鄧碩真，劉惠軍，王洪芹，王紅艷，張倩茹，張 梅

（中國農(nóng)業(yè)大學煙臺研究院，山東 煙臺 264670）

中國具有水資源短缺、分布不均衡、過分利用從而導致大量浪費等問題，目前大面積土地處于干旱和半干旱區(qū)域，水資源的不足嚴重抑制了農(nóng)業(yè)的生產(chǎn)和發(fā)展。在干旱環(huán)境下，植物細胞的膨壓下降、葉片萎蔫下垂，在極度干旱的環(huán)境下，植物細胞嚴重脫水，體內(nèi)各個生理生化反應(yīng)混亂失調(diào)，嚴重的情況下則會促使植物死亡［1］。中國糧食和蔬果的產(chǎn)量和質(zhì)量深受干旱條件制約。黃瓜（Cucumis sativusL.）屬于中國普遍種植的蔬菜種類，因其鮮嫩多汁、富含養(yǎng)分而深受人們喜愛，栽種面積大、分布廣。但是黃瓜是淺根性作物，面對環(huán)境的水分變化敏感度高，整個生命周期大量需水，抵御干旱的能力不足。因此探索具有提高黃瓜抗旱性功能的外源生長物質(zhì)具有重要意義。

5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，ALA）又名δ-氨基乙酰丙酸，是一種非蛋白氨基酸，廣泛分布于動植物機體活細胞中，是合成葉綠素、血紅素和維生素B12等四吡咯環(huán)色素的必要前體物質(zhì)，在生物體的多種生物化學反應(yīng)發(fā)揮重要作用［2］。前人試驗發(fā)現(xiàn)，5-ALA 具有提高菠菜幼苗抗氧化酶活性［3］；提高葉綠素b 含量從而穩(wěn)定LHCⅡ脫輔基蛋白結(jié)構(gòu)［4］；促進鹽脅迫下酸棗種子萌發(fā)［5］；促進愈傷組織不定根不定芽分化［6］；提高棉花［7］、草莓［8］等多種植物的抗鹽性以及提高甜瓜［9］、黃瓜［10］等瓜類抗冷性的功效，是一種杰出的外源植物生長調(diào)節(jié)劑，被普遍應(yīng)用于農(nóng)業(yè)環(huán)境調(diào)控研究。但是有關(guān)5-ALA 提高植物抗旱性的探究較少。PEG-6000（聚乙二醇）是一種理想的高分子滲透劑，滲透壓穩(wěn)定，限制植物水分吸收速率，可以用于干旱缺水環(huán)境的模擬。

為此，以津耘五號黃瓜種子及幼苗作為試驗材料，采用20% PEG-6000 進行根灌處理，不同濃度的5-ALA 進行葉面噴施處理，探索5-ALA 對干旱脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)及黃瓜幼苗的生長發(fā)育是否具有緩解作用，并確定效果最明顯的5-ALA 濃度，以期為黃瓜的種植栽培提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試的黃瓜種子為津耘五號，購自天津子豐種業(yè)有限公司，5-ALA 由山東深海生物科技股份有限公司提供，現(xiàn)用現(xiàn)配。PEG-6000 的濃度為20%（由預試驗確定）。

1.2 種子萌發(fā)生理指標測定

選取大小均一、顆粒飽滿、完整無破損的黃瓜種子 1 050 粒，經(jīng)過0.1%（W/V）HgCl2消毒15 min 后，反復清洗直至除去殘留。將種子投入55～60 ℃的溫水處理10～15 min，用玻璃棒攪拌，待水溫降到20～30 ℃，將其放置在25 ℃恒溫箱內(nèi)浸種4～6 h。浸種后的種子隨機分為7 組，培養(yǎng)在直徑為9 cm，內(nèi)鋪一層濾紙的培養(yǎng)皿中。每組3 個培養(yǎng)皿，各有黃瓜種子50 粒，以此作為3 次重復。試驗組設(shè)置為雙蒸餾水空白對照（T0）、20% PEG-6000 處理（T1）以及在T1 基礎(chǔ)上分別加入 0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。將培養(yǎng)皿置于25 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，每天更換溶液，并保持空氣暢通，記錄發(fā)芽種子數(shù)，第3 天量取發(fā)芽種子芽長度，并計數(shù)全部芽長大于2 mm 的黃瓜種子。測量記錄后計算種子的發(fā)芽率（Gr）、發(fā)芽指數(shù)（Gi）和活力指數(shù)（Vi），計算公式如下：

發(fā)芽率（Gr）=（3 d 內(nèi)發(fā)芽的種子數(shù)/試驗種子總數(shù)）×100%

發(fā)芽指數(shù)（Gi）=ΣGt/Dt

式中，ΣGt為第3 天發(fā)芽數(shù)，Dt為發(fā)芽天數(shù)。

活力指數(shù)（Vi）=Gi×S

式中，S為第3 天幼根平均長度。

1.3 幼苗生理指標測定

選取飽滿、大小一致的黃瓜種子于55～60 ℃的溫水浸種后，放置于25 ℃恒溫箱中催芽至露白，播于32 孔穴盤中，定期定量灌溉。待幼苗長至兩葉一心時，選取長勢相同的黃瓜幼苗移栽至盆中，分為7個試驗組，每組24 株，3 次重復。試驗組設(shè)置為雙蒸餾水空白對照（T0）、20% PEG-6000 處理（T1）以及在T1基礎(chǔ)上分別加入0.05 mg/L（T2）、0.5 mg/L（T3）、1.0 mg/L（T4）、5.0 mg/L（T5）、10.0 mg/L（T6）的5-ALA。緩苗后，向幼苗根灌20% PEG-6000溶液1次，澆透為止。7 d后，傍晚向幼苗葉片噴施5-ALA溶液，葉片反面滴水為限，每3 d 噴施一次，處理后12 d 取樣測定，測定的生理指標包括黃瓜幼苗的株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數(shù)、根系活力、可溶性糖含量、游離脯氨酸含量及光合色素含量。

1.3.1 幼苗生長指標測定 將幼苗在營養(yǎng)土中挖出，用去離子水洗凈植株，將地上和地下部分分離，擦干。量取植株莖底部到生長點的間隔，記為株高，量取地上部1 cm 處莖粗。將樣品于105 ℃下烘干至恒重，用分析天平稱量其干重。計算壯苗指數(shù)的公式為：

壯苗指數(shù)=（地下部干重/地上部干重+莖粗/株高）×全株干重

1.3.2 幼苗生理指標測定 黃瓜幼苗游離脯氨酸含量測定采用水合茚三酮法［11］，用 μg/g FW 表示其含量，使用紫外分光光度計進行比色。可溶性糖含量采用蒽酮法［11］測定，用紫外分光光度計測其在630 nm 處的吸光度，用mg/g FW 表示含量。根系活力的測定采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色法［12］，光合色素含量采用趙世杰等［12］的方法，用80%丙酮提取后比色。

1.4 數(shù)據(jù)分析

對3 組重復的數(shù)據(jù)取平均值，用SPSS 18.0 進行方差分析，用LSD法進行多重比較，顯著性差異水平為P＜0.05，用Origin 進行圖表的繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜種子的發(fā)芽指標

由表1 可知，20% PEG-6000 處理下黃瓜種子萌發(fā)受到嚴重抑制，黃瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均處于最低水平。隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)首先呈上升趨勢，當5-ALA 濃度達到0.5 mg/L 時，發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均達到最大值。發(fā)芽率為92.3%，相對于T1（干旱處理）黃瓜種子發(fā)芽率（59.7%）提高了32.6個百分點，與T0（蒸餾水）處理發(fā)芽率（92.1%）無顯著差異；發(fā)芽指數(shù)為15.39，相對于T1（干旱處理）黃瓜種子發(fā)芽指數(shù)（9.94）提高了54.83%，與T0（蒸餾水）處理黃瓜種子發(fā)芽指數(shù)（15.35）無顯著差異；活力指數(shù)為74.47，是T1（干旱處理）活力指數(shù)（10.69）的6.97 倍，與T0（蒸餾水）處理黃瓜種子的活力指數(shù)（70.82）無顯著差異。隨著5-ALA 濃度進一步提高，黃瓜種子發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、活力指數(shù)均明顯出現(xiàn)下降趨勢，當 5-ALA 濃度為 10.0 mg/L（T6）時，黃瓜種子活力指數(shù)（19.61）與T1（干旱處理）無顯著差異，說明不同濃度的5-ALA 能夠緩解干旱脅迫對黃瓜種子萌發(fā)的限制作用，在試驗處理中，0.5 mg/L 5-ALA效果最好，過高濃度的5-ALA 對干旱脅迫下黃瓜種子發(fā)芽的促進作用反而不明顯。

表1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜種子發(fā)芽指標

2.2 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的生長指標

在干旱缺水條件下，植物一般通過形態(tài)上的變化來順應(yīng)外部環(huán)境。由表2 可知，葉面噴施5-ALA明顯緩解了干旱環(huán)境對黃瓜幼苗生長發(fā)育的抑制，隨著5-ALA 濃度的升高，黃瓜幼苗的株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數(shù)首先呈上升趨勢。其中T3（0.5 mg/L）的緩解效果最好，株高、莖粗、根冠比、干重和壯苗指數(shù)相對于T1（干旱處理）分別提高了43.08%、37.41%、30%、99.13%和104.51%，與T0（蒸餾水）處理無顯著差異。隨著5-ALA 濃度的繼續(xù)提高，各指標明顯出現(xiàn)下降走勢。當5-ALA 濃度為10.0 mg/L（T6）時，黃瓜幼苗的莖粗、根冠比、干重及壯苗指數(shù)與T1（干旱處理）無顯著差異，說明高濃度的5-ALA 對黃瓜植株的生長發(fā)育和形態(tài)建成的促進效果不明顯。

表2 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗生長的影響

2.3 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

游離脯氨酸和可溶性糖在植物細胞內(nèi)發(fā)揮滲透調(diào)節(jié)的作用，其含量和植物抗旱性呈正相關(guān)。如表3 所示，T1（干旱處理）下，黃瓜植株游離脯氨酸含量和可溶性糖含量均明顯高于T0（蒸餾水）處理，表明黃瓜幼苗此時處于滲透脅迫中。隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜幼苗體內(nèi)游離脯氨酸和可溶性糖含量均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當5-ALA 濃度為0.5 mg/L 時，黃瓜幼苗體內(nèi)的游離脯氨酸和可溶性糖含量到達最大值，此時游離脯氨酸含量為65.26 μg/g FW，相對于T1（干旱處理）下游離脯氨酸含量（24.77 μg/g FW）提高了163.46%；此時可溶性糖含量為60.40 mg/g FW，相對于T1（干旱處理）下可溶性糖含量（42.90 mg/g FW）提高了40.79%。當用10.0 mg/L（T6）的5-ALA 處理黃瓜幼苗時，其可溶性糖和游離脯氨酸含量都明顯低于T3（0.5 mg/L）處理，此時可溶性糖含量與T1（干旱處理）無顯著差異，說明不同濃度的5-ALA 能夠提高干旱條件下黃瓜植株體內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量，從而增強其抵御干旱的能力。在本試驗處理中，0.5 mg/L 5-ALA 效果最好，過高濃度的5-ALA 對黃瓜幼苗抗旱性提高的效果反而不明顯。

表3 不同濃度5-ALA對黃瓜幼苗滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

2.4 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的根系活力

植物根系是直接吸水器官，最先感受干旱脅迫，并立即啟動一連串抗旱響應(yīng)機制，根系活力的高低也會受到影響［13］。由圖1 可知，在干旱脅迫下，隨著5-ALA 濃度的提高，黃瓜幼苗根系活力逐漸增強，當5-ALA 濃度達到0.5 mg/L 時，根系活力最強，為121.0 μg/g FW·h，相對于 T1（干旱處理）根系活力（71.0 μg/g FW·h）提高了70.42%，與T0（蒸餾水）處理根系活力（129.3 μg/g FW·h）無顯著差異。5-ALA濃度進一步提高，黃瓜幼苗根系活力則呈現(xiàn)下降趨勢，T6（10.0 mg/L）根系活力（77.7 μg/g FW·h）顯著低于T3（0.5 mg/L），與T1（干旱處理）無顯著差異。

圖1 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗根系活力

2.5 不同濃度5-ALA 處理下黃瓜幼苗的光合色素含量

干旱脅迫會引起葉綠體的解體及光合色素降解，從而阻止光合作用的正常運行。因此光合色素含量表征了植物抗旱能力的強弱。如表4 所示，在干旱環(huán)境下，黃瓜幼苗的葉綠素和類胡蘿卜素含量最低，隨著不同濃度5-ALA 的加入，有了不同程度的提高。0.5 mg/L 5-ALA 處理下，黃瓜幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量達到峰值，此時葉綠素含量顯著高于T0（蒸餾水）處理，相比T0（蒸餾水）提高了16.55%，相比T1（干旱處理）提高了38.59%；此時類胡蘿卜素含量與T0（蒸餾水）無顯著差異，相對于T1（干旱處理）提高了126.92%。隨著5-ALA 濃度的繼續(xù)提高，黃瓜幼苗葉綠素和類胡蘿卜素含量逐漸下降。當用 5.0 mg/L（T5）的 5-ALA 處理時，類胡蘿卜素含量與T1（干旱處理）無顯著差異。

表4 不同濃度5-ALA 對黃瓜幼苗光合色素含量的影響

3 小結(jié)與討論

種子萌發(fā)期對環(huán)境變化十分敏感，種子的發(fā)芽特性決定了其成苗率，進而影響幼苗的生長發(fā)育和形態(tài)建成，影響果實的產(chǎn)量和品質(zhì)。本試驗表明，經(jīng)過5-ALA 處理后，黃瓜種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)和活力指數(shù)相對于干旱環(huán)境都有不同程度的提高，其中以0.5 mg/L 5-ALA 處理下最高，這與張春平等［14］研究的甘草種子結(jié)果相似。

PEG-6000 模擬的干旱環(huán)境明顯抑制了黃瓜幼苗的生長發(fā)育。其株高、莖粗、根冠比、干重、壯苗指數(shù)和根系活力等指標均顯著低于蒸餾水環(huán)境中生長的幼苗。在加入外源5-ALA 后，每項生長指標都有不同程度的增加，說明葉面噴施5-ALA 可以提高幼苗對干旱環(huán)境的抵御能力。這與何娟等［15］研究的發(fā)現(xiàn)外源5-ALA 可緩解干旱脅迫對香蕉幼苗生長發(fā)育的遏制是相似的。隨著加入的5-ALA 濃度的提高，其對干旱脅迫的緩解作用呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，其中峰值為0.5 mg/L，高濃度的5-ALA 緩解作用反而很低，這與王宏信等［16］的試驗結(jié)果相似。

可溶性糖和游離脯氨酸屬于植物細胞內(nèi)的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，在干旱條件下會發(fā)生累積。它們含量的增加有助于增大細胞液濃度，降低細胞內(nèi)的水勢，增強細胞保水能力［17］，從而維系細胞膨壓，促進細胞分裂擴大，避免植物萎蔫；有助于維持氣孔運動，促進CO2的吸收，從而保證光合作用正常運行，防止干旱條件下光抑制的發(fā)生［18-20］。脯氨酸還具有除去活性氧［21］，防止生物膜破壞的作用；作為無毒害氮源合成葉綠素；與蛋白質(zhì)結(jié)合，增強其溶解性［22］等功能。因此植物體內(nèi)游離脯氨酸和可溶性糖含量越高，其抵抗干旱的能力也就越強。試驗結(jié)果顯示，在干旱環(huán)境下，隨著5-ALA 濃度的增加，可溶性糖和游離脯氨酸的含量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，于0.5 mg/L 達到最大值，幼苗的抗旱性也最強。

干旱環(huán)境下，植物的氣孔導度降低，CO2的不足及酶活性的下降抑制了光合碳同化的進行，進而抑制光合電子傳遞，降低植物的光飽和點，弱光便會導致光能過剩，從而發(fā)生光抑制［23］，產(chǎn)生過氧化物損傷葉綠體膜系統(tǒng)，致使葉綠素和類胡蘿卜素降解破壞而含量降低。葉綠素和類胡蘿卜素是維持植物正常光合作用的重要物質(zhì)，它們能夠吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化光能，其含量與植物光合強度有直接關(guān)系。此外，葉黃素循環(huán)具有熱耗散、穩(wěn)定類囊體膜的結(jié)構(gòu)、抑制膜脂過氧化等作用［24］，因此它們在維持光合結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、抵御光抑制，維持植物同化生成有機物的能力等方面具有重要作用。在干旱條件下葉綠素含量和類胡蘿卜素含量越高，植物抵御光破壞的能力就越強，植物抗旱性也越高。本試驗表明在PEG-6000模擬的干旱環(huán)境下，5-ALA 的加入提高了幼苗體內(nèi)葉綠素和類胡蘿卜素的含量，其中以0.5 mg/L 效果最佳，高濃度的5-ALA 緩解效果反而下降，兩者含量的提高不明顯，這與偶春等［25］對梔子幼苗相關(guān)研究結(jié)果相似。5-ALA 是形成葉綠素的關(guān)鍵前體物質(zhì)，在一系列酶的作用下合成原葉綠素酸酯，最終形成葉綠素，5-ALA 的合成是植物體中合成葉綠素等四吡咯的限速步驟。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)［26］，外源噴施5-ALA 可以上調(diào)草地早熟禾葉片內(nèi)膽色素原合成酶、尿卟啉原脫羧酶、原葉綠素酸酯還原酶等與卟啉和葉綠素生物合成有關(guān)的催化酶基因表達，增強酶的活性，提高膽色素原、原卟啉IX、原葉綠素酸酯等中間產(chǎn)物的含量，并促進中間產(chǎn)物向下游產(chǎn)物的轉(zhuǎn)化，從而促進葉綠素的合成；同時外源5-ALA 能通過上調(diào)內(nèi)源5-ALA 合成途徑相關(guān)酶基因的表達，來促進內(nèi)源5-ALA 的合成，進一步促進葉綠素的合成。因此5-ALA 處理下黃瓜幼苗體內(nèi)葉綠素含量提高的作用機理可能與之相似。

綜上，葉面噴施不同濃度5-ALA 可以不同程度地促進干旱脅迫下黃瓜種子的萌發(fā)，促進幼苗體內(nèi)光合色素含量及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的提高，促進生物量的積累從而促進其生長發(fā)育和形態(tài)建成。其中以0.5 mg/L 處理效果最佳，在此濃度下，黃瓜種子的發(fā)芽狀況及黃瓜幼苗的各項生長和生理指標均顯著高于干旱環(huán)境，過高濃度的5-ALA 對植物抗旱能力的提高反而不明顯。