陳德焱

廣東省陽(yáng)江市中醫(yī)醫(yī)院骨一科，廣東陽(yáng)江 529500

中藥和天然產(chǎn)物通常是藥物發(fā)現(xiàn)的最佳來(lái)源[1]。柚皮苷又名柚甙、柑橘甙、異橙皮甙，是一種天然化合物，其分子結(jié)構(gòu)如圖1。柚皮苷是中藥骨碎補(bǔ)、枳實(shí)、枳殼、橘紅的主要活性成分。柚皮苷是一種天然雙氫黃酮類化合物，得益于其A 環(huán)和B 環(huán)之間不存在共軛關(guān)系，其在282 nm 存在強(qiáng)烈的紫外線吸收峰，表現(xiàn)出豐富的生物學(xué)活性以及藥理作用?，F(xiàn)代藥理研究表明，柚皮苷具有保護(hù)軟骨組織、促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖與分化、抗氧化、抗炎等藥理學(xué)作用[2-7]。對(duì)于像柚皮苷這樣的天然化合物，關(guān)于其毒性和藥物性質(zhì)的了解往往早于對(duì)其作用目標(biāo)靶點(diǎn)或作用機(jī)制的研究及精確了解。因此，關(guān)于柚皮苷藥理作用機(jī)理、分子靶點(diǎn)的認(rèn)識(shí)，亟須進(jìn)一步探討。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是從分子、網(wǎng)絡(luò)、細(xì)胞，到組織、器官等各個(gè)水平上研究藥物治療疾病時(shí)引起機(jī)體功能變化機(jī)制，從微觀（分子、生化網(wǎng)絡(luò)水平）到宏觀（組織、器官、整體水平）建立藥物對(duì)機(jī)體的作用機(jī)制的一門學(xué)科。采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探討藥物的分子機(jī)制，已經(jīng)成為當(dāng)今主流，越來(lái)越受到科研工作者們的青睞，因?yàn)橥ㄟ^(guò)這樣的研究方法可以節(jié)省時(shí)間、金錢和精力[8-9]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，可以推斷分子作用靶點(diǎn)及調(diào)控通路，有助于藥物的發(fā)現(xiàn)和改善藥物的設(shè)計(jì)過(guò)程，從而解決未滿足的醫(yī)療需求[10]。Ye 等[11-12]通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，分別明確了辣椒素（capsaicin）和丹參酮Ⅱa（tanshinone Ⅱa）的潛在靶點(diǎn)。作為一種來(lái)自于傳統(tǒng)中藥的活性化合物，柚皮苷同樣適合這種類型的分析。因此，本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，從分子機(jī)制探討柚皮苷的分子作用機(jī)制。

圖1 柚皮苷的分子結(jié)構(gòu)

1 材料與方法

1.1 柚皮苷的藥理和分子性質(zhì)評(píng)價(jià)

從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP，http://ibts.hkbu.edu.hk/LSP/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取柚皮苷吸收、分布、代謝和排泄（absorption，distribution，metabolism，excretion，ADME）性質(zhì)評(píng)價(jià)相關(guān)信息，如口服利用度（oral bioavailability，OB）、類藥性（drug-likeness，DL）、血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）、分子量（molecular weight，MW）、脂水分配系數(shù)（fractional water accessible surface area of all atoms with negative partial charge，AlogP）、氫鍵供體數(shù)（Hbond donor，Hdon）、拓?fù)浞肿訕O性表面積（topological polar surface A，TPSA）、氫鍵受體數(shù)（Hbond acceptor count，Hacc）、可旋轉(zhuǎn)鍵（rotating bond，RBN）等。DL 是藥物設(shè)計(jì)的一種定性概念，用于評(píng)估一種化合物的類藥程度，有助于優(yōu)化藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物性能[13]。TCMSP 和分析平臺(tái)收集《中華人民共和國(guó)藥典》（2015年版一部）中499 味草藥及其化合物成分的數(shù)據(jù)，還可以提供每個(gè)化合物的人體ADME 性質(zhì)評(píng)價(jià)數(shù)據(jù)[13]。

1.2 柚皮苷藥物作用靶點(diǎn)查詢

從GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲取柚皮苷潛在靶標(biāo)候選物，根據(jù)評(píng)分≥2.0，候選靶點(diǎn)為人類進(jìn)行靶點(diǎn)篩選。GeneCards 是一個(gè)綜合數(shù)據(jù)庫(kù)，基本覆蓋了幾大數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)于基因的分析數(shù)據(jù)，其可以提供簡(jiǎn)明的基因組、蛋白質(zhì)組、轉(zhuǎn)錄、遺傳和功能上所有已知和預(yù)測(cè)人類基因。并和Uniprot（http://www.uniprot.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)篩選。Uniprot是一個(gè)收錄蛋白質(zhì)序列最廣泛、功能注釋最全面的一個(gè)集中收錄蛋白質(zhì)資源的數(shù)據(jù)庫(kù)，并且其能和其他不同功能的數(shù)據(jù)庫(kù)相互聯(lián)系。

1.3 GeneMANIA 分析

GeneMANIA（http://www.genemania.org）是一個(gè)靈活的、用戶友好的web 界面，用于生成關(guān)于基因功能的假設(shè)、分析基因列表和為功能分析確定基因的優(yōu)先級(jí)[14]。輸入既定的基因列表，GeneMANIA 使用可用的基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)識(shí)別功能相似的基因擴(kuò)展該列表[14]。GeneMANIA 還報(bào)告了用于查詢的每個(gè)選定數(shù)據(jù)集預(yù)測(cè)值的權(quán)重[14]。

1.4 基因本體論（gene ontology，GO）分析、通路分析及可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

GO 是描述基因產(chǎn)物功能，廣泛應(yīng)用在生物信息學(xué)領(lǐng)域的一個(gè)本體[15]。作為一個(gè)廣泛應(yīng)用于基因功能分類的系統(tǒng)，其涵蓋生物學(xué)的三個(gè)方面：細(xì)胞組分、分子功能、生物功能[15]。GO富集分析應(yīng)用分子注釋系統(tǒng)（Molecule Annotation System 3.0，MAS 3.0）進(jìn)行。該系統(tǒng)可以幫助理解基因表達(dá)數(shù)據(jù)之間的關(guān)系，并提供全面、可視化的有關(guān)目標(biāo)基因的信息。通過(guò)MAS 3.0 可以收集到柚皮苷的GO 富集信息和KEGG 通路信息。獲得相關(guān)信息后，通過(guò)Cytoscape 3.6.1 軟件進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和分析[16]。主要方法及路線見(jiàn)圖2。

圖2 柚皮苷藥理作用機(jī)制研究的主要方法及路線

2 結(jié)果

2.1 柚皮苷的藥理和分子性質(zhì)

DL 是用于評(píng)估一種化合物類藥程度的指標(biāo)，有助于優(yōu)化藥物代謝動(dòng)力學(xué)和藥物性能，化合物的DL值≥0.18 被認(rèn)為篩選中藥生物活性化合物的合適標(biāo)準(zhǔn)[13，17-18]。通過(guò)TCMSP 得到的柚皮苷的藥理及分子性質(zhì)：MW 為580.59，AlogP 為-0.46，Hdon 為8，Hacc 為14，OB 為6.92，BBB 為-3.00，TPSA 為225.06，RBN 為6，DL 為0.78。值得注意的是柚皮苷的DL 值為0.78，遠(yuǎn)高于0.18 水平，因此表明柚皮苷可能是一種富有良好前景的藥物。

2.2 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

從GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選出Score≥2.0 靶點(diǎn)共19 個(gè)，并和Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)篩選，其中3 個(gè)未找到匹配信息予以剔除，2 個(gè)靶點(diǎn)Uniprot 數(shù)據(jù)庫(kù)中對(duì)應(yīng)物種非人類。其余靶點(diǎn)及基因如表1所示。

2.3 GeneMANIA 分析結(jié)果

在14 個(gè)靶標(biāo)及其相互作用蛋白中，65.18%表現(xiàn)出相似的共表達(dá)特征（Co-expression），17.30%存在共同的通路（Pathway），12.39%有著共同的蛋白質(zhì)域（Shared protein domains），其余結(jié)果如物理交互（Physical interactions）、協(xié)同定位（Co-localization）如圖3（封三）所示。

圖3 GeneMANIA 分析結(jié)果（見(jiàn)內(nèi)文第14 頁(yè)）

表1 靶點(diǎn)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.4 GO 富集和通路分析以及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

為了進(jìn)一步研究篩選得到的14 個(gè)目標(biāo)基因，使用MAS 3.0 對(duì)交互作用網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行分析研究，結(jié)果如表2和圖4（封三）所示。前五項(xiàng)功能分別是細(xì)胞過(guò)程（GO:0009987 cellular process）、生理過(guò)程（GO:0007582 physiological process）、生物調(diào)節(jié)（GO:0065007 biological regulation）、生物進(jìn)程的調(diào)節(jié)（GO:0050789 regulation of biological process）、發(fā)育過(guò)程（GO:0032502 developmental process），共約占46%。KEGG 通路分析排行前25 的通路見(jiàn)表3?；诎悬c(diǎn)及其通路分析結(jié)果，通過(guò)Cytoscape 3.6.1 進(jìn)行可視化網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建，如圖5（封三）所示。

圖4 基于MAS 3.0 分析結(jié)果（見(jiàn)內(nèi)文第14 頁(yè)）

圖5 柚皮苷-靶點(diǎn)-通路可視化網(wǎng)絡(luò)圖（見(jiàn)內(nèi)文第14 頁(yè)）

3 討論

一種化合物的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性及藥物毒性不符合藥物研發(fā)的要求是導(dǎo)致藥物開(kāi)發(fā)后期失敗的重要原因，越來(lái)越多的學(xué)者認(rèn)為這些方面的因素應(yīng)該在藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程中得到優(yōu)先考慮[19]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法，可以提高預(yù)測(cè)和模擬藥代動(dòng)力學(xué)、代謝過(guò)程和毒性終點(diǎn)的能力，從而達(dá)到簡(jiǎn)化和加速藥物發(fā)現(xiàn)過(guò)程的目的[19]。

在有機(jī)小分子藥物設(shè)計(jì)中，很多小分子候選化合物往往具有很好的體外活性，但是一旦進(jìn)入下一步動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的時(shí)候，在體的藥理活性常常得不到很好的結(jié)果。當(dāng)出現(xiàn)這種情況的時(shí)候往往涉及到藥代動(dòng)力學(xué)范疇，資深藥物化學(xué)家克里斯多夫·里賓斯基[20-21]提出篩選類藥分子的五規(guī)則：①化合物的分子量小于500 道爾頓；②化合物結(jié)構(gòu)中的Hdon（包括羥基、氨基等）不超過(guò)5 個(gè)；③化合物結(jié)構(gòu)中的Hacc 不超過(guò)10 個(gè)；④化合物的AlogP 在-2～5 之間；⑤化合物中RBN 的數(shù)量不超過(guò)10 個(gè)。符合里賓斯基無(wú)規(guī)則的化合物會(huì)有更好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過(guò)程中會(huì)有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。在藥物研發(fā)領(lǐng)域，該規(guī)則被應(yīng)用于對(duì)化合物的初篩，以達(dá)到摒除那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選范圍并降低藥物研發(fā)成本[22]。在長(zhǎng)期的實(shí)踐過(guò)程中，五規(guī)則被簡(jiǎn)化為“四規(guī)則”和“三規(guī)則”，“四規(guī)則”去掉了關(guān)于RBN 的數(shù)量限制；“三規(guī)則” 則進(jìn)一步去掉了對(duì)Hacc 量的限制[21]。柚皮苷的分子屬性基本能符合“三規(guī)則”。

表2 潛在靶點(diǎn)的GO 富集分析

DL 這一概念是通過(guò)對(duì)現(xiàn)有小分子藥物和（或）候選藥物物理化學(xué)性質(zhì)和或結(jié)構(gòu)特征的分析而建立起來(lái)的，并且被廣泛應(yīng)用于化合物的篩選，通過(guò)DL 可以過(guò)濾掉那些藥物代謝動(dòng)力學(xué)性質(zhì)較差的化合物[23]?；衔锏腄L 值≥0.18 被認(rèn)為篩選中藥生物活性化合物的合適標(biāo)準(zhǔn)[13，17-18]。

靶標(biāo)識(shí)別是藥物發(fā)現(xiàn)的第一步，越來(lái)越多的藥物或活性化合物的作用方式呈現(xiàn)出多靶點(diǎn)的特點(diǎn)[24]。通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法可以預(yù)測(cè)藥物或活性化合物的作用靶點(diǎn)[24-25]。本研究中，通過(guò)這樣的方法得到了柚皮苷的14 個(gè)潛在靶標(biāo)。從通路富集分析結(jié)果可知，柚皮苷預(yù)測(cè)靶點(diǎn)基因主要和癌癥、骨代謝、抗炎、抗氧化等通路相關(guān)。其中，柚皮苷可能主要通過(guò)Wnt 信號(hào)通路、TGF-β 信號(hào)通路、MAPK 信號(hào)通路、破骨細(xì)胞信號(hào)通路（Osteoclast differentiation）等直接影響骨代謝，通過(guò)P13K-Akt、VEGF 信號(hào)通路等間接調(diào)節(jié)骨代謝，具有抗骨質(zhì)疏松的作用。其抗癌機(jī)制預(yù)測(cè)結(jié)果主要通過(guò)影響內(nèi)分泌抑制信號(hào)通路（Endocrine resistance）、癌癥途徑（Pathways in cancer）、癌癥中的蛋白多糖（Proteoglycans in cancer）等信號(hào)通路，抗炎抗氧化機(jī)制主要通過(guò)干預(yù)MAPK 信號(hào)通路、TOLL 樣受體信號(hào)通路等。目前，柚皮苷的部分靶點(diǎn)相關(guān)研究已經(jīng)明確。Li 等[26]通過(guò)實(shí)驗(yàn)證明載柚皮苷殼聚糖底物能通過(guò)激活Smad 受體（TGF-β 信號(hào)通路中）而激活成骨蛋白Smad 的信號(hào)傳導(dǎo)，并證實(shí)了柚皮苷能促進(jìn)成骨蛋白的表達(dá)，包括Ⅰ型膠原蛋白、骨唾液酸蛋白以及骨鈣蛋白。這和本研究得到柚皮苷前5 個(gè)通路中的膠原分解代謝過(guò)程和SMAD 蛋白通路的結(jié)果一致。同時(shí)研究也證實(shí)了柚皮苷能增加成骨細(xì)胞標(biāo)志蛋白（如骨鈣蛋白、骨形成蛋白、骨橋蛋白等）的表達(dá)，并且能夠抑制RANKL[re-ceptor activator of nuclear factor-kappa B（NF-κB）ligand]通路，抑制破骨細(xì)胞形成，而達(dá)到延緩骨質(zhì)疏松，促進(jìn)成骨的作用[27-28]。李風(fēng)波等[29]研究指出，柚皮苷可以下調(diào)破骨細(xì)胞分化過(guò)程中RANK、TRAP、MMP-9、NFATc1、mRNA 以及上調(diào)C-fos mRNA 的表達(dá)，進(jìn)而影響破骨分化和骨吸收作用。Song 等[30]通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)推斷出柚皮苷能通過(guò)調(diào)節(jié)VEGF/VEGFR-2 通路來(lái)激發(fā)血管再生。研究也證實(shí)了柚皮苷在抗炎、調(diào)脂、抗氧化等的作用機(jī)制[31-35]。因此，通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法可預(yù)測(cè)得到柚皮苷的作用機(jī)制呈現(xiàn)多靶點(diǎn)的特性，GeneMANIA分析結(jié)果提供了共表達(dá)和共同蛋白質(zhì)域的信息，提示靶標(biāo)及其相互作用可能具有相同或類似功能。通過(guò)對(duì)現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)挖掘，得到的信息進(jìn)行整理和分析后得出與臨床實(shí)踐和藥理研究結(jié)論相似，并且結(jié)果更為詳實(shí)、可靠。本研究通過(guò)MAS 3.0 進(jìn)行GO 和Pathway 分析，并應(yīng)用Cytoscape 構(gòu)建可視化網(wǎng)絡(luò)，直觀地展示了得到的結(jié)果。

表3 KEGG 通路富集結(jié)果

中藥具有多成分的特點(diǎn)，其化合物作用機(jī)制也呈現(xiàn)多靶點(diǎn)特性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的提出和應(yīng)用，從整體水平以及分子水平為其研究提供了科學(xué)的理論和方法，有助于研究中藥天然化合物及新藥的研發(fā)，并且對(duì)促進(jìn)中醫(yī)中藥理論的發(fā)展和中西醫(yī)藥的結(jié)合具有深遠(yuǎn)的意義。綜合運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法有助于快速全面地預(yù)知化合物的藥理作用機(jī)制，并為下一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證提供指導(dǎo)。