周 淼 閆五玲 趙棟梁 劉元元 焦 莉▲

1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科，河南鄭州 450008；2.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，河南鄭州 450008；3.河南中醫(yī)藥大學(xué)針灸推拿學(xué)院，河南鄭州 450046

肺結(jié)節(jié)是胸部影像的一種表現(xiàn)，臨床檢出率較高，部分結(jié)節(jié)可為惡性，是肺癌的早期雛形。肺癌對(duì)人類(lèi)生命健康危害極大，是全球癌癥死亡的首位原因[1-2]，居我國(guó)惡性腫瘤死亡和發(fā)病的首位[3]，由于難以實(shí)現(xiàn)大規(guī)模肺癌早期篩查，多數(shù)患者在臨床確診時(shí)病程已至晚期，喪失了最佳治療機(jī)會(huì)[4]。因此，世界衛(wèi)生組織（WHO）提出早診、早治是控制肺癌等癌癥死亡率的有效手段[5]。就肺癌而言，肺結(jié)節(jié)的及時(shí)發(fā)現(xiàn)及性質(zhì)判斷至關(guān)重要，然而在臨床工作中并不容易實(shí)現(xiàn)。肺結(jié)節(jié)具有起病隱匿、生長(zhǎng)緩慢、缺少癥狀、病灶體積小或密度淡、早期影像特點(diǎn)不突出、生化檢查陰性、活檢不易定位等特點(diǎn)，均給臨床診斷帶來(lái)諸多困難及不確定性。目前常用的肺結(jié)節(jié)診斷手段包括：胸部CT、功能顯像、腫瘤標(biāo)志物等[6]，但也很難在較短時(shí)間內(nèi)明確結(jié)節(jié)性質(zhì)，往往需要對(duì)患者進(jìn)行定期隨訪及動(dòng)態(tài)觀察。隨訪時(shí)間可長(zhǎng)達(dá)5年，患者在隨訪及觀察過(guò)程中易產(chǎn)生恐慌情緒或者忽略心態(tài)，甚至隨訪中可出現(xiàn)結(jié)節(jié)突然增大、惡化等后果，故積極探索新的肺結(jié)節(jié)診斷評(píng)估方法勢(shì)在必行。近年來(lái)，隨著分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展，腫瘤生物標(biāo)志物的基因測(cè)試嶄露頭角，對(duì)腫瘤的診斷、治療和預(yù)后評(píng)估有較高靈敏度和特異性[7]，而不同基因組合的甲基化檢測(cè)也逐漸應(yīng)用到肺結(jié)節(jié)診斷、肺癌早期篩查當(dāng)中，具有一定的臨床價(jià)值[8]?，F(xiàn)采用矮小同源盒基因2（short stature homeobox 2，SHOX2）和Ras 相關(guān)區(qū)域家族1A（Ras association domain family 1 A，RASSF1A）基因組合甲基化檢測(cè)參與診斷肺結(jié)節(jié)一例，報(bào)道如下。

1 病例資料

患者栗某，男，57 歲，既往體健，吸煙指數(shù)為600，因“左側(cè)胸痛6 d”于2019年11月12日就診于河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院肺病科，查胸部CT 平掃顯示：左肺門(mén)區(qū)結(jié)節(jié)（圖1），考慮腫瘤性病變可能。增強(qiáng)胸部CT 顯示：結(jié)節(jié)不均勻強(qiáng)化（圖2），腫瘤性病變不排除。

血常規(guī)、C 反應(yīng)蛋白（CRP）、紅細(xì)胞沉降率、腫瘤標(biāo)志物等均正常。2019年11月14日行纖維支氣管鏡檢查，鏡下見(jiàn)左肺上葉尖后段管口輕度外壓性狹窄，管腔黏膜充血水腫，依據(jù)胸部CT 及鏡下表現(xiàn)于左肺上葉留取支氣管肺泡灌洗液，于左肺上葉尖后段外支行盲檢及刷檢，所得標(biāo)本分別送病原學(xué)、細(xì)胞學(xué)、組織學(xué)及SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)。

檢查結(jié)果顯示：左肺上葉灌洗液涂片未查到抗酸桿菌、真菌，培養(yǎng)48 h 無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng)。左肺上葉刷片細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)少量擁擠細(xì)胞團(tuán)，內(nèi)有異型細(xì)胞，不除外腫瘤細(xì)胞，由于細(xì)胞量少不足以診斷。左肺上葉尖后段外支盲檢病理結(jié)果為肺組織慢性炎，偶見(jiàn)極小灶肺泡上皮異型增生，請(qǐng)結(jié)合臨床。石蠟切片SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)均為陰性。

為進(jìn)一步明確診斷，患者轉(zhuǎn)院至河南省腫瘤醫(yī)院，于2019年12月4日在靜吸復(fù)合全麻下行胸腔鏡左肺上葉切除及系統(tǒng)淋巴結(jié)清掃術(shù)，術(shù)后病理顯示：（左肺上葉）神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，符合類(lèi)癌，未累及被膜，腫物大小約2.5 cm×2.5 cm×1 cm，未見(jiàn)肯定的脈管內(nèi)癌栓及神經(jīng)侵犯。

圖1 患者胸部CT 平掃結(jié)果

圖2 患者胸部增強(qiáng)CT 結(jié)果

2 討論

基因甲基化是一種共價(jià)化學(xué)修飾，雖不造成DNA序列變化，但可使DNA 穩(wěn)定性、蛋白質(zhì)與DNA 相互作用方式及染色質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化[9]?；蚣谆谒心[瘤中都有發(fā)生，已成為腫瘤診斷的可靠靶標(biāo)[10]，研究發(fā)現(xiàn)，在肺癌早期診斷中，SHOX2、RASSF1A 基因具有高度敏感性和特異性[11]，對(duì)收集到的肺組織、痰液、支氣管灌洗液、胸腔積液等進(jìn)行基因甲基化檢測(cè)，可發(fā)現(xiàn)早期肺癌。SHOX2 基因在多種實(shí)體腫瘤中表達(dá)異常，如肺癌，乳腺癌和腎癌[10，12-13]，而且它們能較好地對(duì)肺部良性疾病和惡性腫瘤進(jìn)行鑒別診斷[14-15]，甲基化的SHOX2 不僅可作為非小細(xì)胞肺癌早期檢測(cè)的生物指標(biāo)，還可作為其預(yù)后判斷的獨(dú)立預(yù)測(cè)指標(biāo)[16]。RASSF1A 基因是一種新型腫瘤抑制基因，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮重要作用，此基因表達(dá)失活主要與啟動(dòng)子區(qū)異常的高甲基化、雜合性缺失及染色體缺失有關(guān)，抑癌基因的過(guò)甲基化可為肺癌診斷提供幫助[17]。

本文病例采用SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)對(duì)肺結(jié)節(jié)進(jìn)行診斷，診斷結(jié)果與手術(shù)病理檢查結(jié)果不一致，為假陰性。分析原因可能如下：

2.1 標(biāo)本類(lèi)型選擇不到位

采用基因甲基化檢測(cè)的標(biāo)本來(lái)源存在多樣化的特點(diǎn)，如支氣管肺泡灌洗液、活（盲）檢組織、胸腔積液、痰液、血漿等，它們各具優(yōu)劣勢(shì)。以痰液標(biāo)本為例，長(zhǎng)期大量吸煙群體屬肺癌高發(fā)群體，并且痰液分泌量較多，無(wú)需特殊誘導(dǎo)即可獲得標(biāo)本，所以痰液標(biāo)本基因甲基化檢測(cè)比較適合長(zhǎng)期大量吸煙群體的肺癌初篩。但是痰液檢測(cè)同樣存在部分局限性，痰液主要來(lái)自于支氣管系統(tǒng)靠近中央的部位，痰液檢測(cè)結(jié)果難以準(zhǔn)確顯示肺外周部位的相關(guān)情況，因而對(duì)于外周部位肺癌的檢測(cè)能力非常有限[18]。分析本文1例患者，雖然胸部CT 提示結(jié)節(jié)位置靠近肺門(mén)，類(lèi)似中央型病變，但支氣管鏡下見(jiàn)左肺上葉尖后段管口輕度外壓性狹窄，提示病灶位于管腔以外，活檢鉗不能直接到達(dá)病灶部位及周?chē)ㄟ^(guò)鉗取組織的方法難以取得滿意標(biāo)本。若采用支氣管肺泡灌洗液作為標(biāo)本也許更為合適。支氣管肺泡灌洗液通過(guò)先沖刷再回收的方式，能收集較廣泛區(qū)域的標(biāo)本，此種方式不但適合于中央型病變，還可用于周?chē)筒∽兊脑\斷。本文1例患者若采用支氣管肺泡灌洗進(jìn)行標(biāo)本取樣，其檢測(cè)陽(yáng)性率可能會(huì)有所增加。

2.2 標(biāo)本量采集不充足

本文1例病例氣管鏡左肺上葉刷片細(xì)胞學(xué)發(fā)現(xiàn)少量擁擠細(xì)胞團(tuán)，內(nèi)有異型細(xì)胞，不排除腫瘤細(xì)胞，然而，由于細(xì)胞量較少，不足以診斷?；睿ぃz為有創(chuàng)操作，可能造成出血、氣胸等并發(fā)癥，盲檢風(fēng)險(xiǎn)更甚，而之后的刷檢也可能加重創(chuàng)面出血，因此，操作者在進(jìn)行活（盲）檢及刷檢操作時(shí)往往由于擔(dān)心患者出現(xiàn)并發(fā)癥而限制操作次數(shù)及深度，繼而導(dǎo)致標(biāo)本采集量不足。相比之下，支氣管肺泡灌洗液可先后兩次用50 mL 37°C 滅菌生理鹽水沖刷，并進(jìn)行回收，沖刷范圍深廣，灌洗液回收量充足，極大地提高了診斷陽(yáng)性率。

2.3 SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化陽(yáng)性率與肺癌病理類(lèi)型有關(guān)

可做甲基化檢測(cè)的基因有多種，不同的基因甲基化陽(yáng)性率與肺癌病理類(lèi)型之間存在相關(guān)性。Schmidt等[19]通過(guò)差異性甲基化雜交技術(shù)對(duì)肺癌患者支氣管肺泡灌洗液中的癌細(xì)胞進(jìn)行全基因組合分析，發(fā)現(xiàn)SHOX2 甲基化對(duì)診斷肺鱗癌和肺小細(xì)胞癌敏感性較高，分別為82%和97%。有研究顯示[20]，SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)在肺鱗癌和肺小細(xì)胞癌中的檢測(cè)陽(yáng)性率分別是90.9%和100%，上述情況可能與這兩種類(lèi)型的肺癌存在較高水平的SHOX2 基因甲基化有關(guān)。本文1例患者的病理檢查結(jié)果為類(lèi)癌，雖然類(lèi)癌與肺小細(xì)胞癌同屬于神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤，但兩者之間并不完全相同，不排除存在SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)對(duì)類(lèi)癌陽(yáng)性率不高的可能性。類(lèi)癌與肺小細(xì)胞癌是否存在基因甲基化位點(diǎn)的不同，尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.4 SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化陽(yáng)性率與肺癌分化程度有關(guān)

有研究顯示[12]，支氣管肺泡灌洗液SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)對(duì)Ⅰ期肺癌的診斷敏感性為75%，而在Ⅳ期肺癌則為100%。這可能與Ⅳ期肺癌惡性程度高、細(xì)胞分化程度低、生長(zhǎng)速度快、更容易壞死、侵襲性更強(qiáng)，進(jìn)而導(dǎo)致更多的基因釋放相關(guān)。類(lèi)癌細(xì)胞分化程度好，生長(zhǎng)較為緩慢，惡性程度較低，因此SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化可能對(duì)類(lèi)癌敏感性不高，從而影響檢測(cè)結(jié)果的陽(yáng)性率。

3 小結(jié)

分子遺傳學(xué)檢測(cè)技術(shù)的快速發(fā)展為腫瘤臨床診斷、治療評(píng)估指引了新的方向，其中基因甲基化檢測(cè)更是展露鋒芒。臨床上，SHOX2和RASSF1A基因組合的甲基化檢測(cè)，對(duì)早期肺癌具有敏感性和特異性，可在肺癌的早診早治中得以應(yīng)用。但同時(shí)需關(guān)注以下幾點(diǎn)：①需綜合考慮患者情況、病變部位、影像表現(xiàn)等，選擇恰當(dāng)?shù)臉?biāo)本采集方法，保證標(biāo)本類(lèi)型合適，標(biāo)本量充足，以改善患者檢測(cè)結(jié)果陽(yáng)性率。②重視對(duì)病理類(lèi)型和分化程度的提前估測(cè)，SHOX2 和RASSF1A基因組合的甲基化檢測(cè)可能受病理類(lèi)型及分化程度的影響較明顯，在檢測(cè)前預(yù)估有助于保證最終檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

本文通過(guò)對(duì)1例肺結(jié)節(jié)假陰性案例進(jìn)行分析報(bào)道，總結(jié)了其出現(xiàn)的可能原因，以期增強(qiáng)對(duì)SHOX2和RASSF1A基因組合甲基化檢測(cè)的認(rèn)識(shí)，從而更好地為肺癌臨床診斷服務(wù)。