孫家君，李乾崗，魏 婷，王洪杰，張光明，曹宏斌

（1.中國科學(xué)院過程工程研究所，北京 100190 ；2.中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3.中國人民大學(xué)環(huán)境學(xué)院，北京 100872；4.河北大學(xué)生態(tài)與環(huán)境治理研究所，河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071002；5.中國雄安集團(tuán)生態(tài)建設(shè)投資有限公司，河北 雄安 071000）

0 引言

白洋淀是雄安新區(qū)重要的生態(tài)水域，對華北地區(qū)生態(tài)環(huán)境保護(hù)及經(jīng)濟(jì)社會發(fā)展具有重要意義，但長期以來污染問題嚴(yán)重，制約了雄安新區(qū)發(fā)展。修復(fù)白洋淀濕地，恢復(fù)白洋淀生態(tài)健康勢在必行。底棲生物修復(fù)是濕地修復(fù)的重要組成部分，有助于完善濕地生態(tài)系統(tǒng)服務(wù)功能[1]。生物擾動是指底棲生物通過自身活動產(chǎn)生攪動作用, 促進(jìn)沉積物與水體之間物質(zhì)交換[2]，生物擾動會影響微生物和植物的生長，對濕地生物地球化學(xué)循環(huán)十分重要[3]。但生物擾動還會增加內(nèi)源污染釋放，對水質(zhì)影響不容忽視，并且生物量密度是影響這一過程的關(guān)鍵因素[4]。 因此，充分探究底棲生物擾動作用對濕地水質(zhì)、微生物以及植物的作用，對濕地生物修復(fù)及濕地物質(zhì)循環(huán)研究具有重要意義。

三角帆蚌(Hyriopsis cumingii)是白洋淀具有代表性的底棲生物，能夠有效抑制藍(lán)藻等有害藻類生長，廣泛運(yùn)用于濕地修復(fù)當(dāng)中[5]。 但現(xiàn)階段的研究都過分關(guān)注于三角帆蚌的控藻效果，忽視其生物擾動作用對濕地水質(zhì)、植物和微生物產(chǎn)生的影響[6]。 本研究以三角帆蚌為試驗(yàn)對象，以白洋淀水和泥為試驗(yàn)材料，通過室內(nèi)模擬試驗(yàn)，研究三角帆蚌的生物擾動作用對水體水質(zhì)COD，N，P 及沉水植物色素積累的影響，并結(jié)合16S rRNA 高通量測序技術(shù)，研究水中微生物群落結(jié)構(gòu)的變化，以期為白洋淀濕地修復(fù)和濕地生態(tài)系統(tǒng)重建提供依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)材料與裝置

試驗(yàn)用三角帆蚌來自白洋淀某淡水蚌養(yǎng)殖場，選取活力較好的蚌體進(jìn)行試驗(yàn)，蚌質(zhì)量為252.2 ±16.3 g。 試驗(yàn)前將其清洗并凈水馴養(yǎng)1 W。

試驗(yàn)優(yōu)選金魚藻、輪葉黑藻和穗花狐尾藻3 種沉水植物。 試驗(yàn)用水、泥及沉水植物均取自白洋淀，試驗(yàn)前凈水預(yù)培養(yǎng)1 W。 根據(jù)試驗(yàn)需要通過添加葡萄糖，KNO3和KH2PO4調(diào)節(jié)COD，N，P。

單個(gè)裝置容積100 L，上內(nèi)徑49 cm，下內(nèi)徑41 cm，高63 cm；裝置內(nèi)底泥采用白洋淀底泥，厚10 cm；水深40 cm，采用蠕動泵調(diào)節(jié)進(jìn)出水，保持水力停留時(shí)間為5 d；水溫保持在25 ℃左右；水體pH 值為7 ～8；采用恒功率曝氣，依據(jù)往年同期監(jiān)測數(shù)據(jù)保持水體DO 質(zhì)量濃度在4 ～6 mg/L。

1.2 試驗(yàn)方法

三角帆蚌的生物量分為低(4 g/L)、中(12 g/L)、高(20 g/L)3 個(gè)密度，每2 d 固定時(shí)間出水口取樣檢測水質(zhì)。設(shè)置無蚌對照組和平行組，共計(jì)運(yùn)行42 d。進(jìn)水變化情況見表1。 試驗(yàn)期分為高污染進(jìn)水和低污染進(jìn)水2 個(gè)階段，高污染進(jìn)水階段人為添加了COD，N，P；低污染進(jìn)水階段采用淀區(qū)來水。 水質(zhì)調(diào)節(jié)均源于前期監(jiān)測工作。

表1 進(jìn)水變化情況 mg·L-1

試驗(yàn)水質(zhì)每隔2 d 進(jìn)行1 次檢測，包括COD，TN，NH3-N，NO3--N，NO2--N 和TP，檢測試驗(yàn)期20 d和42 d 時(shí)的各處理組植物色素(葉綠素a，b 以及類胡蘿卜素)含量，試驗(yàn)結(jié)束時(shí)對水體微生物群落進(jìn)行分析。

1.3 檢測和分析方法

1.3.1 水質(zhì)指標(biāo)及植物色素檢測方法

TN 采用HJ 636―2012 堿性過硫酸鉀紫外分光光度法；NH3-N 采用HJ 535―2009 納氏試劑分光光度法；TP 采用GB 11893―89 鉬酸銨分光光度法；NO3--N 采用HJ/T346―2007 硝酸鹽氮的測定紫外分光光度法；NO2--N 采用GB/T 7493―1987 分光光度法。 植物色素采用95%乙醇提取法。 底泥中全氮采用HJ 717―2014《土壤質(zhì)量全氮的測定凱氏法》；底泥中全磷采用HJ 632―2011 《堿熔-鉬銻抗分光光度法》。

1.3.2 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

利用注射器采集距液面10，20，30 cm 處的水樣共150 mL，過0.22 μm 濾膜后，將樣品- 20 ℃保存。對預(yù)處理樣品進(jìn)行微生物群落高通量測序分析。 基于二代高通量測序，測定16SrRNAV4 區(qū)PCR 產(chǎn)物，對各樣品中微生群落結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析 （引物為338F：5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3',806R：5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3'）。 DNA 的提取、PCR、建庫和測序交由北京美吉桑格生物醫(yī)藥科技有限公司完成，測序使用平臺為IlluminaMiseqplatform（Illumina，USA）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用SPSS26.0 進(jìn)行相關(guān)性分析，使用Origin9.0進(jìn)行作圖。 采用P 值來判斷數(shù)據(jù)的顯著性，當(dāng)P ＜0.05 認(rèn)為所得數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計(jì)學(xué)的顯著差異性。

2 結(jié)果與討論

2.1 水體COD 變化

試驗(yàn)期間COD 濃度變化情況見圖1。 白洋淀整體COD 濃度偏低，各處理組平均削減率在40% ～50%。出水COD 質(zhì)量濃度為3.54 ～36.12 mg/L。由于三角帆蚌生物擾動，中、高密度組COD 質(zhì)量濃度均值比對照組有一定的提升（＜4.5 mg/L），各組別間沒有顯著差異（P ＞0.05）。 劉昌偉等[7]采用人工濕地進(jìn)行生活污水深度處理，COD 出水質(zhì)量濃度在21.98～25.08 mg/L，削減23.2%。 本研究中模擬濕地對水體COD 濃度削減效果較好，且三角帆蚌對COD 濃度削減并無顯著影響。

圖1 各處理組COD 質(zhì)量濃度變化情況

2.2 水體不同形態(tài)氮濃度的變化

試驗(yàn)水體TN，NH3-N，NO3--N 以及NO2--N 質(zhì)量濃度變化情況見圖2。由圖2（a）可以看出，試驗(yàn)階段各處理組TN 平均質(zhì)量濃度分別為5.60，5.52，5.88 和6.02 mg/L。 可見中、高密度組的三角帆蚌的生物擾動將水體TN 質(zhì)量濃度提高了5.4% ~ 7.5%。對照組與低密度組變化沒有差異（P > 0.05）。白洋淀水體長期的富營養(yǎng)化問題導(dǎo)致濕地沉積物中蘊(yùn)含了大量的N，P 污染物，造成了較大的內(nèi)源污染風(fēng)險(xiǎn)[8]。上覆水理化性質(zhì)、沉積物性質(zhì)以及擾動強(qiáng)度和時(shí)間是影響沉積物內(nèi)源釋放的主要因素，在白洋淀等緩流水體中，生物擾動作用就成為促進(jìn)沉積物內(nèi)源釋放的主要?jiǎng)恿9]。三角帆蚌的生物擾動促進(jìn)沉積物中氮的釋放，是水體TN 質(zhì)量濃度升高的主要原因，并且本研究發(fā)現(xiàn)三角帆蚌的生物量密度是影響沉積物中氮釋放速率的重要因素。CHENG H M 等[10]研究發(fā)現(xiàn)，Chironomid 幼蟲和Limnodrilushoffmeisteri活動增加了沉積物的孔隙度，提高了間歇水和上覆水中Cr 的濃度，將Cr 的釋放通量提高約90 μg/（m-2·d）。

圖2 水中各形態(tài)氮質(zhì)量濃度變化情況

由圖2（b）可以看出，試驗(yàn)階段各處理組出水NH3-N 平均質(zhì)量濃度分別為0.25，0.33，0.43 和0.45 mg/L，可見三角帆蚌提高了水體中NH3-N 濃度，但各組別之間差異不大(P ＞0.05)。 隨時(shí)間延長，貝類擾動產(chǎn)生的NH3-N 釋放量會逐漸降低為0，這是組間差異較小的原因之一[11]。 在本研究中，水體處于富氧狀態(tài)，促使水體氨氧化過程，抑制反硝化，使NH3-N 濃度下降，TN 濃度上升。 試驗(yàn)裝置運(yùn)行全階段，NH3-N出水濃度穩(wěn)定達(dá)到地表水IV 類(GB 3838―2002)，表明模擬濕地對NH3-N 具有較好的處理效果。

由圖2（c）可以看出，試驗(yàn)期NO3--N 含量與TN變化具有一致性，表明水體NO3--N 濃度變化是TN濃度變化的主要原因。 由圖2（d）可以看出，三角帆蚌密度越高，NO2--N 濃度越高(P ＜0.05)，試驗(yàn)期內(nèi)低、中、高3 個(gè)組的NO2--N 平均質(zhì)量濃度較對照組分別高出0.09，0.25 和0.34 mg/L。三角帆蚌會為反硝化微生物活動提供更多空間。 底棲生物通過自身呼吸耗氧創(chuàng)造出更多缺氧環(huán)境，很多動物體內(nèi)腸道等環(huán)境也能成為缺氧微生物反應(yīng)場所，從而提高濕地中反硝化細(xì)菌的活性和數(shù)量，并提高濕地的脫氮效率[12]。 KANG Y 等[13]發(fā)現(xiàn)，蚯蚓活動將沉積物與水體之間的氧通量降低了約1.25 mg/L，促使沉積物NO3--N 還原率提高了28.4%，因此，三角帆蚌有助于NO2--N 積累。 但在本研究中，三角帆蚌造成的沉積物中氮釋放作用更加明顯，為避免生物擾動造成的水質(zhì)惡化，低密度的三角帆蚌可能更適合白洋淀底棲修復(fù)。

2.3 水體TP 變化

各處理組TP 質(zhì)量濃度變化情況見圖3。

圖3 各處理組TP 質(zhì)量濃度變化情況

由圖3 可以看出，試驗(yàn)期對照組與低密度組基本一致（P ＞0.05），中、高密度組TP 顯著高于這2組（P ＜0.05）。 中、高密度組平均質(zhì)量濃度分別為0.337 和0.349 mg/L，高出對照組120.8%和127.8%，顯然三角帆蚌對磷質(zhì)量濃度影響更明顯。JI MD等[14]研究發(fā)現(xiàn)，濕地水體中的磷有36.2% ~ 49.7%依靠沉積物的吸附作用得以去除，遠(yuǎn)大于植物和微生物的作用。 因此生物擾動作用對磷釋放效果影響更為顯著。 NIZZOLI D 等[15]發(fā)現(xiàn)生物擾動促進(jìn)磷的釋放通量約為氮的3 倍，與本研究結(jié)果類似。三角帆蚌的擾動降低了沉積物的穩(wěn)定性，抑制了沉積物對磷的吸附過程，同時(shí)極大促進(jìn)了沉積物中磷的釋放，因此三角帆蚌對水體磷濃度影響更大。 高污染進(jìn)水段能促使三角帆蚌代謝增強(qiáng)[15]，導(dǎo)致生物擾動增強(qiáng)，提高了中、高密度組上覆水中TP 質(zhì)量濃度，可見低密度對水質(zhì)變化并不敏感，更有利于維護(hù)水質(zhì)。

2.4 水體微生物群落分析

各處理組水體中微生物群落豐度在門水平上的占比（比例≥1%）見圖4。 本研究共檢測出7 個(gè)微生物類群，分別為變形菌門（Proteobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放 線 菌 門（Actinobacteria）、疣 微菌 門 （Verrucomicrobia）、藍(lán) 細(xì) 菌（Cyanobacteria）、Patescibacteria、螺旋體門（Spirochaetes）。各組中的優(yōu)勢菌種均為變形菌門、擬桿菌門和放線菌門微生物。中密度組變形菌門相對豐度最高（74.01%），較對照增加了33.89%，擬桿菌門和放線菌門分別下降了15.46%和13.27%。 表明一定密度范圍，三角帆蚌生物會增加水體中變形菌門豐度。

圖4 各處理組水體中微生物群落分析.

變形菌門是自然水體中最常見的微生物類群，分布十分廣泛，是大部分濕地中的優(yōu)勢菌門[16]。 變形菌門包含了濕地中絕大多數(shù)的脫氮除磷及有機(jī)物降解微生物，例如亞硝化球菌屬(Nitrosococcus)、硝化螺菌屬(Nitrospira)等微生物是重要的硝化細(xì)菌，假單胞菌屬微生物又是一類溶磷能力較強(qiáng)的細(xì)菌，能促進(jìn)濕地中的有機(jī)磷向可溶性磷轉(zhuǎn)化[17]。 擬桿菌門是濕地中一類重要的有機(jī)物降解微生物，對水體中的氨化合物及蛋白質(zhì)的降解效果更好。 放線菌多為好氧細(xì)菌，能促進(jìn)沉積物中的有機(jī)物分解[18]。 在本研究中，三角帆蚌活動提高了濕地中變形菌門的豐度，增加了濕地硝化細(xì)菌和磷細(xì)菌的數(shù)量。 加之水體始終處于富氧狀態(tài)，三角帆蚌又促使水體中N，P 濃度升高，有助于植物對磷的吸收和利用，促進(jìn)植物生長。三角帆蚌增加了功能微生物豐度，并為微生物反應(yīng)提供了更優(yōu)環(huán)境，有助于強(qiáng)化濕地微生物的作用。

2.5 沉水植物色素含量變化

綠色植物的植物色素是其有機(jī)物生產(chǎn)能力的代表，其色素濃度的高低直接代表了植物生長水平的高低，色素含量越高，其生產(chǎn)能力則越強(qiáng)[19]。 本研究探究了金魚藻、穗花狐尾藻以及輪葉黑藻在三角帆蚌的影響下植物色素含量變化。 其中，金魚藻無根，穗花狐尾藻有莖狀根，僅有輪葉黑藻具有完整的根部結(jié)構(gòu)，它們對水體中N，P 的吸收能力依次增強(qiáng)，因此可以依據(jù)色素積累判斷出水體N，P 含量變化與植物生長之間的相關(guān)性。

3 種沉水植物色素含量變化情況見圖5。 由圖5可以看出，三角帆蚌極大促進(jìn)了輪葉黑藻各類色素的積累，各實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)之間差異顯著(P ＜0.05)，表明中密度組的促進(jìn)作用更加明顯，第42 d 時(shí)，其葉綠素a，葉綠素b 和類胡蘿卜素質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高出對照組176.1%，190.9%和190.8%(P ＜0.05)。結(jié)合圖4 可知，各處理組輪葉黑藻色素含量與變形菌門豐度變化具有一致性，中密度組變形菌門豐度最高，其各種植物色素含量也最高，可見三角帆蚌引起的微生物與植物變化之間密切相關(guān)。 因此濕地功能微生物和營養(yǎng)含量增加，是有根植物色素積累的主要原因。同時(shí)本研究發(fā)現(xiàn)，三角帆蚌抑制了穗花狐尾藻與金魚藻的生長，可見低密度的三角帆蚌更有利于濕地植被系統(tǒng)的構(gòu)建。

圖5 3 種沉水植物色素含量變化情況

3 結(jié)論

（1）中、高密度的三角帆蚌會促進(jìn)沉積物中污染物釋放，將水體中的COD，TN，NH3-N 和TP 濃度分別提高13.7% ～20.6%，5.4% ～7.5%，73.7% ～81.5%和120.8% ～127.8%，而低密度組對水質(zhì)變化并無明顯影響(P ＞0.05)。

（2）低、中三角帆蚌促使水體中變形菌門豐度增加10.81%和33.89%，提高了水體的硝化細(xì)菌和磷細(xì)菌豐度，促進(jìn)NO3--N 和可溶性磷酸鹽的積累。 三角帆蚌提供的缺氧環(huán)境促進(jìn)了反硝化，提高了水體中NO2--N 濃度，且三角帆蚌密度越高NO2--N 濃度越高。

（3）低、中密度三角帆蚌生物擾動促進(jìn)了輪葉黑藻的光合色素積累。 微生物群落變化與有根植物色素積累密切相關(guān)。 三角帆蚌抑制金魚藻和穗花狐尾藻的生長。