申水瑩，閆若潛，雷從從，王淑娟，馬震原，劉 影，趙雪麗，謝彩華，吳志明

(1 河南農(nóng)業(yè)大學(xué) 牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；2 河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心，河南 鄭州450008；3 西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌 712100；4 河南省獸藥飼料監(jiān)察所，河南 鄭州 450002)

A型塞內(nèi)卡病毒(SVA)可引起豬原發(fā)性水皰病，即塞內(nèi)卡病毒病。SVA感染初期，病豬出現(xiàn)精神萎靡、進(jìn)食困難、體溫升高等癥狀，隨后鼻、舌和蹄冠等部位出現(xiàn)水皰樣病變，嚴(yán)重時(shí)會(huì)蔓延至蹄底部，使病豬出現(xiàn)跛行的癥狀[1]。母豬感染SVA后雖然死亡率極低，但其發(fā)病率可達(dá)90%，會(huì)造成產(chǎn)奶減少甚至停止、餓死乳豬等生產(chǎn)性能上的危害。1～3日齡新生仔豬感染SVA后體態(tài)瘦弱，貪睡，不愿進(jìn)食，死亡率可達(dá) 30%～70%[2-3]，給養(yǎng)豬行業(yè)帶來了巨大的潛在隱患。首例SVA毒株(SVV-001)于2002年由美國(guó)科研人員從細(xì)胞培養(yǎng)基污染物中發(fā)現(xiàn)并分離得到[4-5]；2002-2013年，SVA主要在美國(guó)和加拿大呈零星發(fā)生；2014-2016年，巴西、哥倫比亞和泰國(guó)均發(fā)現(xiàn)了豬SVA感染[6-9]。2015-2017年，塞內(nèi)卡病毒病在我國(guó)廣東、福建、遼寧、湖北、河南、黑龍江等地相繼確診[10-12]，目前國(guó)內(nèi)尚無針對(duì)SVA的商品化疫苗，也無特效的治療方法，一旦SVA大面積爆發(fā)必然給養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)帶來極大的影響。

SVA為單股、正鏈、RNA病毒[13]，屬塞內(nèi)卡病毒屬Senecavirus)，與心病毒屬(Cardiovirus)成員的親緣關(guān)系較近[4,14-15]。SVA基因組含有7 280個(gè)核苷酸，包括666個(gè)核苷酸的非編碼區(qū)和一個(gè)包含6 543個(gè)核苷酸的開放閱讀框。SVA有4種衣殼蛋白：VP1、VP2、VP3和VP4[16]，其中VP1、VP2和VP3位于蛋白衣殼的外部，VP4位于蛋白衣殼的內(nèi)部[17]，且VP1和VP3是主要的抗原表位區(qū)域，可刺激機(jī)體產(chǎn)生中和抗體[4,18]。Maggioli等[19]研究發(fā)現(xiàn)，在SVA感染的急性期，機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是抗VP2和VP3的特異性IgM；在康復(fù)期，機(jī)體產(chǎn)生的抗體主要是抗VP1、VP2、VP3 的特異性IgM和IgG[6]，說明VP3蛋白在感染早期就能產(chǎn)生中和抗體，可作為塞內(nèi)卡病毒病早期檢測(cè)的靶標(biāo)抗體。

豬感染SVA的癥狀與口蹄疫、水泡性口炎和水皰性疹等水泡類疾病的癥狀十分相似，臨床上難以區(qū)分[1]，國(guó)內(nèi)對(duì)SVA的檢測(cè)主要以RT-PCR為主，但ELISA方法既能達(dá)到與病毒中和試驗(yàn)、間接免疫熒光等方法高度一致，又可實(shí)現(xiàn)SVA的快速、簡(jiǎn)便、敏感的診斷要求，可用于大規(guī)模的流行病學(xué)研究或監(jiān)測(cè)[20]。本課題組已建立了基于VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法[21]，本試驗(yàn)旨在進(jìn)一步建立基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法，比較基于不同蛋白建立的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的差異，為SVA感染的臨床診斷檢測(cè)及未來疫苗免疫效果評(píng)價(jià)提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 病毒與血清 SVA毒株及87份SVA陰性豬血清(采自健康豬，SVA熒光PCR檢測(cè)陰性)、113份SVA陽性血清(采自SVA滅活疫苗免疫的豬，病毒中和試驗(yàn)檢測(cè)陽性)和160份豬血清(20頭SVA滅活疫苗免疫豬免疫后第14，21，28，35，42，49，56，63天的血清)，均由河南省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心提供。O型和A型口蹄疫病毒 (FMDV)陽性血清，為蘭州獸醫(yī)研究所生產(chǎn)的阻斷ELISA檢測(cè)試劑盒中所配備。豬偽狂犬病毒(PRV) 、豬繁殖與呼吸障礙綜合征病毒(PRRSV)和豬瘟病毒(CSFV)陽性血清，均為美國(guó)愛德士(IDEXX)公司生產(chǎn)的ELISA檢測(cè)試劑盒中所配備。

1.1.2 主要儀器和試劑 洗板機(jī)，瑞士Tecan Austria GmbH公司產(chǎn)品；BioTek-ELx808酶標(biāo)儀，美國(guó)伯騰公司產(chǎn)品；蛋白超濾離心管，購(gòu)于Millipore公司。病毒DNA/RNA提取試劑盒(CDC)，購(gòu)于西安天隆科技有限公司；5×PrimeScript RT Master Mix、Agarose Gel DNA Extraction Kit、Plasmid Purification Kit，購(gòu)于TaKaRa公司；BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒，購(gòu)于碧云天生物技術(shù)公司；pGEM-T Easy Vector，購(gòu)于Promega公司；JM109、BL21 (DE3)，購(gòu)于康為世紀(jì)生物科技有限公司；pQE-30，購(gòu)于優(yōu)寶生物公司；T4連接酶、BamH Ⅰ和SacⅠ限制性內(nèi)切酶、TaqDNA 聚合酶，購(gòu)于寶生物工程(大連)有限公司；10×PBST、TMB單組份顯色液、Western Blot試劑盒，購(gòu)于Solarbio公司；山羊抗豬HRP-IgG(H+L)，購(gòu)于Proteintech公司；包涵體蛋白溶解及復(fù)性試劑盒，購(gòu)于天恩澤生物科技公司。

1.2 SVA VP3基因的擴(kuò)增及重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

參照GenBank中登錄的SVAVP3基因序列(GenBank登錄號(hào)為：MN885796)，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，P1：5′-TCAGGATCCCTGAACGCGAGAACCTCTAC-3′，下劃線部分為插入的BamH Ⅰ酶切位點(diǎn)；P2：5′-TCAGAGCTCCAAGCCTATGTCCCAAATAGA-3′，下劃線部分為插入的SacⅠ酶切位點(diǎn)。引物由英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司合成，預(yù)期擴(kuò)增出的目的片段長(zhǎng)度為717 bp。

使用病毒DNA/RNA提取試劑盒(CDC)提取SVA的總RNA，用5×PrimeScript RT Master Mix將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，備用。以合成的cDNA為模板PCR擴(kuò)增VP3基因，設(shè)以ddH2O代替模板的處理為陰性對(duì)照。PCR反應(yīng)體系為：Premix Taq 12.5 μL，ddH2O 8.5 μL，上下游引物各0.5 μL，c-DNA模板3 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃ 45 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min，4 ℃停止。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳后使用Agarose Gel DNA Extraction Kit回收目的片段。

將VP3基因與pGEM-T Easy載體連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒rT-VP3，進(jìn)行藍(lán)白斑試驗(yàn)篩選。對(duì)篩選出的陽性重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR和測(cè)序鑒定，設(shè)以ddH2O代替模板的處理為陰性對(duì)照。將鑒定正確的重組質(zhì)粒和pQE-30載體進(jìn)行BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切，回收兩者的目的片段，用T4連接酶在4 ℃條件下過夜連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒rpQE30-VP3。將rpQE30-VP3轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR及BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定，將鑒定正確的重組質(zhì)粒送英濰捷基(上海)貿(mào)易有限公司測(cè)序。

1.3 重組VP3(rVP3)蛋白的表達(dá)、純化及抗原性鑒定

選取鑒定過的陽性菌落，1∶100接種到LB(含氨芐青霉素100 μg/mL)培養(yǎng)液，在37 ℃下180 r/min培養(yǎng)約2 h，測(cè)定600 nm處吸光值(OD600)為0.5～0.6時(shí)(即達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期)，加入IPTG使終濃度為0.3 mmol/L，誘導(dǎo)6 h。取1 mL菌液4 ℃下8 000 r/min離心5 min，取沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，觀察rVP3蛋白是否表達(dá)。將菌液于4 ℃下8 000 r/min離心30 min，收集菌體，于-80 ℃凍融后用裂解液重懸，超聲波裂解(功率320 W，工作3 s間歇7 s，重復(fù)至菌體完全破碎)，4 ℃下8 000 r/min離心30 min，收集上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳，分析rVP3蛋白是否可溶性表達(dá)。按照包涵體蛋白溶解及復(fù)性試劑盒說明書對(duì)包涵體溶解、洗滌及復(fù)性，之后用10 K蛋白超濾管5 000 r/min離心20 min進(jìn)行濃縮，按照BCA蛋白質(zhì)量濃度測(cè)定試劑盒說明書測(cè)定濃縮后蛋白的質(zhì)量濃度。

采用Western Blot法鑒定rVP3蛋白的抗原特異性。將經(jīng)過SDS-PAGE鑒定的樣品重新進(jìn)行SDS-PAGE，同時(shí)設(shè)置pQE-30轉(zhuǎn)化的產(chǎn)物為陰性對(duì)照，然后電轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜(NC膜)。將NC膜置于封閉液(含50 g/L脫脂奶粉的PBST)中，4 ℃封閉過夜。將NC膜取出后用PBST洗膜3次，每次5 min；加入滅活的SVA陽性血清(1∶200稀釋)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；加入山羊抗豬 HRP-IgG(H+L)(1∶5 000稀釋)37 ℃孵育1 h，PBST洗膜3次，每次5 min；用ECL底物顯色試劑盒顯色。

1.4 間接ELISA方法工作條件的優(yōu)化

采用矩陣法，分別對(duì)包被液[pH 7.2的PBS、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液(CB)]、純化的rVP3蛋白包被濃度(1，2，4 μg/mL)、封閉液(10 g/L BSA、50 g/L脫脂奶粉和5 g/L Casein)、封閉條件(37 ℃下2 h、4 ℃過夜)、樣品稀釋倍數(shù)(1∶25，1∶50，1∶100，1∶200)、TMB室溫下作用時(shí)間(5，10，15 min)、山羊抗豬 HRP-IgG(H+L)稀釋倍數(shù)(1∶2 500，1∶5 000，1∶7 500)和作用時(shí)間 (15，30，60 min)等條件進(jìn)行優(yōu)化。

1.5 間接ELISA方法臨界值的確定

采用上述最優(yōu)條件檢測(cè)SVA陽性對(duì)照(經(jīng)3次重復(fù)檢測(cè)確定P值)和200份臨床豬血清樣品(87份SVA陰性豬血清和113份SVA陽性血清)。采用SPSS 16.0軟件對(duì)200份血清樣品在450 nm處的吸光值(OD450)進(jìn)行分析。以敏感性為縱坐標(biāo)，1-特異性為橫坐標(biāo)，使用非參數(shù)構(gòu)建受試者工作特征曲線(ROC)，以Youden指數(shù)(敏感性-(1-特異性))最大點(diǎn)作為陰陽性判斷的臨界點(diǎn)，確定間接ELISA方法的判定標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 間接ELISA方法的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測(cè)

1.6.1 特異性 采用已建立的間接ELISA方法分別對(duì)SVA陰性血清、SVA陽性血清以及FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV陽性血清進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)設(shè)置SVA陽性對(duì)照，重復(fù)3次，分析該方法的特異性。

1.6.2 敏感性 隨機(jī)選取SVA陽性血清10份，進(jìn)行病毒中和試驗(yàn)；同時(shí)，對(duì)血清進(jìn)行2倍倍比稀釋(1∶2，1∶4，1∶8，…，1∶512)后，采用已建立的間接ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，分析該方法的敏感性。

1.6.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性 隨機(jī)選取SVA陰性、陽性血清共10份。用3個(gè)批次rVP3蛋白包被的ELISA反應(yīng)板進(jìn)行檢測(cè)；同時(shí)，采用同一批次rVP3蛋白包被的ELISA反應(yīng)板，分別在3個(gè)不同的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。上述試驗(yàn)每份血清平行重復(fù)3次，測(cè)定OD450值。3次平行重復(fù)結(jié)果取其平均值，計(jì)算批內(nèi)和批間的變異系數(shù)(CV)，分析該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

1.7 血清樣品的檢測(cè)

分別采用本試驗(yàn)建立的方法和課題組已建立的基于VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法[21],對(duì)SVA滅活疫苗免疫豬不同時(shí)期的160份血清進(jìn)行檢測(cè)，以SVA陰、陽性血清為對(duì)照，計(jì)算SVA抗體陽性率，分析兩方法間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 SVA VP3基因的擴(kuò)增及rpQE30-VP3的構(gòu)建

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果顯示，在717 bp處獲得一條特異性片段(圖1-A)。篩選出的陽性重組質(zhì)粒rT-VP3經(jīng)PCR擴(kuò)增，獲得一條717 bp的特異性條帶(圖1-B)；測(cè)序結(jié)果證實(shí)，rT-VP3構(gòu)建成功。構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒rpQE30-VP3經(jīng)PCR鑒定后，獲得一條717 bp的特異性PCR擴(kuò)增條帶(圖1-C)，BamH Ⅰ和SacⅠ雙酶切鑒定獲得了3 461和717 bp的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符(圖1-D)。經(jīng)測(cè)序?qū)Ρ确治?結(jié)果顯示目的序列無堿基插入、突變或缺失，表明重組質(zhì)粒rpQE30-VP3構(gòu)建成功。

A.VP3基因PCR擴(kuò)增結(jié)果；B.rT-VP3質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果；C.rpQE30-VP3質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果；D.rpQE30-VP3質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果。M.DNA Marker；1，3.陰性對(duì)照；2.VP3基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；4.rT-VP3質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；5～6.rpQE30-VP3質(zhì)粒PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；7～8.rpQE30-VP3質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物A.PCR amplification results of VP3;B.PCR amplification results of rT-VP3;C.PCR amplification results of rpQE30-VP3;D.Identification of rpQE30-VP3 plasmid digested.M.DNA Marker;1,3.Negative control;2.PCR amplification products of VP3;4.PCR amplification products of rT-VP3;5-6.PCR amplification products of rpQE30-VP3;7-8.Enzyme-digested product of rpQE30-VP3圖1 SVA VP3基因及rT-VP3質(zhì)粒和rpQE30-VP3質(zhì)粒的鑒定結(jié)果Fig.1 Identification of SVA VP3 gene,rT-VP3 plasmid and rpQE30-VP3 plasmid

2.2 rVP3蛋白的表達(dá)、純化及抗原性鑒定

rpQE30-VP3經(jīng)IPTG誘導(dǎo)，表達(dá)出32 ku的rVP3蛋白(圖2-A)。誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)超聲破碎后離心，取沉淀和上清進(jìn)行SDS-PAGE鑒定，結(jié)果顯示目的蛋白主要存在于沉淀中，表明rVP3以包涵體的形式表達(dá)。純化的rVP3蛋白分子質(zhì)量約32 ku(圖2-B)。經(jīng)Western Blot鑒定約32 ku處有特異性條帶(圖2-C)，表明rVP3蛋白能與SVA陽性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，具有較好的反應(yīng)原性。經(jīng)BCA試劑盒檢測(cè)，該蛋白的質(zhì)量濃度為1.54 mg/mL。

A.rVP3蛋白SDS-PAGE；B.rVP3蛋白純化后SDS-PAGE；C.rVP3蛋白Western Blot。M.蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)分子量；1，6.pQE-30空載體誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)照；2.未誘導(dǎo)的rVP3蛋白；3.IPTG誘導(dǎo)的rVP3蛋白；4，5，7.純化后的rVP3蛋白A.The SDS-PAGE results of rVP3;B.The SDS-PAGE results of purified rVP3;C.The Western Blot of purified rVP3.M.Protein Marker；1,6.Induction of pQE-30 empty vector；2.Uninduction of rpQE-30-VP3；3.Induction of rpQE-30-VP3；4，5,7.Purification of rpQE-30-VP3圖2 rVP3蛋白的表達(dá)、純化及抗原性分析Fig.2 Expression,purification and antigenicity analysis of rVP3 protein

2.3 間接ELISA方法最佳工作條件的優(yōu)化

矩陣法試驗(yàn)結(jié)果顯示，間接ELISA的最佳工作條件為：抗原2 μg/mL，碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)在4 ℃下包被14～16 h，5 g/L Casein在4 ℃下封閉14～16 h，1∶100稀釋樣品在37 ℃下反應(yīng)1 h，1∶5 000稀釋山羊抗豬HRP-IgG(H+L)在37 ℃下反應(yīng)30 min，TMB在室溫避光條件下反應(yīng)10 min。

2.4 間接ELISA方法的判定標(biāo)準(zhǔn)

利用SPSS 16.0軟件對(duì)200份血清樣品的OD450檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析，繪制的ROC曲線見圖3。結(jié)果顯示，SPSS 16.0軟件數(shù)據(jù)分析Youden指數(shù)最大時(shí)所對(duì)應(yīng)的OD450值，即臨界OD450為0.276，3次重復(fù)測(cè)定陽性對(duì)照的OD450為2.0。臨界OD450/陽性對(duì)照OD450= 0.138，因此，本方法的判定標(biāo)準(zhǔn)定為：樣本OD450(S)/陽性對(duì)照OD450(P)>0.138為SVA抗體陽性，反之則為陰性。

圖3 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的ROC曲線Fig.3 ROC curve of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5 間接ELISA方法的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性

2.5.1 特異性 特異性檢測(cè)結(jié)果(表1)顯示，rVP3蛋白與FMDV(O/A型)、PRV、PRRSV、CSFV病原陽性血清均為陰性(S/P≤0.138)，僅能與SVA陽性血清發(fā)生反應(yīng)，表明本檢測(cè)方法特異性較好。

表1 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的特異性Table 1 Specificity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.2 敏感性 敏感性檢測(cè)結(jié)果(表2)顯示，有6份血清樣品的結(jié)果與中和試驗(yàn)一致，4份樣品最高稀釋度倍數(shù)比中和試驗(yàn)僅低1個(gè)稀釋度。病毒中和試驗(yàn)?zāi)軌驒z測(cè)出的平均最高稀釋度為1∶150.4，而本方法能夠檢測(cè)出的平均最高稀釋度為1∶113.6。結(jié)果表明，本研究建立的間接ELISA檢測(cè)方法雖比中和試驗(yàn)結(jié)果略低，但依舊有較好的敏感性。

表2 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的敏感性Table 2 Sensitivity of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.5.3 重復(fù)性和穩(wěn)定性 將選取的10份豬血清分別進(jìn)行批內(nèi)和批間重復(fù)性檢測(cè)，其變異系數(shù)(CV)分別為1.0%～3.8%和3.0%～8.0%，批內(nèi)小于4%，批間小于9%(表3)，表明該檢測(cè)方法重復(fù)性和穩(wěn)定性較好。

表3 基于VP3蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的重復(fù)性Table 3 Repeatability of SVA indirect ELISA method based on VP3 protein

2.6 基于VP3，VP1蛋白的SVA間接ELISA法免疫血清檢測(cè)結(jié)果比較

采用兩種方法對(duì)SVA滅活疫苗免疫豬不同時(shí)期的160份血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，在免疫后的第14，21，28，35，42，49，56和63天，VP1抗體的陽性率分別為30.00%，70.00%，90.00%，100.00%，90.00%，90.00%，85.00%和80.00%；VP3抗體的陽性率分別為35.00%，70.00%，80.00%，100.00%，90.00%，100.00%，95.00%和95.00%(圖4)，表明兩種方法均能在不同時(shí)期檢測(cè)出抗體，但抗體陽性檢出率略有差異。

圖4 基于VP3、VP1蛋白的SVA間接ELISA檢測(cè)方法的檢測(cè)結(jié)果對(duì)比Fig.4 Comparison of detection effects of indirect ELISA based on VP3 and VP1 protein

3 討 論

2015年初，我國(guó)與SVA相關(guān)的水皰病暴發(fā)并開始增多，且與新生仔豬死亡率的升高密切相關(guān)[5,22]。2015年我國(guó)廣東、福建、河南、湖北[23-24]等地陸續(xù)檢出SVA，隱性感染率極高，給我國(guó)養(yǎng)豬行業(yè)帶來了潛在的危害。SVA與其他水皰病在臨床癥狀上難以區(qū)分，還需要依靠實(shí)驗(yàn)室診斷技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)外尚無SVA疫苗的應(yīng)用，ELISA檢測(cè)出抗體陽性即為感染。而間接ELISA方法具有敏感度高、特異性強(qiáng)、重復(fù)性和穩(wěn)定性好以及成本低、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，適用于基層的檢測(cè)。目前，已有針對(duì)VP1和VP2蛋白建立的間接ELISA抗體檢測(cè)方法[21,25-26]，但市場(chǎng)上仍缺少商品化可用試劑盒。本研究以VP3蛋白作為包被抗原，建立了檢測(cè)SVA抗體的間接ELISA方法。本方法與常發(fā)豬病毒病陽性豬血清無交叉反應(yīng)，對(duì)檢測(cè)SVA陽性血清具有特異性；陽性血清檢測(cè)結(jié)果與中和試驗(yàn)基本一致，具有良好的敏感性；批內(nèi)和批間的變異系數(shù)均在9%以內(nèi)，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。為臨床血清SVA抗體檢測(cè)提供了成本低、操作簡(jiǎn)單的技術(shù)手段，同時(shí)也為不同蛋白所建立的間接ELISA方法的對(duì)比奠定了基礎(chǔ)。評(píng)估本研究方法的敏感性時(shí)發(fā)現(xiàn)，其敏感性略低于中和試驗(yàn)，可能是中和試驗(yàn)檢測(cè)所有的中和抗體，而本方法檢測(cè)的是VP3單一蛋白的IgG抗體[6]，因而兩種試驗(yàn)會(huì)產(chǎn)生一定差別，但是本研究建立的間接ELISA方法仍具有較高的敏感性。

采用本研究建立的基于VP3蛋白的間接ELISA方法和本實(shí)驗(yàn)室已建立的基于VP1蛋白的間接ELISA方法，分別對(duì)SVA滅活疫苗免疫豬不同時(shí)期的160份血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示，兩種方法均能在不同時(shí)期檢測(cè)出抗體，但抗體陽性檢出率略有差異，免疫后第14天到第35天，VP1較VP3檢測(cè)出的抗體陽性率略高；從第42天至第63天，VP3比VP1檢測(cè)出的抗體陽性率略高。目前本實(shí)驗(yàn)室正在進(jìn)行VP2蛋白間接ELISA方法的建立，以期進(jìn)行不同抗體水平的檢測(cè)。