賴麗梨，靳 煥，段華英，鄒爭(zhēng)志*

(1. 廣州市增城區(qū)人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 511300； 2. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院激光生命科學(xué)研究所暨激光生命科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510631； 3. 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院婦產(chǎn)科，廣州 510260)

宮頸癌是導(dǎo)致女性癌癥死亡的主要原因之一. 在世界范圍內(nèi)，宮頸癌是女性中第四大最常見的惡性腫瘤，該疾病對(duì)婦女生命安全與健康構(gòu)成了嚴(yán)重威脅. 致癌性人類乳頭瘤病毒(HPV)類型持續(xù)感染是引發(fā)宮頸癌發(fā)生發(fā)展的主要原因[1-2]. 此外，遺傳因素、環(huán)境因素及原癌基因的突變等非HPV病毒感染也可能會(huì)發(fā)展為宮頸癌[3]. 現(xiàn)階段，對(duì)于宮頸癌的治療取決于診斷時(shí)的疾病程度和當(dāng)?shù)乜色@得的資源，可能涉及化療、放療以及子宮切除手術(shù)等方式.

SN-38是伊立替康鹽酸鹽(CPT-11)的一種活性代謝物，能夠抑制DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶I及DNA合成，并且造成頻繁的DNA單鏈斷裂，是臨床上常用的治療腫瘤化療藥[4]. 已有研究表明：SN-38在具有不同轉(zhuǎn)移潛能的結(jié)腸癌細(xì)胞系中，能抑制細(xì)胞增殖及轉(zhuǎn)移,與自噬抑制劑氯喹聯(lián)合使用能夠顯著降低結(jié)腸癌細(xì)胞的活性[5-7]，并且能抑制胰腺癌、胃癌及三陰性乳腺癌進(jìn)展，增加患者存活率[8-10]. 此外，對(duì)宮頸癌細(xì)胞的研究[11]表明：SN-38可以通過p53途徑誘導(dǎo)HeLa和SiHa細(xì)胞凋亡，與順鉑或奈達(dá)鉑聯(lián)合使用情況下能達(dá)到很高的抗腫瘤功效，并對(duì)復(fù)發(fā)性宮頸癌患者也有一定程度的緩解[12-13]. 然而，在宮頸癌治療的過程中，患者對(duì)SN-38不敏感或在治療過程中產(chǎn)生耐藥性是造成復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、預(yù)后差的重要因素. 因此，研究宮頸癌化療耐藥的相關(guān)機(jī)制,對(duì)克服宮頸癌患者的不良預(yù)后以及延長患者生存期具有重要意義.

巨噬細(xì)胞(MΦ)在實(shí)體瘤中所占比例高達(dá)30%～50%，這也充分說明了巨噬細(xì)胞在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、侵襲以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮著重要作用. 此外，巨噬細(xì)胞還能夠抑制多種常規(guī)治療(包括化療、放療)的效果[14-15]. 越來越多的證據(jù)表明：巨噬細(xì)胞與宮頸癌化療耐藥及預(yù)后不良緊密相關(guān). 然而，巨噬細(xì)胞促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞抵抗SN-38的研究尚未報(bào)道. 本研究旨在探討腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞在宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38敏感性中的作用，為臨床宮頸癌治療提供新的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試劑

佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(phorbol 12-myristate 13-aceteat, PMA)(貨號(hào)：P1585；工作質(zhì)量濃度：20 ng/mL)，DMSO購買于Sigma公司；CCK8檢測(cè)試劑盒，胰蛋白酶消化液購買于Thermo Scientific公司；RNAiso Plus購買于TaKaRa公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverTra Ace qPCR RT Kit和SYBR Green購買于TOYOBO公司.

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人宮頸癌細(xì)胞系HeLa、CaSki、C-33A和SiHa(購于中科院上海細(xì)胞庫)置于含10%胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基中，THP-1置于含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，37 ℃、5%CO2、飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，經(jīng)檢測(cè)無支原體污染.

1.3 THP-1誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞

將1×106個(gè)人源單核細(xì)胞THP-1種于6孔板，每孔添加PMA使其終質(zhì)量濃度為20 ng/mL，培養(yǎng)72 h后去除未貼壁細(xì)胞，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞[16].

1.4 細(xì)胞增殖檢測(cè)

取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用胰酶消化后，按照每孔200 μL細(xì)胞懸液含10 000個(gè)細(xì)胞的密度接種于96孔板中. 細(xì)胞在37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待完全貼壁后(至少8 h)，每孔補(bǔ)加SN-38使其終質(zhì)量濃度分別為0、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL. 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)液和新鮮DMEM按照1∶1的比例添加到宮頸癌細(xì)胞中. 同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組(沒有細(xì)胞，僅有等體積培養(yǎng)基). 待細(xì)胞培養(yǎng)至24、48 h，按照CCK-8檢測(cè)試劑盒說明書步驟完成細(xì)胞增殖檢測(cè). 簡單的流程如下：試驗(yàn)中止前4 h加入CCK-8液20 μL，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，每隔1 h在酶聯(lián)檢測(cè)儀上檢測(cè)450 nm 波長下每孔的OD (Optical Density, OD)值，根據(jù)公式求出細(xì)胞活力. 細(xì)胞活力(Cell Viability)=[(試驗(yàn)組)-(空白對(duì)照組)]/[(對(duì)照組)-(空白對(duì)照組)][17].

1.5 熒光定量PCR

THP-1通過PMA刺激誘導(dǎo)分化為巨噬細(xì)胞. 將巨噬細(xì)胞與對(duì)SN-38相對(duì)不敏感的HeLa和SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)，通過熒光定量PCR檢測(cè)巨噬細(xì)胞中HLA-DR、CD80、CD206、CD163和ARG1的mRNA水平. 按照制造商的說明，用RNAiso Plus提取總RNA. 然后按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作步驟將獲取的總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA. 按照SYBR Green PCR試劑盒試驗(yàn)步驟在CFX ConnectTM實(shí)時(shí)系統(tǒng)上檢測(cè)HLA-DR、CD80、CD206、ARG1和CD163的表達(dá). 并根據(jù)2-△△Ct算法計(jì)算倍數(shù)變化.β-Actin作為內(nèi)參. 表1列出了用于PCR試驗(yàn)中使用的引物.

表1 引物的名稱和序列Table 1 The names and sequences of the primers

1.6 分析宮頸癌細(xì)胞系對(duì)藥物敏感性

通過在線軟件Genomics of Drug Sensitivity in Cancer (GDSC)(https://www.cancerrxgene.org/celllines)[18]，分析數(shù)據(jù)庫中8種宮頸癌細(xì)胞系對(duì)310多種化療藥或小分子靶向藥的敏感性. Dataset選擇GDSC1.

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，所有試驗(yàn)均獨(dú)立重復(fù)3次，計(jì)量資料采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，數(shù)據(jù)的比較分析采取student’t檢驗(yàn)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[19].

2 結(jié)果與分析

2.1 宮頸癌細(xì)胞系對(duì)化療藥的敏感性分析

為了評(píng)估不同宮頸癌細(xì)胞系對(duì)臨床化療藥的敏感性，通過GDSC在線軟件，分析了數(shù)據(jù)庫中所有宮頸癌細(xì)胞系(共8種，分別是HeLa、DoTc2-4510、CaSki、HT-3、CAL-39、C-33A、ME-180和SiHa)對(duì)310多種化療藥敏感性數(shù)據(jù). 結(jié)果如圖1所示，橫坐標(biāo)代表不同種類藥物，縱坐標(biāo)指示的是將各藥物的半抑制質(zhì)量濃度(IC50)值進(jìn)行Z分?jǐn)?shù)(Z-score)數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化后的值，藍(lán)色箭頭所指的是SN-38代表的數(shù)值點(diǎn). IC50Z-score越小，代表該藥物在這種癌細(xì)胞中的半抑制質(zhì)量濃度越低，即癌細(xì)胞對(duì)藥物越敏感. 從結(jié)果(圖1)可以看出：CaSki和C-33A細(xì)胞對(duì)大多數(shù)化療藥都具有很高的敏感性，而SiHa細(xì)胞對(duì)少數(shù)化療藥敏感.

2.2 宮頸癌細(xì)胞系對(duì)SN-38的敏感性分析

本研究通過分析以上8個(gè)細(xì)胞系和310多種藥物，發(fā)現(xiàn)SN-38在HeLa、CaSki、ME-180、HT-3、C-33A和SiHa細(xì)胞中的IC50Z-score都很小. IC50Z-score小于-1.5大于-2代表癌細(xì)胞對(duì)該藥物敏感，小于-2代表極敏感. 本研究(圖2)發(fā)現(xiàn)：CaSki、ME-180、HT-3、C-33A對(duì)SN-38都極為敏感. HeLa和SiHa這2種宮頸癌細(xì)胞系對(duì)SN-38敏感(圖2). 而CAL-39對(duì)SN-38最不敏感.

圖1 宮頸癌細(xì)胞系對(duì)化療藥的敏感性

圖2 宮頸癌細(xì)胞系對(duì)SN-38的敏感性

2.3 SN-38對(duì)宮頸癌細(xì)胞系增殖的影響

為了進(jìn)一步探討SN-38對(duì)不同類型宮頸癌細(xì)胞系增殖的影響，選取了HPV-18陽性HeLa細(xì)胞、HPV-16陽性SiHa和CaSki細(xì)胞，以及HPV陰性C-33A細(xì)胞作為研究的細(xì)胞模型，在0、0.1、0.2、0.4、0.8 μg/mL的SN-38作用細(xì)胞24、48 h后，完成CCK8試驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力(圖3). 結(jié)果顯示：在加入SN-38的24 h后(圖3A)，隨著藥物質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞活力逐漸減弱，除SiHa細(xì)胞在SN-38質(zhì)量濃度大于0.4 μg/mL才有顯著性差異外，HeLa、CaSki和C-33A細(xì)胞在SN-38質(zhì)量濃度大于0.2 μg/mL時(shí)就都具有顯著性差異；HeLa和SiHa細(xì)胞相對(duì)于CaSki及C-33A細(xì)胞對(duì)于SN-38有一定程度的抵抗性. 對(duì)SN-38在這4種宮頸癌細(xì)胞系的IC50分析(圖4)發(fā)現(xiàn)：HeLa和SiHa細(xì)胞的IC50明顯大于CaSki和C-33A細(xì)胞. 同樣，在加入SN-38的48 h后(圖3B)，細(xì)胞活力顯著減弱，HeLa和SiHa細(xì)胞相對(duì)于CaSki及C-33A細(xì)胞對(duì)SN-38具有較強(qiáng)的抵抗性，并且HeLa和SiHa細(xì)胞對(duì)于SN-38的IC50也明顯大于CaSki及C-33A細(xì)胞(圖4). 以上試驗(yàn)結(jié)果表明：CaSki和C-33A相對(duì)于HeLa和SiHa細(xì)胞對(duì)SN-38更敏感，與數(shù)據(jù)庫分析的結(jié)果一致.

圖3 HeLa、CaSki、C-33A和SiHa細(xì)胞加入SN-38 24 、48 h后的細(xì)胞活力

圖4 在HeLa、CaSki、C-33A和SiHa細(xì)胞加入SN-38 24、48 h的IC50

2.4 宮頸癌細(xì)胞系誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞成腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的研究

以上的研究結(jié)果表明宮頸癌細(xì)胞系對(duì)SN-38普遍比較敏感，然而SN-38在臨床上對(duì)宮頸癌病人的治療效果卻不是很理想，其中的原因尚不清楚. 已有報(bào)導(dǎo)[20]表明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞能夠普遍增強(qiáng)癌細(xì)胞對(duì)化療藥物的抵抗. 因此，本研究檢測(cè)是否腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38的抵抗. 圖5A顯示：與對(duì)照組相比，在巨噬細(xì)胞與HeLa細(xì)胞共培養(yǎng)后，巨噬細(xì)胞中促炎性相關(guān)基因HLA-DR和CD80的mRNA水平明顯下降，而抑炎性相關(guān)基因CD206、CD163和ARG1的mRNA水平顯著升高. 同樣，在巨噬細(xì)胞與SiHa細(xì)胞共培養(yǎng)后，能明顯下調(diào)巨噬細(xì)胞中HLA-DR和CD80的mRNA水平，上調(diào)CD206、CD163和ARG1的mRNA水平(圖5B). 以上結(jié)果說明，HeLa和SiHa細(xì)胞誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向M2型極化. M2型極化是腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞的一個(gè)重要的特征，以上結(jié)果表明HeLa和SiHa細(xì)胞成功誘導(dǎo)THP-1巨噬細(xì)胞成為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞.

圖5 宮頸癌細(xì)胞與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)48 h后巨噬細(xì)胞中HLA-DR、CD80、CD206、CD163和ARG1的 mRNA水平

2.5 腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞對(duì)宮頸癌細(xì)胞抵抗SN-38的影響

將THP1來源的巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)分化為M2型腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞之后，收集腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞上清液培養(yǎng)聯(lián)合SN-38處理相對(duì)不敏感的HeLa和SiHa細(xì)胞，通過CCK-8試驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞的增殖能力. 將腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)液作用HeLa細(xì)胞24、48 h后，細(xì)胞活力相對(duì)于對(duì)照組略有增加(圖6A)，但差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05). 在加入不同質(zhì)量濃度SN-38后，能顯著抑制HeLa細(xì)胞增殖，然而在添加腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)液組能夠顯著緩解SN-38對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用. 同樣，在SiHa細(xì)胞中也觀察到相同的結(jié)果. SN-38能夠顯著降低SiHa細(xì)胞活力，而腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞條件性培養(yǎng)液能夠在很大程度上減弱SN-38對(duì)SiHa細(xì)胞活力的抑制作用(圖6B). 以上結(jié)果說明腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38抵抗.

圖6 宮頸癌細(xì)胞經(jīng)巨噬細(xì)胞條件培養(yǎng)液(CM)處理，同時(shí)加入SN-38處理24、48 h后的細(xì)胞活力

3 討論

巨噬細(xì)胞主要參與腫瘤微環(huán)境中的炎癥反應(yīng)，根據(jù)其表型可分為M1型與M2型. M1型巨噬細(xì)胞表面會(huì)高表達(dá)HLA-DR、CD80和CD86，在腫瘤微環(huán)境釋放促炎性因子IL-6、IL-1β和TNF-α等，進(jìn)而將腫瘤細(xì)胞殺傷. M2型巨噬細(xì)胞會(huì)高表達(dá)ARG1、CD163和CD206等，可分泌免疫抑制因子IL-10、TGF-β、和VEGF等，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞生長、轉(zhuǎn)移、免疫抑制及化療抵抗[21]. 近年來，人們對(duì)宮頸癌中巨噬細(xì)胞的研究較多，并且臨床病理和試驗(yàn)研究均表明：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞在宮頸癌的進(jìn)展中起關(guān)鍵作用[22]. 本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞促進(jìn)了宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38的抵抗，因而靶向巨噬細(xì)胞及其與宮頸癌之間的聯(lián)系可以作為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)，但沒有深入探究機(jī)制. 因此，接下來需要進(jìn)一步去探索巨噬細(xì)胞促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞抵抗SN-38的分子機(jī)制.

PI3K/Akt信號(hào)通路在宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲的過程中起著重要作用[23]. 一些抗腫瘤藥物的使用能明顯抑制宮頸癌細(xì)胞PI3K/Akt信號(hào)進(jìn)而阻滯細(xì)胞周期，觸發(fā)細(xì)胞凋亡[24]. 在宮頸癌細(xì)胞系已表明：SN-38下調(diào)了p-Akt的蛋白表達(dá)，并上調(diào)了p53和p21的蛋白表達(dá). 將Akt在宮頸癌細(xì)胞系中過表達(dá)會(huì)導(dǎo)致SN-38誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡明顯減少，這表明Akt信號(hào)在宮頸癌抵抗SN-38的過程中起重要作用[11]. 研究表明：腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞促進(jìn)腫瘤抵抗化療過程，會(huì)分泌14-3-3ζ蛋白，可激活胰腺癌中Akt信號(hào)，促進(jìn)胰腺癌化學(xué)耐藥性[25]. 在乳腺癌中研究發(fā)現(xiàn)：腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞分泌CCL2，通過激活乳腺癌中PI3K/Akt/mTOR信號(hào)誘導(dǎo)他莫昔芬耐藥[26]. 另外，巨噬細(xì)胞分泌的CCL12激活PI3K/Akt信號(hào)賦予大腸癌對(duì)5-氟尿嘧啶抗性[27]. 這些結(jié)果表明巨噬細(xì)胞很可能是通過增強(qiáng)了宮頸癌細(xì)胞中的Akt信號(hào)降低其對(duì)SN-38的敏感性.

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)CaSki、ME-180、HT-3、C-33A對(duì)SN-38都極敏感，HeLa和SiHa對(duì)SN-38敏感，而CAL-39對(duì)SN-38不敏感. 巨噬細(xì)胞顯著抑制HeLa和SiHa宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38的敏感性. 總之，本研究發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞能夠降低宮頸癌細(xì)胞對(duì)SN-38的敏感性.