn)圖2。

通過(guò)氣相色譜質(zhì)譜試驗(yàn)，得到松樹(shù)蜂毒素樣品的氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖，其結(jié)果見(jiàn)表1。

圖2 松樹(shù)蜂毒素樣品裂解氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀譜圖

由圖2、表1可見(jiàn)，松樹(shù)蜂毒素中共檢測(cè)出了42種物質(zhì)，其中，離子豐度相對(duì)比較高的6種物質(zhì)的保留時(shí)間分別為1.183、1.974、2.851、16.246、18.058、20.274 min，由氣象質(zhì)譜色譜試驗(yàn)得到每個(gè)保留時(shí)間對(duì)應(yīng)峰的面積、基線高度、絕對(duì)高度、峰寬等數(shù)據(jù)，再查詢NIST標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)，通過(guò)譜峰數(shù)據(jù)，檢索相似譜圖，得到豐度較高的每個(gè)峰對(duì)應(yīng)的化合物的匹配項(xiàng)名稱(chēng)、質(zhì)量、分子質(zhì)量、CAS號(hào)等相關(guān)信息。

經(jīng)整理和歸類(lèi)得知，松樹(shù)蜂毒素主要由各種酸、酯、醇、烯、酮以及它們的同分異構(gòu)體及順?lè)串悩?gòu)體組成，可歸納成生物堿、糖及糖苷、脂肪酸和蛋白質(zhì)四大類(lèi)，主要組成元素有碳、氫、氧、氮、硫、氟等，物質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為80～500。脂肪酸包括棕櫚酸、丁二酸、十四碳烯酸、十六碳烯酸、十八烷酸、十八碳烯酸、乙酸、油酸、辛酸等，大部分為碳原子較多的中鏈和長(zhǎng)鏈脂肪酸，且多為含雙鍵的不飽和脂肪酸，脂肪酸物質(zhì)在毒素成分中占57.9%，含量最多，為組成松樹(shù)蜂毒素的主要物質(zhì)。糖及糖苷類(lèi)物質(zhì)在松樹(shù)蜂毒素成分中占28.7%。松樹(shù)蜂毒素中的糖類(lèi)物質(zhì)和脂肪酸類(lèi)物質(zhì)作為其主要的組成物質(zhì)，占毒素成分的比例較大。

表1 松樹(shù)峰毒素樣品氣相質(zhì)譜色譜峰主要對(duì)應(yīng)化合物

續(xù)(表1)

生物堿和蛋白質(zhì)類(lèi)物質(zhì)雖然在毒素中含量較少，分別占5.1%和8.3%，但其作為具有生物活性的物質(zhì)存在于毒素中，與松樹(shù)蜂毒素對(duì)寄主樹(shù)木的致病性有很大的關(guān)系。生物堿主要包含一些氮雜縮醛類(lèi)、烯胺、亞胺及一些氮氧化物，蛋白質(zhì)主要以多肽和酶的形式存在，包括磷脂酶、蛋白酶、肽酶、酯酶等水解酶，催化底物結(jié)構(gòu)的異構(gòu)化反應(yīng)的順?lè)串悩?gòu)酶，以及一些常見(jiàn)的氧化還原酶。

3 結(jié)論與討論

與其他組織和器官相比，松樹(shù)蜂的毒素囊占據(jù)了雌蟲(chóng)腹部相當(dāng)大的空間，以便于松樹(shù)蜂貯存盡量多的毒素，其貯菌囊、毒素囊和卵巢形成的“三通管”的結(jié)構(gòu)充分體現(xiàn)了其結(jié)構(gòu)與功能的高度統(tǒng)一性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，寄生性膜翅目昆蟲(chóng)的泌毒器官起源于外胚層，由生殖系統(tǒng)的附腺演化而來(lái)，其毒液由成熟雌蜂的毒腺或酸腺所分泌，并貯于毒囊中[13]。因此，松樹(shù)蜂雌成蟲(chóng)毒素腺與輸卵管相連的結(jié)構(gòu)可以說(shuō)明松樹(shù)蜂的毒素腺和毒素囊符合進(jìn)化演變的規(guī)律，和蜜蜂等蜂毒素在體內(nèi)的分泌和貯藏器官發(fā)育來(lái)源一致。

研究表明，中華蜜蜂(Apisceranacerana)分泌的報(bào)警信息素中主要成分是乙酸異戊酯和乙酸芐酯，還包括乙酸正丁酯、乙酸正已酯、乙酸正辛酯、乙酸正癸酯、乙酸苯酯、乙酸二十酯、辛酸等20余種成份，同時(shí)，有關(guān)寄生性膜翅目昆蟲(chóng)毒素的研究中指出已知膜翅目昆蟲(chóng)毒素中含有烴類(lèi)、醇類(lèi)、醛類(lèi)、酮類(lèi)、羧酸類(lèi)、酯類(lèi)、內(nèi)酯類(lèi)、酶類(lèi)等多種化合物[13-14]。因此，松樹(shù)蜂毒素中含脂肪酸這一現(xiàn)象基本符合膜翅目昆蟲(chóng)毒素的演化規(guī)律。

漆酶是多酚氧化酶中最重要的一種酶，本課題組前期高成龍通過(guò)對(duì)松樹(shù)蜂毒腺進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組分析，篩選出11條漆酶基因[15]，同時(shí)，李大鵬等[5]通過(guò)以ABTS為底物測(cè)定的方法檢測(cè)到了松樹(shù)蜂毒素內(nèi)漆酶的存在[5]，由此可以得出松樹(shù)蜂毒素成分中包含漆酶這一結(jié)論。李大鵬等[5]在研究中證實(shí)了松樹(shù)蜂毒素能夠顯著地促進(jìn)共生真菌A.areolatum漆酶的分泌并提高其漆酶活力，這與松樹(shù)蜂毒素中包含漆酶這一結(jié)論相符，并進(jìn)一步證明了松樹(shù)蜂的共生菌和毒素在危害寄主樹(shù)木時(shí)存在的協(xié)同關(guān)系。

李玉梅等在對(duì)蜜蜂毒素的研究中指出，蜜蜂毒中含有蜂毒素、蜂毒神經(jīng)肽、磷脂酶、透明質(zhì)酸酶、組織胺、碳水化合物等多種復(fù)雜成分，且具有很高的生物活性[16]，與本研究中對(duì)毒素蛋白質(zhì)的研究結(jié)果基本一致。由于酶的生物活性極高，可猜測(cè)在松樹(shù)蜂毒素中蛋白質(zhì)可能是對(duì)寄主樹(shù)木造成傷害的主要活性物質(zhì)。早期的研究學(xué)者指出松樹(shù)蜂毒素是一種由黏多糖和蛋白質(zhì)等物質(zhì)組成的呈酸性的混合物，含有多種酶、活性多肽和其他小分子量物質(zhì)[17]，有研究者利用化學(xué)成分分離技術(shù)結(jié)合生理試驗(yàn)，證實(shí)毒素混合物中的一種具有生物活性的多肽是引起寄主受害癥狀出現(xiàn)的關(guān)鍵因子，接種該活性多肽的供試枝條出現(xiàn)了萎蔫、失綠變黃等典型癥狀[8]，也說(shuō)明松樹(shù)蜂毒素中主要的活性物質(zhì)為蛋白質(zhì)。

生物堿是一類(lèi)含氮的堿性有機(jī)化合物，有顯著的生物活性，一般以鹽類(lèi)、苷類(lèi)、酰胺類(lèi)、N-氧化物等形式存在于自然界植物或動(dòng)物中，研究發(fā)現(xiàn)某種在植物中廣泛存在的吡咯里西啶類(lèi)生物堿，以及山豆根(Euchrestajaponica)中的苦參堿和氧化苦參堿等多種生物堿對(duì)生物機(jī)體均具有明確的毒性作用[18-20]。但目前為止對(duì)昆蟲(chóng)尤其是膜翅目昆蟲(chóng)體內(nèi)含有的生物堿的文獻(xiàn)和相關(guān)報(bào)導(dǎo)還較少，且松樹(shù)蜂毒素中的生物堿含量相對(duì)來(lái)說(shuō)最少，對(duì)于它是否是導(dǎo)致寄主松樹(shù)出現(xiàn)針葉枯黃、萎蔫等現(xiàn)象的原因，以及它的致病機(jī)制還需要進(jìn)一步的深入研究。

劉嶺等[21]選用單一流動(dòng)相，采用不同規(guī)格的Sephadex凝膠柱分3步對(duì)蜂毒素進(jìn)行分離提純，洗脫速度適中，純化過(guò)程較省時(shí)，經(jīng)高效液相色譜法進(jìn)行含量測(cè)定，證實(shí)分離所得的蜂毒素具較高的純度。徐彭等[22]利用蜂毒肽(蜂毒素)的油水兩親性和其分子結(jié)構(gòu)中不含巰基及雙巰鍵，對(duì)蜂毒素進(jìn)行溶酶萃取和化學(xué)裂解處理，同時(shí)利用其在濃度高時(shí)常以四聚體形式存在的特性，采用在含4 mol·L-1脲(使蜂毒肽的四聚體解散)與不含4 mol·L-1脲的2種不同情況的緩沖液系統(tǒng)中，進(jìn)行凝膠過(guò)濾柱層析，所獲產(chǎn)品的純度和得率均較高。本研究中，松樹(shù)蜂毒素由于直接從解剖的毒素囊中獲得，雜質(zhì)較少，純度較高，該方法可為松樹(shù)蜂毒素中蛋白質(zhì)中多肽和氨基酸等活性物質(zhì)的分離提純提供思路，也可從松樹(shù)蜂基因表達(dá)量和毒素腺轉(zhuǎn)錄組分析等分子生物學(xué)方面進(jìn)一步探討多肽的作用機(jī)制，為接下來(lái)對(duì)毒素的研究打下基礎(chǔ)。相比于其他成分檢測(cè)方法，氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法具有進(jìn)樣量少、靈敏度高、分離性好、分析速度快、檢出限低等優(yōu)點(diǎn)，但操作比較復(fù)雜。為提高試驗(yàn)過(guò)程的操作性和安全性，可以從樣品的預(yù)處理、干擾雜質(zhì)的排除、色譜柱類(lèi)型的選擇以及升溫程序的優(yōu)化等方面對(duì)檢測(cè)方法加以改善，以助于試驗(yàn)更順利的進(jìn)行。